連續(xù)流動分析法測定淡水中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮的研究

李亞 李會蘭 李恒亮 朱吉東* 譚彥飛

（1.云南省生態(tài)環(huán)境廳駐文山州生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，云南 文山 663099；2.昆明市生態(tài)環(huán)境局石林分局生態(tài)環(huán)境監(jiān)測站，云南 昆明 650000）

1 引言

亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮通常稱之為“四氮”，是水質(zhì)監(jiān)測中幾種常見的污染物，是環(huán)境監(jiān)測中常規(guī)監(jiān)測項目，也是評價水體受營養(yǎng)物質(zhì)污染程度的重要指標(biāo)之一，其測定結(jié)果有助于評價水體被污染和自凈狀況。高濃度的亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮對水生生物有直接毒害作用，同時會引起水體富營養(yǎng)化，從而導(dǎo)致浮游生物急劇增殖，甚至可導(dǎo)致“赤潮”“水華”等災(zāi)害［1－3］。“十四五”時期是控制污染物排放增量，實現(xiàn)總量減排及改善生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的關(guān)鍵時期，國家向各省（區(qū)、市）下達(dá)主要污染物總量控制指標(biāo)中就包括氮氧化物、氨氮2 個指標(biāo)，因此研究“四氮”的測定方法對水環(huán)境監(jiān)測具有重要的意義。

2 “四氮”的測定方法

氮氧化物污染中包括亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮，氨氮是水體中的主要耗氧污染物，對魚類及某些水生生物有毒害作用，在一定條件下氨氮可轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，水中的亞硝酸鹽會進(jìn)一步和人體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合形成亞硝胺，亞硝胺是“三致”物質(zhì)，屬強致癌物質(zhì)，如果長期飲用含亞硝酸鹽的水，對人體健康極為不利。如果長期飲用硝態(tài)氮（NO3－N）含量超過10 mg/L 的水，則會發(fā)生高鐵血紅蛋白病癥，如果血液中高鐵血紅蛋白含量達(dá)到70 mg/L 及以上，將危及人的生命健康，即發(fā)生窒息現(xiàn)象。亞硝酸鹽氮是氮循環(huán)的中間產(chǎn)物；硝酸鹽氮是以“NO3”形式存在的氮，水體中的硝酸鹽氮是含氮有機物經(jīng)無機化作用的最終分解產(chǎn)物；氨氮是指以氨或銨離子形式存在的化合氮，也是水中的一種營養(yǎng)物質(zhì)；總氮是指水中各種形態(tài)的有機和無機氮的總量，包括亞硝酸鹽、硝酸鹽、氨氮等無機氮和蛋白質(zhì)、氨基酸和有機胺等有機氮。水中“四氮”的測定對氮元素生物地球化學(xué)循環(huán)、人類賴以生存的生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的研究具有重要意義，如何快速精準(zhǔn)地測定亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮也是環(huán)境工作者研究的熱點之一。

目前測定水中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮最常用的方法是分光光度法、離子色譜法［4］；測定水中氨氮最常用的方法為納氏試劑分光光度法；測定總氮最常用的方法為過硫酸鉀—紫外分光光度法。而分光光度法檢出限低，分析速度慢，操作步驟繁瑣耗時，又耗費化學(xué)試劑，不能滿足批量樣品的快速測定要求，且顯色劑有毒［5］；離子色譜法分析速度較慢，定性能力較差；過硫酸鉀—紫外分光光度法采用高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行消解，耗時較長，而且重復(fù)性及準(zhǔn)確性較差［6］；納氏試劑分光光度法中納氏試劑毒性大，并且測量結(jié)果易受到水中懸浮物、余氯、鈣鎂等金屬離子、硫化物和有機物的干擾，若存在上述干擾因子時，需要將水樣進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理后才能進(jìn)行氨氮的分析工作［7］。

AA3 型連續(xù)流動分析儀（Continuous Flow Analyzer，CFA）是一種現(xiàn)代濕化學(xué)分析儀，可以分析大部分類型的液體樣品［8］。該系統(tǒng)主要由全自動進(jìn)樣器、高精度蠕動泵、化學(xué)反應(yīng)模塊及數(shù)字比色計組成，采用空氣片段連續(xù)流動分析技術(shù)，樣品和試劑在一個連續(xù)流動的系統(tǒng)中均勻混合并發(fā)生反應(yīng)，生成的有色化合物經(jīng)過檢測器比色，最后將比色信號輸入電腦，軟件進(jìn)行自動分析的控制和計算。這種分析方法不僅速度快，節(jié)省人力、物力，而且精密度高，對環(huán)境污染小。

使用AA3 型連續(xù)流動分析儀測定水樣的亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮等已有相關(guān)研究［9－11］，但使用AA3 型連續(xù)流動分析儀同時測定亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮的相關(guān)研究還不多見。本文利用連續(xù)流動分析儀分光光度法同時測定水中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮，并對其檢出限、精密度、準(zhǔn)確度、加標(biāo)回收率進(jìn)行分析討論，檢驗該方法的準(zhǔn)確性、精確度、快速性等，為含氮化合物的水質(zhì)監(jiān)測工作提供參考。

3 原理

3.1 連續(xù)流動分析儀工作原理

試樣與試劑在蠕動泵的推動下進(jìn)入化學(xué)反應(yīng)模塊，在密閉的管路中連續(xù)流動，被氣泡按一定間隔規(guī)律地隔開，并按特定的順序和比例混合、反應(yīng)，顯色完全后進(jìn)入流動檢測池進(jìn)行光度監(jiān)測。

3.2 化學(xué)反應(yīng)原理

3.2.1 亞硝酸鹽氮反應(yīng)原理

在堿性介質(zhì)中，試料中的亞硝酸鹽和對氨基苯磺酰胺及N－（1－萘基）乙二胺二鹽酸鹽反應(yīng)生成粉紅色化合物，于550 nm 波長處測量吸光度。

3.2.2 硝酸鹽氮反應(yīng)原理

在堿性介質(zhì)中，試料中的硝酸鹽在銅的催化作用下，被硫酸肼及硫酸聯(lián)氨還原成亞硝酸鹽，并和對氨基苯磺酰胺及N－（1－萘基）乙二胺二鹽酸鹽反應(yīng)生成粉紅色化合物，于550 nm 波長處測量吸光度。

3.2.3 氨氮反應(yīng)原理

在堿性介質(zhì)中，試料中的氨、銨離子與二氯異氰脲酸鈉溶液釋放出來的次氯酸根反應(yīng)生成氯胺。在40 ℃和亞硝基鐵氰化鉀存在條件下，氯胺與水楊酸鹽反應(yīng)形成藍(lán)綠色化合物，于660 nm 處測量吸光度。

3.2.4 總氮反應(yīng)原理

在堿性介質(zhì)中，試料中的含氮化合物在107～110 ℃、紫外線照射下，被過硫酸鹽氧化為硝酸鹽后，硝酸鹽被硫酸肼硫酸聯(lián)氨還原成亞硝酸鹽。在酸性介質(zhì)中，亞硝酸鹽與磺胺進(jìn)行重氮化反應(yīng)，然后與鹽酸萘乙二胺偶聯(lián)生成紫紅色化合物，于波長540 nm處測量吸光度。

4 實驗部分

4.1 主要儀器

德國SEAL Analytical 公司生產(chǎn)的AA3 連續(xù)流動分析儀（含在線消解模塊）、ULUP－Ⅲ－20T 型優(yōu)普超純水機

4.2 試劑

所用試劑除另有注明外，均為符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純化學(xué)試劑；實驗用水為新制備的去離子水，標(biāo)準(zhǔn)樣品均購于生態(tài)環(huán)境部環(huán)境發(fā)展中心環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所。

4.2.1 亞硝酸鹽氮試劑

潤滑劑：取聚氧乙烯月桂醚（Brij－35）20 g 溶于去離子水中，稀釋到100 mL。

顯色劑：取磺胺5 g、N－（1－萘基）乙二胺二鹽酸鹽（NEDD）0.25 g、磷酸50 mL，去離子水稀釋到500 mL。

氫氧化鈉溶液（NaOH）：取氫氧化鈉10 g、磷酸3 mL、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去離子水稀釋到1 000 mL。

4.2.2 硝酸鹽氮試劑

潤滑劑：取Brij－35 20 g 溶于去離子水中，稀釋到100 mL。

顯色劑：取磺胺5 g、N－（1－萘基）乙二胺二鹽酸鹽0.25 g、磷酸50 mL，去離子水稀釋到500 mL。

氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉10 g、磷酸3 mL、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去離子水稀釋到1 000 mL。

硫酸銅儲備液：取硫酸銅0.1 g，去離子水稀釋到100 mL。

硫酸鋅儲備液：取硫酸鋅1 g，去離子水稀釋到100 mL。

硫酸聯(lián)氨溶液：取硫酸銅儲備液10 mL、硫酸鋅儲備液10 mL、硫酸聯(lián)氨2 g，去離子水稀釋到1 000 mL。

4.2.3 氨氮試劑

潤滑劑：取Brij－35 20 g 溶于去離子水中，稀釋到100 mL。

緩沖溶液：取檸檬酸三鈉20 g、Brij－35 溶液（20%）1 mL，去離子水稀釋到500 mL。

水楊酸鈉：取水楊酸鈉20 g、亞硝基鐵氰化鈉0.5 g，去離子水稀釋到500 mL。

二氯異氰尿酸鈉溶液（DIC）：取氫氧化鈉10 g、二氯異氰尿酸鈉1.5 g，去離子水稀釋到500 mL。

4.2.4 總氮試劑

潤滑劑：取Brij－35 20 g 溶于去離子水中，稀釋到100 mL。

消解溶液：取四硼酸鈉14 g、氫氧化鈉3 g、過硫酸鉀7 g，去離子水稀釋到1 000 mL。

顯色劑：取磺胺10 g、鹽酸150 mL、N－（1－萘基）乙二胺二鹽酸鹽0.5 g，去離子水稀釋到1 000 mL。

硫酸銅儲備液：取硫酸銅0.1 g，去離子水稀釋到100 mL。

硫酸鋅儲備液：取硫酸鋅1 g，去離子水稀釋到100 mL。

硫酸聯(lián)氨溶液：取硫酸銅儲備液10 mL、硫酸鋅儲備液10 mL、硫酸聯(lián)氨2 g，去離子水稀釋到1 000 mL。

氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉11.5 g、焦磷酸鈉7 g，用去離子水稀釋到1 000 mL，加入Brij－35 溶液（20%）2 mL。

5 結(jié)果與討論

5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

AA3 連續(xù)流動分析儀以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)、峰高數(shù)值信號為縱坐標(biāo)，做線性擬合y＝b×x＋a，得出曲線方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與相關(guān)系數(shù)

“四氮”工作曲線見圖1。由圖1 可知，亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)系數(shù)，相關(guān)系數(shù)r≥0.999，滿足標(biāo)準(zhǔn)方法要求［12］。

圖1 “四氮”工作曲線

5.2 檢出限

按照HJ 168—2020《環(huán)境監(jiān)測分析方法標(biāo)準(zhǔn)制訂技術(shù)導(dǎo)則》［12］的規(guī)定，對濃度為0.01 mg/L 亞硝酸鹽氮、0.02 mg/L 硝酸鹽氮、0.05 mg/L 氨氮、0.1 mg/L總氮，分別重復(fù)測定7 次，并計算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，按下面公式計算該方法的檢出限：

式中，MDL 表示方法檢出限；n 表示重復(fù)測定次數(shù)；t表示自由度為（n－1）、置信度為99%時的t 分布；S 表示n 次平行測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

7 次測定t（6，0.99）=3.143，檢出限測定結(jié)果見表2。由表2 可知，亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮檢出限分別為0.001 6，0.001 5，0.001 1，0.003 0 mg/L，檢出限均小于GB/T 14848—2017《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［13］Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)限值及GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》［14］Ⅰ類標(biāo)準(zhǔn)限值。

表2 檢出限測定結(jié)果mg/L

表3 為國內(nèi)相關(guān)方法檢出限。由表3 可知，本次研究連續(xù)流動分析法測定的亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮，其檢出限、測定下限值均低于國內(nèi)相關(guān)方法要求，對于低濃度樣品的檢測更為準(zhǔn)確。

表3 國內(nèi)相關(guān)方法檢出限mg/L

5.3 精密度實驗

精密度是指在同一條件下對同一樣品進(jìn)行多次測定結(jié)果的一致程度。精密度由隨機誤差決定，通常用標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）等指標(biāo)來表示。用標(biāo)準(zhǔn)溶液配置一定濃度的亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6 次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。由表4可知，硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，表明該方法的精密度良好。

表4 精密度測定結(jié)果

5.4 準(zhǔn)確度實驗

準(zhǔn)確度表示被測量的量值與其真值間的一致程度，反映分析方法和分析測量系統(tǒng)存在的系統(tǒng)誤差和隨機誤差的大小，即測量結(jié)果的可靠性，常用絕對誤差、相對誤差（RE）表征測定結(jié)果的準(zhǔn)確度。對亞硝酸鹽氮（200639）、硝酸鹽氮（200849）、氨氮（2005148）、總氮（203270）的有證標(biāo)準(zhǔn)樣品平行測定6 次，結(jié)果見表5。由表5 可知，亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮的測定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)保證值范圍內(nèi)，且測定結(jié)果的RE 值＜10%，表明使用連續(xù)流動法測定亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮的準(zhǔn)確度高。

表5 準(zhǔn)確度測定結(jié)果

5.5 加標(biāo)回收率測定

對飲用水回龍水庫水樣分別加入低、中、高3個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率實驗，測定結(jié)果見表6。

表6 加標(biāo)回收率測定結(jié)果

由表6 可知，亞硝酸鹽氮的加標(biāo)回收率在99.2%～106.0%、硝酸鹽氮的加標(biāo)回收率在99.7%～103.0%、氨氮的加標(biāo)回收率在84.6%～102.0%、總氮的加標(biāo)回收率在94.0%～100.0%，均得到較為滿意的結(jié)果。

5.6 “四氮”關(guān)系對比

用連續(xù)流動分析法連續(xù)多個月對回龍水庫的“四氮”進(jìn)行測定，由監(jiān)測結(jié)果可知，亞硝酸鹽氮的年平均質(zhì)量濃度為0.003 mg/L，占總氮比例0.49%；硝酸鹽氮的年平均質(zhì)量濃度為0.305 mg/L，占總氮比例47.0%；氨氮年平均質(zhì)量濃度為0.033 mg/L，占總氮比例5.1%；總氮年平均質(zhì)量濃度為0.649 mg/L。“四氮”關(guān)系測定結(jié)果對比見圖2。由圖2 可知，“四氮”關(guān)系符合要求［15－16］。“四氮”的濃度關(guān)系為：總氮＞硝酸鹽氮＞氨氮＞亞硝酸鹽氮。

圖2 “四氮”關(guān)系測定結(jié)果

6 結(jié)論和建議

6.1 結(jié)論

使用AA3 連續(xù)流動分析儀測定水中亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮4 個項目，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)都在0.999 以上，均能夠滿足實驗要求；亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮方法檢出限分別為0.001 6，0.001 5，0.001 1，0.003 0 mg/L，均低于國家相關(guān)方法的檢出限；精密度測試結(jié)果顯示，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，精密度良好；準(zhǔn)確度測試結(jié)果顯示，有證標(biāo)準(zhǔn)樣品的測定值均在保證值范圍內(nèi)，RE值＜10%，準(zhǔn)確度較高；加標(biāo)回收率測試結(jié)果顯示，不同濃度試樣的加標(biāo)回收率都在80%～120%之間，加標(biāo)回收率結(jié)果比較滿意；“四氮”關(guān)系符合要求。

綜上所述，用連續(xù)流動分析法測定淡水中的亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮、氨氮、總氮，儀器靈敏度較高、檢出限低、測量樣品的線性范圍廣、重復(fù)性和準(zhǔn)確度較好。儀器操作簡單快速，自動化程度高，可實現(xiàn)自動進(jìn)樣，儀器配有在線消解模塊、在線加熱模塊和透析膜，樣品可直接上機測試，簡化了水樣前處理過程，減少干擾因素，色度和濁度對分析過程幾乎無影響，適用性強，試劑消耗少，環(huán)境污染小。整個實驗反應(yīng)過程在一個密閉的管路中進(jìn)行，對實驗人員身體傷害小，是傳統(tǒng)分析技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代數(shù)據(jù)處理技術(shù)的典型應(yīng)用，可適用于大批量的樣品分析，為含氮化合物的水質(zhì)監(jiān)測工作提供了一種可靠、簡便而快捷的監(jiān)測方法。

6.2 建議

（1）流動分析儀測定中每一個樣品進(jìn)入儀器后被氣泡分割成20～30 個小片段，因此必須保證每一個測定的樣品流片段在相同的時間、流速、溫度等條件下進(jìn)行反應(yīng)，才能保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確度，所以在整個測試過程中要保證試劑充足，切忌做樣過程中隨意更換試劑或添加試劑，還需要隨時關(guān)注儀器狀態(tài)及實驗環(huán)境的變化。

（2）流動分析儀的特殊之處就在于樣品被氣泡分割成多個小片段，因此要時刻關(guān)注氣泡在管路中是否分布均勻，運行是否平穩(wěn)，且氣泡不會出現(xiàn)停頓或后退現(xiàn)象，如有此現(xiàn)象表明管路中的壓力不正常，可能是管路中有沉淀，可使用0.1 mol/L 或0.5 mol/L的HCl 溶液、0.1 mol/L 或0.5 mol/L 的NaOH 溶液、蒸餾水依次清洗管路，或使用10%的次氯酸鈉溶液清洗，或者按照儀器使用方法提供的特殊清洗液來清洗管路。

（3）連續(xù)流動分析儀屬于高精密儀器，對所用的試劑純度要求比較高，由于過硫酸鉀、NaOH 中含有少量氮，測定總氮時所用的過硫酸鉀為德國默克公司生產(chǎn)的進(jìn)口試劑，所用NaOH 為優(yōu)級純，NaOH 容易吸收空氣中的水和CO2，為保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，NaOH 要密封干燥保存，在測定總氮和硝酸鹽氮時，還原試劑硫酸聯(lián)氨也是比較關(guān)鍵的，不同廠家的硫酸聯(lián)氨質(zhì)量往往存在差異，純度不夠則導(dǎo)致試劑還原效率偏低，使測定結(jié)果準(zhǔn)確性降低，經(jīng)實驗篩選建議使用上海展云化工有限公司生產(chǎn)的硫酸聯(lián)氨。實驗用標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)臨用現(xiàn)配，所有試劑不用時都應(yīng)該放冰箱冷藏保存，超過保質(zhì)期的試劑重新配置，以保證基線的平穩(wěn)。

（4）在消解測定水中總氮時，潤滑劑對測定結(jié)果影響較大，常用的潤滑劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）、聚氧乙烯月桂醚、曲拉通。使用SDS 和曲拉通容易導(dǎo)致氣泡在加熱后破碎，影響基線平穩(wěn)，經(jīng)實驗篩選建議使用聚氧乙烯月桂醚作為總氮測定中的潤滑劑，以避免產(chǎn)生額外的漂移和帶過，保證基線的平穩(wěn)。

（5）溫度對顯色反應(yīng)的靈敏度影響很大，化學(xué)模塊上加熱池的溫度控制已依據(jù)分析方法設(shè)定好，使用時直接連接電源即可，切勿自己設(shè)定溫度或未打開加熱池，否則會帶來顯色反應(yīng)的靈敏度下降。