腦卒中后認知與非認知功能障礙患者腸道菌群特征的差異研究

王中莉 曾明 任蕓 沈雅萍 孫燕 施明 顧旭東 傅建明 姚云海

腦卒中后認知功能障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是腦卒中后最常見的并發癥之一，有超過1/3 的腦卒中患者伴有不同程度的認知功能障礙[1]，PSCI 患者無法主動配合其恢復期的康復治療是康復領域棘手的問題。目前PSCI 的治療手段相對有限，包括藥物、高壓氧、經顱磁刺激、直流電刺激等治療[2-5]，且療效一般，因此開發PSCI 治療的新靶點日益受到臨床醫生重視。有研究表明，人類腸道菌群通過觸發代謝性疾病和低度炎癥的進展，與認知功能障礙尤其是阿爾茨海默病引起的癡呆發病機制直接相關[6-10]。近年來的研究表明腦卒中（包括缺血性及出血性）后患者易發生腸道菌群紊亂[11-14]。本研究旨在比較PSCI 與腦卒中后非認知功能障礙（non-post-stroke cognitive impairment，non-PSCI）患者腸道菌群特征的差異，為益生菌治療PSCI 提供理論依據，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 對2022 年2 月至2023 年2 月嘉興市第二醫院康復中心收治的腦卒中患者，采用簡易精神狀態檢查量表（mini-mental state examination，MMSE）（總分30 分）評定有無PSCI[15]，同時參考患者文化水平作調整（文盲≤17 分、小學≤20 分、中學或以上≤24 分）。選擇PSCI 患者（觀察組）和性別、年齡配對的non-PSCI 患者（對照組）各44 例。觀察組腦出血患者占比多于對照組，腦梗死占比少于對照組，MMSE 評分低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。其他一般指標比較差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。納入標準：符合全國第4 次腦血管疾病會議制訂的診斷標準[16]，并經CT 或MRI 檢查證實為腦卒中；首次發病，年齡30～75 歲；病程2 周～3 個月；生命體征穩定，意識清楚，可以配合量表評估。排除標準：患有帕金森、阿爾茨海默病或其他中樞神經系統疾病、重度抑郁、惡性腫瘤、肝腎等嚴重代謝性疾病、慢性胰腺炎、炎癥性腸病（克羅恩病、潰瘍性結腸炎）；胃腸手術史（闌尾切除術除外）、孕婦；4 周內使用過抗生素。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：JXEY-2022SW065），患者或家屬均知情同意。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本采集及儲存 告知患者采集糞便標本目的和方法。1 周前保持日常飲食習慣，避免飲食大幅度變化，女性避開生理期。采樣當天用糞便取樣勺按要求截取約花生粒大小（3 g 以上）糞便樣本為1 份放入收集管，共2 管，密封后置于4 ℃冰箱暫存，并于4 h 之內通過低溫保存統一配送至本院中心實驗室-80 ℃冰箱中存貯直至統一檢測。

1.2.2 腸道菌群的檢測 首先提取糞便樣本基因組DNA，以糞便樣本的基因組DNA 為模板，使用帶Barcode 的特異引物和高保真DNA 聚合酶對選定的V3～V4可變區進行PCR 擴增后上機測序。參考文獻[17]后采用準確率高及物種覆蓋率損失極低343F/798R 引物序列（表2）擴增16S rRNA V3～V4可變區，用于腸道菌群信息的分析。使用Illumina NovaSeq 6000 測序平臺進行測序，并生成250 bp 雙端reads。測序由上海鹿明生物技術有限公司進行。

表2 PCR 擴增細菌16S rRNA V3～V4可變區引物名稱及序列

1.2.3 腸道微生物信息學數據的獲取與分析 采用擴增子序列變異（amplicon sequence variant，ASV）分析[18]。測序完成后，原始數據為FASTQ 格式。數據下機后，首先使用cutadapt 軟件，對原始數據序列剪切掉引物序列。然后使用DADA2 將上一步合格的雙端原始數據按照QIIME2（https://library.qiime2.org，https://view.qiime2.org，https://Dev.qiime2.org）默認參數進行質量過濾，降噪，拼接及去嵌合體等質控分析后產生每個去重復的特征序列特征表[19-20]。使用QIIME2 軟件包挑選出各個ASV 的代表序列后，并將所有代表序列與Silva（version138）數據庫進行對比注釋。各個數據庫網址為：細菌、真核生物（Silva）--https://ftp.arb-silva.de；真菌（Unite）--https://unite.ut.ee/repository.php；細菌（Greengenes） --ftp://greengenes. microbio. me/greengenes_release。物種對比注釋使用q2-feature-classifier軟件默認參數進行分析。對兩組樣本進行α 多樣性分析和β 多樣性分析。（1）α 多樣性分析[21-22]：采用反映物種豐度的Chao1 指數，指數越大，說明物種豐度度越高；反映物種豐度及均質度的Shanonon 指數，指數越大說明物種多樣性越高，物種分布越均勻。（2）β 多樣性分析[23]：采用Bray curtis 距離算法做主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），通過一系列的特征值和特征向量進行排序后，選擇主要排在前幾位的特征值，PCoA 可以找到距離矩陣中最主要的坐標PC1 和PC2，通過PCoA 可以觀察個體或群體間的差異。在門和屬分類層級對樣本進行注釋以及匯總計算相對豐度，將門水平Top10 和屬水平Top30 的物種納入本研究分析。腸道微生物信息學數據分析通過https://cloud.oebiotech.cn/task/的交互式可視化平臺進行分析獲得。

1.3 統計學處理 采用SPSS26.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以表示，組間比較采用配對樣本t檢驗，非正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用采用配對樣本Wilcoxon 秩和檢驗。微生物信息學分析部分采用QIIME2 軟件進行α 多樣性分析。利用R 計算的Bray curtis 距離算法，進行Bray curtis 距離PCoA 來評估樣本的β 多樣性，結合微生物多元變量統計分析中的PERMANOVA 檢驗判斷差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者糞便樣本中腸道菌群α 多樣性比較兩組患者Chao1 指數及Shanonon 指數比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表3。

表3 兩組患者α 多樣性比較

2.2 兩組患者糞便樣本中腸道菌群β 多樣性比較兩組患者β 多樣性比較，差異有統計學意義（P=0.048），見圖1。

圖1 兩組患者腸道菌群的PCoA

2.3 兩組患者糞便樣本門水平相對豐度TOP 10 腸道菌群比較 門水平腸道菌群，觀察組中相對豐度TOP 3 擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門在的平均相對豐度分別為53.88%、22.90%和16.03%；對照組中分別為47.37%、26.14%和20.52%。兩組患者糞便樣本門水平相對豐度TOP 10 腸道菌群比較，差異均無統計學意義（Z=-1.302、-0.517、-0.451、-1.185、-1.074、-0.146、-0.167、-1.155、-0.169、-0.919，P=0.193、0.605、0.652、0.236、0.283、0.884、0.868、0.248、0.866、0.358），見圖2（插頁）。

圖2 兩組患者糞便樣本門水平相對豐度TOP 10 腸道菌群比較

2.4 兩組糞便樣本中屬水平相對豐度TOP 30 腸道菌群比較 兩組糞便樣本屬水平相對豐度TOP 30 腸道菌群比較發現，觀察組Bifidobacterium、Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對豐度低于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對豐度高于對照組，差異均有統計學意義（均P＜0.05），見表4。

表4 兩組糞便樣本中屬水相對豐度TOP 30 腸道菌群比較

3 討論

PSCI 是腦卒中后出現的認知功能下降，表現為記憶力、注意力、執行功能、語言能力、空間和時間感知能力等腦的高級功能受損。PSCI 不僅影響患者的生活質量，還可能導致其日常生活能力的喪失。目前PSCI 的治療主要為藥物及物理因子治療，療效一般，因此尋找PSCI 治療的新方法至關重要。

腸道微生物群組成的變化是許多神經疾病認知功能下降的一個起始因素，顯著影響中樞神經系統免疫和血腦屏障的完整性[10]。本研究結果顯示，兩組患者α 多樣性比較，差異均無統計學意義；β 多樣性比較，差異有統計學意義。兩組患者糞便樣本門水平相對豐度TOP 10 腸道菌群比較，差異均無統計學意義，但兩組糞便樣本屬水平相對豐度TOP 30 腸道菌群比較發現，觀察組中Bifidobacterium 和Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對豐度低于對照組，Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對豐度高于對照組，差異均有統計學意義，由此提示PSCI患者腸道菌群紊亂，說明Bifidobacterium和Lachnospiraceae_NK4A136_group 可能作為益生菌為PSCI 治療提供新思路。

本研究通過Chao1 指數和Shanonon 指數評估兩組患者的α 多樣性，發現差異無統計學意義，研究結果與一些學者的研究結果一致[24]，但與另一些學者的研究結果不一致，Liu 等[25]研究發現PSCI 組與non-PSCI 組患者的Chao1 指數和Shanonon 指數有差別，原因可能在于該研究中選取病程3 個月后的腦卒中患者，而本研究中是病程2 周到3 個月的腦卒中患者，此外性別和年齡也是影響腸道菌群的重要因素[26]，其研究設計未進行性別和年齡的配對可能是產生結果不一致的原因。β 多樣性是度量時空尺度上物種組成的變化，是生物多樣性的重要組成部分。本研究發現，兩組患者腸道菌群β 多樣性不同，與既往的研究結果一致[25]。

Bifidobacterium 是目前公認的益生菌，其屬于放線菌門放線菌科的菌屬，其作為益生菌及其代謝物短鏈脂肪酸（short chain fat acid，SCFA），已被證明可以調節腸道微生物群和免疫系統[27-28]。一項Bifidobacterium 作為益生菌干預輕型認知功能障礙的隨機對照研究現已證實采用Bifidobacterium 治療是對改善輕型認知功能障礙患者記憶功能安全有效[29]。本研究發現在觀察組中Bifidobacterium 相對豐度低于對照組，提示Bifidobacterium 對PSCI 患者有保護作用。一項通過人群及動物實驗研究腸道微生物群通過脂多糖和丁酸鹽與卒中后認知功能障礙的因果關系，發現PSCI 小鼠的血腦屏障完整性惡化、小膠質細胞激活、海馬區神經元凋亡以及丘腦中Aβ 沉積[30]。腦卒中后腹腔注射炎癥因子內毒素引起的病理與PSCI 小鼠相似。通過飲用水補充丁酸鈉挽救了PSCI 小鼠的這些有害變化，可見SCFAs 中的丁酸可以逆轉腦卒中引起的認知功能障礙，同時初步闡明炎癥是導致PSCI 的原因之一。人群及動物實驗均證實Bifidobacterium 產生的代謝產物具有抗炎作用[31-33]。Bifidobacterium 作為益生菌治療PSCI患者提高認知功能具有廣泛的應用前景。

Lachnospiraceae_NK4A136_group 屬于厚壁菌門毛螺科（Lachnospiraceae），是近年來被發現的物種，具有厭氧和孢子形成的特點，能夠將植物多糖發酵成SCFAs 和乙醇[34]。本研究發現在觀察組中Lachnospiraceae_NK4A136_group 相對豐度低于對照組，提示Lachnospiraceae_NK4A136_group 對PSCI 患者有積極作用。有關Lachnospiraceae_NK4A136_group 的研究相對較少，其對腦卒中認知功能障礙的作用可能是其產生的SCFAs 發揮作用，研究證實Lachnospiraceae 對水果蔬菜中的果膠有很強的發酵分解能力，可以產生SCFAs 尤其是乙酸和丁酸[35-36]。研究證實SCFAs 在微生物-腸-腦軸中發揮關鍵作用[37]，Lachnospira-ceae_NK4A136_group屬于毛螺科中的菌屬可能有相似的特性。

本研究亦發現Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 相對豐度在觀察組高于對照組。一項動物的實驗表明Enterobacter 的增加會導致腦缺血性小鼠的認知功能障礙惡化[38]，UBA1819 屬于Ruminococcaceae 科，此科內包括有益菌亦存在有害菌，該研究中發現UBA1819 可能是肥胖小鼠、腹瀉小牛中的有益菌[39-40]，與動物實驗結論相反，與非糖尿病腎病比較中發現糖尿病腎病的人群中16srRNA 測序獲得UBA1819相對豐度較高[41]，UBA1819 對糖尿病腎病患者為有害菌，可見人群與動物中的腸道菌群功能存在差異，不同疾病中菌群可能通過多種機制調節，在PSCI 中是否為有害菌，還需更多研究加以探討。通過宏基因組測序鑒定Lachnoclostridium 為產三甲胺（trimethylamine，TMA）促進動脈硬化的關鍵腸道菌[42]，動物實驗證實微生物源性的TMA 與哺乳動物血腦屏障有直接相互作用并對腦血管和認知功能產生影響，可見Lachnoclostridium 可能通過產生TMA 對PSCI 產生危害[43]。因此本研究推測減少Enterobacter、Lachnoclostridium 和UBA1819 菌可能可以改善PSCI。

綜上所述，腦卒中認知功能障礙患者與非認知功能障礙患者腸道菌群特征有差異，Bifidobacterium 作為常見的益生菌可以在腦卒中認知功能障礙的治療中作為輔助康復治療的手段推廣應用，Lachnospiraceae_NK4A136_group 也可能作為潛在的益生菌成為PSCI 治療的新靶點。本研究采用的是16s rRNA 擴增子測序技術獲得的腸道菌群信息只能獲得屬水平的菌群信息，不能獲知種水平的菌群信息以及具體腸道菌群的基因全長，無法預測腸道菌群的功能，對Bifidobacterium 和Lachnospiraceae_NK4A136_group 作為益生菌的開發仍然任重而道遠。本研究存在一些局限性和不足，主要為本研究樣本量相對較小，腦卒中類型上尤其是腦出血患者相對少，且本研究是一個橫斷面的病例對照研究，其結論的推斷具有局限性，因此還需進行大樣本的研究或隨機對照干預研究進一步驗證。