基于網絡藥理學及實驗探究益癸方湯防治絕經后骨質疏松癥的作用及機制

單珊 王佳晨 陳怡潔 徐哲昀 李伊伊 盛祝梅 黃飛翔 孟麗麗 張治芬

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨量減少和骨微細結構紊亂為特征的系統代謝性疾病[1]，其對老年婦女和絕經后婦女的影響尤為嚴重，大約一半的女性在絕經后至少經歷過一次骨質疏松性骨折[2]。更年期女性隨著卵巢功能的下降，雌激素產生減少，同時卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）水平增加，導致絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）的發生、發展[3]。目前PMOP 治療仍以口服藥物為主，但長期藥物治療可能會導致耐藥和不良反應。而中草藥療法因不良反應小易被患者接受。益癸方湯是臨床經驗方，本課題組前期研究結果表明益癸方湯可改善更年期女性圍絕經期癥狀，降低FSH 和LDL 水平，提高雌二醇（estradiol，E2）水平[4]。但該方對于骨量保護是否有作用尚缺乏相關研究，本研究通過網絡藥理學分析和實驗探究該方防治PMOP 的作用及機制，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雌性SD 大鼠25 只，體質量200～250 g，購自浙江中醫藥大學動物實驗中心，動物許可證號：SYXK（浙）2021-0012。大鼠飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，室溫22～26 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食水，12 h 間隔照明。本研究經浙江中醫藥大學實驗動物管理與倫理委員會審查通過（批準文號：IACUC-20221121-15）。

1.2 藥品、試劑和儀器 益癸方湯組方為枸杞、旱蓮草各10 g，紅景天6 g，阿膠9 g，黃精、當歸各10 g，茯苓15 g，黑大豆10 g，丹參、首烏藤各15 g，郁金10 g，由杭州市婦產科醫院中藥房煎煮，濃縮成100 mL/袋，4 ℃冰箱保存。戊酸雌二醇片（批號：727A，規格：1 mg/片，拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司）；戊巴比妥鈉（批號：57-33-0，杭州馨然公司）；HE 染色試劑（批號：G1120、G1821，北京索萊寶公司）；EDTA 脫鈣液（批號：BL616B，安徽合肥白鯊公司；4%多聚甲醛（批號：BL539A，安徽合肥白鯊公司）；Ⅰ型前膠原N 端前肽（procollagen type ⅠN-terminal propeptide，PINP）、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（tartrate resistant acid phosphatase 5b，TR-ACP-5b）、E2、FSH ELISA 試劑盒（批 號：RX302968R、RX300578R、RXJ302812R、RXJ302805R，武漢睿信生物公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0012S，上海碧云天公司）；RIPA 裂解液（批號：P0013B，上海碧云天公司）；分子量標志物Marker（批號：GF6616，上海積福公司）；信號傳導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、Janus 激酶（janus kinase，JAK）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）抗體（批號：YT4443、YT2424、YT0185，蘇州Immunoway 公司）；正置顯微鏡（型號：MoticAE 2000，廈門麥克奧迪）；全自動脫水機（型號：Excelsior AS，美國賽默飛公司）；切片機（型號：Leica RM2255，德國萊卡公司）、包埋機（型號：Arcadia H，德國萊卡公司）、染色機（型號：Gemini AS，美國賽默公司）、自動封片機（型號：ClearVue，美國賽默飛公司）；微型計算機斷層掃描（micro-computed tomography，Micro-CT）儀（型號：skyscan1276，美國bruker 公司）；電泳儀（型號：1658001，北京伯樂公司）；蛋白掃膜儀（型號：FluorChem Q，美國Proteinsimple 公司）。

1.3 方法

1.3.1 藥物活性成分的獲取 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺搜索益癸方所含藥物，設置口服生物利用度≥30%和類藥性≥0.18，搜索單味中藥相關的藥物活性成分。對于上述數據庫未收錄藥物，通過本草組鑒數據庫（http://herb.ac.cn/）及相關文獻進行補充。

1.3.2 活性成分作用靶點的預測及疾病靶點基因的篩選 在Swiss Target Prediction 數據庫中利用Molecule smile 預測藥物活性成分潛在作用靶點，設置篩選條件為Probability＞0.1。通過GeneCard 數據庫（https://www.Genecards.org/）、OMIM 數據庫（https://www.omim.org/）、Drugbank 數據庫（https://go.drugbank.com/）、PGKB數據庫（https://www.pharmgkb.org/）、GenClip 數據庫（http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php）、TTD 數據庫（https://db.id-rblab.net/ttd/）搜索“絕經后骨質疏松癥（postmenopausal osteoporosis）”和“更年期骨質疏松癥（menopausal osteoporosis）”相關基因，其中GeneCard 數據庫取score≥1 的靶點。去重并集后導出相關基因。

1.3.3 益癸方湯-PMOP 及更年期骨質疏松癥靶點網格構建和核心靶點篩選 將中藥有效成分潛在作用靶點與疾病相關靶點導入Cytoscape 3.7.1 中進行藥物-疾病靶點網格的構建,獲得蛋白質-蛋白質相互作用關系（protein-protein interactions，PPI），并對該網格進行分析，節點大小與其重要性呈正相關。將中藥成分潛在作用靶點信息與疾病相關共有靶點導入Cytoscape 3.7.1 中分析，取度中位數、接近性中心性中位數、兩者之間中心性位數，篩選出15 個核心靶點。

1.3.4 對潛在靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）可視化分析 將藥物作用于疾病的潛在靶點導入Metascape 平臺（https://metascape.org/gp/-index.html#/main/step1），進行可視化處理。GO 分析包括生物過程、分子組件、分子功能，采用KEGG 分析信號通路。

1.3.5 動物模型制備、分組及給藥 大鼠適應性喂養1 周，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組，每組5 只。除假手術組以外，其余組采用去卵巢手術法造模[5]，假手術組開腹后切除腹腔內黃豆大小一塊脂肪。術后所有大鼠肌肉注射青霉素3 d，以防感染。觀察各組大鼠精神狀態及飲食情況，術后1 個月開始給藥，根據人與大鼠用藥換算系數，計算出實驗藥物劑量。益癸方湯組給予10 mL/（kg·d）益癸方湯灌胃，戊酸雌二醇組給予0.21 mg/（kg·d）戊酸雌二醇灌胃，益癸方湯+戊酸雌二醇組給予益癸方湯10 mL/（kg·d）+戊酸雌二醇0.21 mg/（kg·d）灌胃，模型組及假手術組給予10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，共給藥12 周。最后1次灌胃后，按照0.2 mL/100 g 的劑量注射2%戊巴比妥鈉麻醉后取主動脈血，3 000 r/min，離心15 min，獲得血清保存于-80 ℃冰箱。以頸椎脫臼法處死大鼠，取大鼠左右后肢股骨，左側股骨置于4%多聚甲醛中常溫固定；右側股骨置于高溫消毒后EP 管中，-80 ℃冰箱保存。

1.3.6 股骨組織骨微細結構檢測 采用Micro-CT 掃描。將完整左側股骨組織在4%多聚甲醛中固定24～48 h 后取出，進行Micro-CT 掃描，獲取股骨平面圖像，配套CTAn、CT vox 軟件進行骨微細結構分析，軟件分析時在Micro-CT 掃描成像圖上選擇股骨遠端作為感興趣區域，包括骨體積分數（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁數量（trabecular number，Tb.N）、骨小梁間隔（trabecular separation，Tb.Sp）。

1.3.7 骨組織病理變化情況觀察 采用HE 染色。左側股骨組織Micro-CT 掃描完畢后，置于EDTA 脫鈣液中，每周更換1 次液體，2 個月后脫鈣完全后用流動雙蒸水沖洗2 h 以上，依次進行脫水、石蠟包埋、切片、HE染色及封片，正置顯微鏡下觀察骨組織病理變化。

1.3.8 血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平檢測 采用ELISA 法。嚴格按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清PINP、TRACP-5b、E2、FSH 水平。

1.3.9 股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。將右側股骨組織剪成綠豆大小，液氮下研磨，加入適量裂解液，冰上裂解30 min，再放入組織研磨器中研磨，4 ℃12 000 r/min，離心15 min，收集上清液。BCA 法測定蛋白濃度，計算20 μg 的總蛋白進行上樣，電泳儀將凝膠膜上蛋白轉移至纖維膜上，配制5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜3 次，將對應目的蛋白和內參條帶放于STAT3、JAK、Akt、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗中4 ℃搖床上孵育過夜，次日吸掉一抗，洗膜3 次，加入二抗，室溫搖床上孵育1 h，洗膜3 次，加入顯影劑進行顯影攝片。使用Image J 軟件對顯影圖像進行灰度值分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05 為差異有統計意義。

2 結果

2.1 益癸方湯防治PMOP 及更年期骨質疏松癥的網絡藥理學分析結果

2.1.1 益癸方湯活性成分及相應靶點獲取 益癸方湯中含有157 種有效活性成分，319 個靶點，主要活性成分有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等，見圖1（插頁）。

圖1 益癸方湯活性成分和PMOP 靶點

2.1.2 益癸方湯靶點基因的預測及PMOP、更年期骨質疏松癥靶點基因的篩選 利用數據庫篩選出更年期骨質疏松癥相關靶點1 405 個，PMOP 相關靶點1 199 個，兩者并集靶點去重后為1 775 個。

2.1.3 益癸方湯有效成分和PMOP 靶點PPI 網絡構建 使用Cytoscape 3.7.1 構建獲得活性成分與疾病共有靶點145 個，核心靶點包括絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、Akt1、IL-1β、TNF、TP53 等，見圖2。

圖2 15 個核心靶點

2.1.4 GO 和KEGG 分析結果 GO 與KEGG 分析結果顯示，生物過程涉及炎癥反應的調節、對激素的反應、對肽類的反應、細胞對有機氮化合物反應等，分子組件涉及受體、質膜、囊腔等，分子功能涉及氧化還原酶活性、核受體活性、配體活化轉錄因子活性等，可能作用途徑有癌癥途徑、高級糖基化終末產物-受體信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3，PI3K）/Akt 信號通路、MAPK 信號通路等。

2.2 實驗結果

2.2.1 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp比較，差異均有統計學意義（F=79.568、9.070、10.368、11.256，均P＜0.001）。與假手術組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均下降，Tb.Sp 均增加，差異均有統計學意義（均P＜0.01）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th 均增加；戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 均增加，Tb.Sp 均下降，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖3。從Micro-CT 二維圖和三維圖可見，與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織Tb.N 增多、致密，見圖4。

圖3 各組大鼠股骨組織BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 比較（A：BV/TV 比較；B：Tb.Th 比較；C：Tb.N 比較；D：Tb.Sp 比較）

圖4 各組大鼠股骨Micro-CT 二維圖、三維圖

2.2.2 各組大鼠股骨組織病理變化情況比較 與假手術組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁減少、變細；與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中骨小梁增加、變粗，見圖5。

圖5 各組大鼠股骨組織HE 染色圖（A：假手術組；B：模型組；C：益癸方湯組；D：戊酸雌二醇組；E：益癸方湯+戊酸雌二醇組）

2.2.3 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較，差異均有統計學意義（F=25.242、9.508，均P＜0.001）。與假手術組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均降低，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清PINP 水平均升高，戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清TRACP-5b 水平均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠血清PINP、TRACP-5b 水平比較（A：PINP 水平比較；B：TRACP-5b 水平比較）

2.2.4 各組大鼠血清E2、FSH 比較 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較，差異均有統計學意義（F=51.258、53.867，均P＜0.001）。與假手術組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠血清E2水平均降低，FSH 水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組E2水平均升高，FSH 水平均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖7。

圖7 各組大鼠血清E2、FSH 水平比較（A：E2水平比較；B：FSH水平比較）

2.2.5 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平比較 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平比較差異均有統計學意義（F=8 021.218、1 580.567、1 744.77，均P＜0.001）。與假手術組比較，模型組、益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平均升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平均降低，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見圖8。

圖8 各組大鼠股骨組織中STAT3、JAK、Akt 蛋白表達水平比較（A：蛋白表達的電泳圖；B：STAT3 蛋白表達水平比較；C：JAK 蛋白表達水平比較；D：Akt 蛋白表達水平比較）

3 討論

本研究通過實驗探究益癸方湯對去卵巢大鼠模型的骨量保護作用，結果顯示該方劑可提高大鼠體內E2水平、降低FSH 水平，骨代謝指標中PINP 升高、TRACP-5b 降低，以及股骨微細結構骨量改善，驗證該方劑可預防去卵巢大鼠的骨質疏松，在網絡藥理學基礎上篩選出STAT3、JAK、Akt 靶點，通過實驗進一步驗證了益癸方湯的作用機制可能通過下調STAT3、JAK、Akt 蛋白的表達發揮作用。

PMOP 的發生與女性雌激素水平下降有關，網絡藥理學分析益癸方湯中可能含有槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種化合物。已有研究證實口服槲皮素能夠部分逆轉動物模型中的骨質減少，其可能通過抗氧化、抗炎、促進成骨細胞、抑制破骨細胞發揮作用[6]。Kim 等[7]研究表明木犀草素顯著降低了骨髓單核細胞和Raw264.7 細胞向破骨細胞的分化，還抑制分化破骨細胞的骨吸收活性。也有研究證明丹參酮ⅡA 沒有改變NF-κB 受體激活劑或巨噬細胞集落刺激因子受體的表達，而是可能抑制NF-κB 受體激活劑配體誘導的破骨細胞分化[8]。本研究篩選出MAPK3、Akt1、TNF、IL-1β、TP53 等靶點，結合KEGG 通路分析，尋找到Akt 靶點和PI3K/Akt 信號通路相關聯。本研究發現，與模型組比較，益癸方湯組、戊酸雌二醇組、益癸方湯+戊酸雌二醇組大鼠股骨組織中JAK、STAT3、Akt 表達水平均降低，提示益癸方湯可能通過該通路影響骨量作用。PI3K/Akt 信號通路通過介導生長因子信號傳導到有機過程和關鍵細胞過程，如葡萄糖穩態、脂質代謝、蛋白質合成以及細胞增殖和存活[9]。細胞對雌激素的反應由雌激素受體與雌激素反應元件的結合和信號轉導途徑的激活等非核作用介導，雌激素還和PI3K/Akt 信號通路有關，數據表明17-E2可通過非核作用激活子宮內膜癌細胞系中的PI3K/Akt 信號通路[10]。PI3K/Akt 通路還影響了氧化應激過程，促進氧化損傷后細胞存活中發揮著關鍵作用[11]。JAK/STAT 途徑是細胞因子信號傳導的最重要途徑之一，它不僅參與炎癥，還與細胞增殖、分化、凋亡和免疫調節有關[12]。研究發現當JAK/STAT 通路被激活時，可以進一步激活MAPK 和Runt 相關轉錄因子2 信號傳導并促進成骨分化[13]。一些黃酮類化合物可以發揮成骨分化作用，如槲皮素可作用于Akt1 靶點，并通過激活PI3K/Akt 信號通路促進骨髓間充質干細胞的成骨分化[14]。

綜上所述，益癸方湯中的槲皮素、木犀草素、丹參酮、柚皮素、谷甾醇等多種有效成分可能通過作用于PI3K/Akt、JAK/STAT 信號通路防治PMOP，為中草藥防治POMP 增加了理論基礎。