不同粒徑零價鐵對微氧脫氮系統的影響

于雅楠，張瀟，岳秀萍，2，趙博瑋，周愛娟，崔穎，邢劍波

（1.太原理工大學環境科學與工程學院，山西晉中 030600； 2.山西浙大新材料與化工研究院，山西太原 030032； 3.大同市生態環境評估中心，山西大同 037002）

部分硝化反硝化厭氧氨氧化工藝（Simultaneous partial nitrification，ANAMMOX and denitrification，SNAD）〔1〕是在全程自養脫氮（Completely autotrophic nitrogen removal over nitrite，CANON）的基礎上發展而來的微氧脫氮工藝。與CANON不同的是，SNAD工藝存在有機物，并非完全自養過程，其啟動和運行的關鍵條件是控制反應器內溶解氧（DO）質量濃度為0.3~1.0 mg/L〔2-3〕，形成外層好氧內層缺氧或厭氧的微環境，從而實現部分硝化、反硝化以及厭氧氨氧化菌的共存。相較于傳統的脫氮工藝，SNAD可以減少有機物的投加和曝氣能耗。但微氧條件中，由于較低的溶解氧濃度有利于絲狀菌生長，易引發污泥膨脹問題。因此在我國“碳達峰、碳中和”的政策背景下，如何高效低碳運行SNAD工藝具有重要的研究意義。

最近有大量研究證實，鐵的加入可以促進厭氧氨氧化（ANAMMOX）的脫氮效率，促進厭氧氨氧化菌（Anaerobic ammonia oxidizing bacteria，AnAOB）富集〔4-7〕。鐵是微生物重要的微量元素，微生物能量代謝中大量的鐵硫蛋白、細胞色素均是以鐵元素作為活性中心〔8-9〕。微生物胞外電子傳遞（EET）主要依賴位于外膜（OMCs）上的c型細胞色素〔10〕；鐵可通過價態變化參與能量代謝中重要的電子傳遞過程〔11〕；還有研究發現一類以鐵作為電子供體的自養反硝化菌〔12〕。此外，還有研究表明鐵的加入可以促進氨氧化酶（Ammonia monooxygenase，AMO）和亞硝酸鹽氧化還原酶（Nitrite oxidoreductase，NXR）的活性，并增加氨單加氧酶功能基因amoA的豐度〔13〕。這些研究大多采用厭氧或好氧的條件來探究零價鐵（Zerovalent iron，ZVI）對單一功能菌群的影響，但很少有人探究微氧體系中ZVI對復雜群落的影響，因此，本研究從運行狀況、微生物活性以及復雜群落中微生物演替3個方面進行分析，重點探究不同粒徑ZVI介導下SNAD微氧系統的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及試劑

NH4Cl、C6H12O6、NaHCO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、EDTA、H3BO3、MnCl2、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、NaOH、NiCl2·6H2O、Na2WO4·10H2O、Na2MoO4·2H2O、KI、HgI、H2SO4、H3PO4、Ag2SO4、N-（1-萘基）-乙二胺鹽酸鹽、還原鐵粉試劑購自國藥集團，INT試劑購自麥克林試劑，以上藥品均為分析純。納米鐵粉試劑購自上海茂果納米科技有限公司，COD相關測定試劑購自北京連華永興科技發展有限公司，用于測定污泥EPS蛋白的BCA試劑盒購自上海生工。

表1 主要儀器設備Table 1 Main instruments and equipments

1.2 實驗裝置與運行條件

采用3個完全相同的由亞克力制作而成的外曝氣回流微氧污泥床反應器，分別命名為R1、R2和R3，長30 cm、寬10 cm、高12 cm、有效容積為3.6 L，如圖1所示。

圖1 工藝流程示意Fig.1 Technological flow chart

反應器出水通過充分曝氣至溶解氧為5.0~6.0 mg/L，部分富氧水回流到反應器內保證反應器內DO維持在0.2~0.5 mg/L。反應器內溫度控制在（30±1） ℃，水力停留時間（HRT）設置為12 h。反應器內的接種污泥來自實驗室運行5個月的升流式微氧反應器R0，MLSS=8.718 g/L，MLVSS=4.377 g/L。反應器進水使用實驗室配制的TN為70 mg/L，COD/TN為3的模擬廢水，分別向3個反應器中投入平均粒徑為50 nm、200 nm和微米級別的ZVI（50 nZVI、200 nZVI和mZVI）對污泥進行馴化，投加量均為每4天投入120 mg。實驗共持續25 d，每天對反應器出水中的污染物進行檢測，對接種污泥和運行結束后污泥的胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）、電子傳遞活性（Electron transport system activity，ETSA）、微生物酶活性和群落組成進行檢測。

模擬污水由以下物質組成：NH4Cl（267.5 mg/L）、C6H12O6（196.88 mg/L）、NaHCO3（1 000 mg/L）、KH2PO4（22 mg/L）、CaCl2·2H2O（20 mg/L）、MgSO4·7H2O（300 mg/L）和每升1.2 mL礦物質溶液。

礦物質溶液的組成：EDTA（15 g/L）、H3BO3（0.014 g/L）、MnCl2（0.99 g/L）、CuSO4·5H2O（0.25 g/L）、ZnSO4·7H2O（0.45 g/L）、NiCl2·6H2O（0.19 g/L）、Na2WO4·10H2O（0.21 g/L）、Na2MoO4·2H2O（0.22 g/L）。

1.3 分析方法

反應器出水經過0.45 μm濾頭過濾后立即對水中NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD進行檢測。NH4+-N、NO2--N和NO3--N分別采用納氏試劑分光光度法（λ=420 nm）、N-（1-萘基）-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法（λ=540 nm）和麝香草酚分光光度法（λ=415 nm）測定，總無機氮（Total inorganic nitrogen，TIN）為3種無機氮（NH4+-N、NO2--N、NO3--N）之和。COD采用連華科技多功能水質檢測儀檢測。出水中Fe質量濃度采用原子吸收光譜法測量。

EPS采用熱提取法〔14〕提取出溶解型胞外聚合物（Soluble extracellular polymeric substances，S-EPS）、松散結合型胞外聚合物（Loosely bound extracellular polymeric substances，LB-EPS）和緊密結合型胞外聚合物（Tightly bound extracellular polymeric substances，TB-EPS）。使用苯酚-硫酸法和上海生工BCA蛋白分析試劑盒分析EPS中的多糖（Polysaccharide，PS）與蛋白（Protein，PN）含量。用三維熒光光譜儀（RF-6000，日本島津）檢測EPS的3D熒光光譜（3DEEM）。

粗酶液的提取與酶活性檢測參照文獻〔15〕的檢測方法進行。采用INT法檢測污泥的ETSA〔16〕。

1.4 高通量測序

接種污泥和經過50 nZVI、200 nZVI、mZVI馴化25 d的污泥分別命名為S0、S1、S2和S3。用引物338F（5’-ACTCCTACGGGGGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）對16S rRNA基因水平進行PCR擴增。用Illumina MiSeq（美吉生物）對其進行高通量測序，并使用美吉生信云平臺（www.majorbio.com）進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 反應器運行情況分析

分別考察不添加ZVI、50 nZVI、200 nZVI、mZVI馴化條件下反應器進出水NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD的變化，結果見圖2。

圖2 不同粒徑ZVI馴化條件下反應器出水變化Fig.2 Variation of reactor effluent under ZVI domestication with different particle sizes

圖2（a）和圖2（e）為接種污泥反應器（RO）出水各參數變化情況。在不投加ZVI的條件下出水TIN約為15.643 mg/L，總無機氮去除率（RE-TIN）約為77.726%。COD去除率約89.449%。由圖2（b）~圖2（d）中各反應器的RE-TIN可知，在SNAD系統中加入ZVI后均有一個RE-TIN下降的適應階段，投加50 nZVI的反應器在投加7 d后，RE-TIN開始上升，而投加200 nZVI和mZVI的反應器分別在投加后的第3天和第4天RE-TIN開始上升，到第7 天開始有小幅度下降。3個反應器的RE-TIN均在運行17 d后趨于穩定，分別為83.591%、80.800%和80.689%。NH4+-N為出水中TIN的主要形態，故NH4+-N去除效率與RE-TIN有一樣的變化趨勢。在ZVI的介導下，3個反應器均出現了NO2--N積累現象，但不同的是，投加50 nZVI的反應器在前8天出水NO2--N高于NO3--N，投加200 nZVI的反應器在前5天出水NO2--N高于NO3--N，而投加mZVI的反應器僅在第2天出現此現象。這可能是由于亞硝酸鹽氧化菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）對于ZVI的敏感度較氨氧化菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）更低，粒徑更小的ZVI對AOB的刺激作用更加明顯。NO2--N的積累也是ZVI影響下的正常現象，此前有研究發現單位質量土壤中包含10 mg/g的nZVI抑制了NH4+-N氧化電位，并伴有NO2--N產生〔17〕。NO2--N的積累為AnAOB的富集提供底物，運行中NO2--N的變化情況使得投加nZVI的反應器中AnAOB豐度更高。

圖2（f）~圖2（h）所示為3個投加ZVI反應器中COD去除效果。圖中數據表明，在投入ZVI后3個反應器出水COD均呈現先下降后上升最終趨于平穩的變化趨勢。3個反應器均在第6天達到最高的COD去除率，分別為87.323%、87.831%和90.052%。從第7天起COD去除率有小幅度下降，直到第17天后趨于穩定，3個反應器的COD去除率分別穩定在78.802%、80.671%和83.535%。COD的數據變化表明，添加ZVI對COD的去除產生抑制作用，ZVI粒徑越小，對COD去除的抑制作用越強。文獻〔18〕報道nZVI對很多好氧異養微生物的抑制作用明顯，而好氧異養微生物是微氧活性污泥體系中去除COD的主要功能菌群。

Fe為一種活潑金屬，會被水中溶解氧腐蝕，在微氧活性污泥系統中，ZVI還會被污泥中的微生物腐蝕，溶出更多的鐵離子，也會影響系統中pH的變化。考察了不同粒徑ZVI條件下，各反應器出水Fe質量濃度及pH的變化，結果見圖3。

圖3 反應器出水Fe質量濃度（a）與pH（b）變化Fig.3 Changes of Fe mass concentration （a） and pH （b）of the reactor effluent

由圖3（a）可以看出，在反應器運行前10天，出水中Fe質量濃度由高到低依次是R1、R2、R3，平均質量濃度分別為0.930、0.823、0.556 mg/L，粒徑越小的ZVI介導系統出水中Fe質量濃度越高。但在運行10 d后，出水中Fe平均質量濃度由高到低依次為R2、R1、R3，分別為1.267、0.998、0.482 mg/L。這可能是由于粒徑越小的Fe，其相對表面積越大，越容易被氧化為離子狀態，故前10天出水中Fe質量濃度表現出R1>R2>R3。運行10 d后，出水中Fe質量濃度表現出R2>R1>R3，這種現象的產生一方面50 nZVI粒徑小，更容易被EPS吸附，故而產生的鐵離子更容易被微生物利用，從而使得出水中檢測到的鐵質量濃度居中；另一方面50 nZVI粒徑最小，最有可能被微生物吸收到細胞周質空間被氧化利用〔19〕，從而導致隨反應器出水流出的鐵質量濃度低。

圖3（b）為3個反應器進水與出水pH的變化，進水pH在7.69±0.49，R1~R3反應器出水pH分別為7.87±0.46、7.92±0.37和8.01±0.39。硝化作用消耗堿度，反硝化過程產生堿度，出水pH整體相較于進水pH增大，說明在反應器中反硝化仍是脫氮的主要途徑。而根據3個反應器出水pH的對比可以看出，隨著投加ZVI粒徑的增大，出水pH也隨之增大，這也表明在nZVI介導的反應器中消耗堿度的硝化過程更加活躍。部分硝化過程能夠產生更多的NO2--N，AnAOB的反應底物增加有利于其富集，這可能也是出水pH較低的R1和R2中檢測到高豐度的AnAOB的原因。

2.2 微生物胞外聚合物及活性分析

2.2.1 微生物胞外聚合物分析

EPS是微生物的保護性屏障，是細胞之間合作和交流的介質〔20〕，主要由PN和PS構成。接種污泥及R1~R3反應器中污泥的EPS中PN和PS質量分數見圖4。

圖4 EPS中PN、PS變化Fig.4 Changes of PN and PS in EPS

由圖4可知，4個污泥樣品的EPS中PN的質量分數都明顯高于PS質量分數。S1~S3中單位質量VSS包含PN質量由接種污泥S0的36.266 mg/g分別增加到44.193、40.495、40.982 mg/g。已有研究表明，在金屬離子的影響下，微生物會產生更多的蛋白質，與金屬形成絡合物從而降低金屬離子的毒性，保護微生物免受金屬離子的傷害〔21〕。50 nZVI介導的污泥（S1）中PN的增加量明顯高于另外兩個污泥，這表明小粒徑的ZVI更容易被EPS吸附，對微生物的影響更加顯著。S1~S3中單位質量VSS包含PS的含量由接種污泥S0的13.669 mg/g分別增加為15.261、15.512、15.293 mg/g。3個污泥樣品的EPS中PS的質量分數并未有較大的差距，說明ZVI粒徑對EPS中PS的影響不大，故m（PN）/m（PS）的不同主要是由m（PN）影響，3個污泥中的m（PN）/m（PS）由接種污泥的2.653分別變為2.896、2.611和2.680。數值的增加表明EPS中PN含量更高，PN主要構成EPS中的疏水部分〔22〕，PN含量高的污泥穩定性更強，投加50 nZVI的反應器中m（PN）/m（PS）高于另外兩個反應器，這表明50 nZVI對微生物EPS的作用更顯著，促使污泥更加穩定。總體來說，50 nZVI更容易被EPS吸附，促進EPS產生，同時提高污泥的穩定性。

3D-EEM是研究EPS組分的重要手段之一，根據激發（Ex）/發射（Em）波長的范圍分別將其劃分為5個區域，分別對應5類有機物（表2），圖5是4個污泥樣品中不同類型EPS的3D-EEM。

圖5 EPS的3D-EEMFig.5 3D-EEM of EPS

表2 熒光物質分區Table 2 Fluorescent substance partition

由圖5可以看出，在5類有機物中，各類型EPS中酪氨酸與色氨酸這兩種芳香蛋白的熒光強度最強，芳香蛋白類物質在保持污泥絮體結構穩定方面發揮重要作用〔23〕。S-EPS中富里酸和腐殖酸的熒光強度明顯高于其他EPS。

由圖5中4個樣品的熒光強度對比可以發現，在加入ZVI后，各類型EPS的主要熒光物質并未發生明顯變化，但熒光強度有明顯增強。ZVI的介導促進了EPS的產生，尤其是區域Ⅰ和Ⅱ代表的兩類芳香蛋白，在3層EPS中都有最強的熒光響應。同時在對EPS中的PN和PS含量檢測中也發現ZVI介導的EPS中PN的含量明顯升高，區域Ⅰ的酪氨酸蛋白物質是污泥團聚的物質基礎；區域Ⅲ所代表的富里酸類物質主要存在于S-EPS中，ZVI的介導使得富里酸的熒光響應強度有一定的降低；區域Ⅳ代表的腐殖酸類物質主要存在于LB-EPS和TB-EPS中；區域Ⅴ代表的溶解性有機物主要存在于S-EPS和LBEPS中，其中，LB-EPS層中兩類有機物的熒光響應強度增加最為明顯。腐殖酸能夠與環境中金屬、有機物等發生一系列氧化還原反應，與金屬還原、有機物分解具有密切的聯系〔24-26〕。

2.2.2 微生物活性分析

為了考察不同粒徑ZVI馴化下污泥中微生物活性的變化情況，對接種污泥、S1~S3共4個污泥樣品進行了脫氮酶的活性（以單位時間轉化單位質量蛋白質的酶量計）和微生物ETSA（以單位時間單位質量TSS還原的INT計）的變化分析，結果見圖6。

圖6 反應器中污泥活性變化Fig.6 Change of sludge activity in reactor

由圖6（a）可知，在加入ZVI后，除硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase，NR）以外，其余3種脫氮酶活性均有明顯提高，尤其是氨氧化酶（Ammonia monooxygenase，AMO）與亞硝酸鹽氧化酶（Nitrite oxidoreductase，NOR），這與文獻中報道的這兩種硝化酶均含有以鐵作為關鍵元素的活性中心〔27〕相符。從3個反應器4類酶活性的對比可以看出，mZVI對酶活性的促進效果更加顯著，單位時間單位質量蛋白中AMO、NOR、亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NIR）分別為9.099、3.839、2.138 μg/（mg·min），分別為初始酶活性的5.513、7.860、2.727倍。AMO的活性隨著投加ZVI粒徑的增加而增加，這可能是由于小粒徑的ZVI促進了AnAOB的富集，厭氧氨氧化成為氨氧化脫氮的主要途徑。而NOR和NIR的活性在50 nZVI和mZVI的介導下均有比200 nZVI介導下更強的活性。

由圖6（b）可知，加入不同粒徑ZVI的S1、S2和S3中檢測出的ETSA相較于接種污泥S0有明顯增加。并且50 nZVI馴化的S1中電子傳遞活性明顯更高，是S0的1.48倍。S2和S3幾乎持平，分別為S0的1.16和1.15倍，這表明粒徑更小的ZVI對電子傳遞活性的促進作用更加明顯。ZVI對ETSA的影響在于，電子傳遞過程（ETS）中包含很多以鐵元素為活性中心的蛋白如鐵硫蛋白、細胞色素等〔11〕。細胞色素大都位于電子傳遞鏈的后端，其主要功能就是電子傳遞。細胞色素按其吸收光譜和氧化還原電位的差別可分成多種類型，如cyt.a，cyt.a3，cyt.b，cyt.c等。它們都以血紅素作為輔基，且血紅素通過其分子中心鐵的價態變化來傳遞電子生成能量〔28〕，所以鐵在電子傳遞中充當著載體的重要作用。 外加ZVI可通過EPS的吸附、價態間的轉化等一系列途徑，使得部分鐵進入細胞成為微生物形成血紅素與鐵硫蛋白的重要原料，而粒徑越小的ZVI便更加容易被微生物吸附、利用，這也是50 nZVI系統中ETSA最高的原因所在。

2.3 污泥群落分析

2.3.1 微生物群落多樣性分析

活性污泥中微生物的種類越多，說明其微生物網絡越復雜，廢水的處理效能越穩定。通過Alpha多樣性分析對接種污泥及S1~S3中微生物多樣性進行表征，結果見表3。

表3 Alpha 多樣性指數Table 3 Alpha diversity index

由表3可知，4個樣本的Coverage值均在0.99以上，說明測序結果能夠可靠的表示樣品性質。表示種群生態優勢的指數Sobs在S0、S1和S2中相差不大，而S3的Sobs指數低于其他3個樣品，這表明S3中物種數量分布更加均勻，同時也說明優勢菌種的地位不突出。評估物種總數的Ace指數和Chao指數表明隨著ZVI粒徑的減小，物種總數在增加，但低于接種污泥。Shannon指數和Simpson指數都表明S1中微生物群落多樣性更高。

2.3.2 微生物群落組成

對系統中微生物種類進行高通量測序，門水平微生物群落組成見圖7。

圖7 門水平微生物群落組成Fig.7 Microbial community composition at the phylum level

由圖7可以看出，門水平上，Proteobacteria在4個樣品中均為優勢菌門，其豐度分別為29.042%、26.483%、30.811%和37.181%。Proteobacteria是大部分硝化菌和反硝化菌所屬的菌門〔29〕。Chloroflexi為僅次于Proteobacteria的微生物菌門，在4個樣品中豐度分別為22.427%、25.001%、20.051%和18.475%，Chloroflexi中多為兼性厭氧微生物，常存在于污泥菌膠團絮狀體內部，能夠起到充當骨架的作用，且此菌門中包含很多參與碳、氮、硫循環的微生物〔30〕。Chloroflexi相對豐度在S1中最大，在S3中最小，可以推測出粒徑小的ZVI更加能夠促進菌膠團及各類循環的微生物的穩定性。AnAOB主要存在的菌門Planctomycetota的相對豐度從接種污泥的2.867%分別變為5.628%、4.729%和1.057%。這表明小粒徑的ZVI對于AnAOB的富集有明顯的促進作用。

為了對系統中的功能微生物進行細致分析，對系統中脫氮微生物進行統計。主要對脫氮密切相關的AOB、NOB、AnAOB、自養反硝化菌（Autotrophic denitrifying bacteria，ADNB）、異養反硝化菌（Heterotrophic denitrifying bacteria，HDNB）在屬水平上的變化進行對比分析，結果見圖8。

圖8 屬水平脫氮微生物組成（a）及不同功能菌群的豐度（b）Fig.8 Composition of denitrifying microorganism at the genus level（a） and abundance of different functional groups （b）

在4個樣品中均只檢測出Nitrosomonas這一種AOB，豐度分別為0.127%、0.100%、0.196%和0.102%，加入ZVI的污泥與接種污泥差距不大。微氧狀態導致好氧菌AOB不會大量富集，AnAOB的富集進一步豐富了NH4+-N的去除途徑。Nitrospira作為一種適合在低營養條件下生長的NOB〔31〕，也是樣品中唯一被檢測出的NOB，在4個樣品中的相對豐度分別為0.102%、0.040%、0.112%和0.127%。ZVI投加粒徑的增加，NOB相對豐度隨之增加，使得系統中NO2--N的濃度降低。NOB與AnAOB產生底物競爭關系，從而影響AnAOB的富集。

AnAOB作為SNAD系統中主要的功能微生物之一，其豐度也是SNAD系統啟動成功運行穩定的重要參考指數，接種污泥來自運行5個月的SNAD系統，含有2.717%的AnAOB，分別是相對豐度為2.438%的Candidatus_Brocadia和0.279%的Candidatus_Kuenenia。在經過3種不同粒徑ZVI的介導馴化后，Candidatus_Brocadia的相對豐度變為4.650%、4.189%和0.782%，Candidatus_Kuenenia豐度變為0.692%、0.378%和0.088%。AnAOB在加入納米級的ZVI馴化后得到較好富集，這也是AOB豐度不高但NH4+-N去除率仍很高的原因。同時，從兩種AnAOB的相對豐度數據中可以看出，50 nZVI對AnAOB的富集促進作用更加顯著，而投加mZVI的污泥樣品中AnAOB豐度卻低于接種污泥樣品。這種現象的產生一方面由于S3中NOB豐度較高，與AnAOB產生底物競爭；另一方面，nZVI更容易被EPS吸附，從而被微生物利用。

樣品中還檢測出Hydrogenophaga（豐度分別為1.560%、1.592%、1.564%和1.832%）、Thiobacillus（豐度分別為0.404%、0.432%、0.411%和0.285%）、Microbacterium（豐度分別為0.171%、0.104%、0.157%和0.373%）3種ADNB，以及Tessaracoccus（豐度分別為0.755%、1.164%、0.806%和1.206%）和Thauera（豐度分別為0.221%、0.558%、0.495%和0.424%）兩種兼性自養反硝化微生物。從對不同功能菌豐度的統計中可以看出，在加入ZVI后，ADNB的豐度有輕微的上升，由接種污泥中的1.964%，分別增加到2.024%、1.975%和2.117%。由此可見，mZVI對ADNB的富集促進作用更加顯著。

同時樣品中還存在多種HDNB，相對豐度較高的主要是Gemmobacter、Denitratisoma和Azospira。Azospira具有固氮和反硝化功能，并且是可以在厭氧條件下依賴NO3-的Fe（Ⅱ）氧化劑〔32〕。在S1、S2和S3樣品中還檢測到豐度分別為0.558%、0.305%和1.011%的Ignavibacterium，明顯高于S0中豐度（0.089%），有研究表明其與AnAOB存在很強的合作關系〔33〕，Ignavibacterium中存在與鐵有關的鐵銨氧化菌〔34〕。

基于對微生物群落結構的分析，在加入nZVI后，AnAOB大量富集對脫氮起重要作用，而mZVI的影響下，系統中起到主要脫氮作用的是HDNB。

通過美吉生信云平臺采用Spearman方法對ZVI介導馴化后S1、S2和S3中脫氮微生物與高豐度的異養微生物進行相關性計算。圖9（a）為微生物相關性網絡，其中綠色線連接表示兩個物種呈現負相關，紅色線連接表示兩類微生物呈現正相關，不同的物種顏色表示微生物所屬的不同門類水平，不同物種節點的大小表示其在群落中的豐度大小；圖9（b）為微生物相關性熱圖，二者結合可以直觀地表現出物種之間的關系網絡。

圖9 豐度前30微生物相關性網絡（a）和豐度前30微生物相關性熱圖（b）Fig.9 Correlations network of the top 30 microbial in abundance （a）， and heat map of correlations among the top 30 microbial in abundance （b）

由圖9可以看出，微氧系統中重要的AnAOB與各種HDNB和ADNB之間顯示出復雜的網絡關系，組成系統中脫氮的主要途徑。系統中檢測到的兩種AnAOB（Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia）與HDNB的Gemmobacter、Denitratisoma、Thauera和norank_f_Comamonadaceae呈正相關，HDNB能夠利用系統中的有機物去除厭氧氨氧化反應產生的硝態氮，補充除厭氧氨氧化脫氮過程；與ADNB的Hydrogenophaga和Microbacterium均呈負相關，分析其原因在于Hydrogenophaga是以氫為電子供體的ADNB，而AnAOB適宜在偏堿性環境中生存；有報道稱Microbacterium為鐵機制的自養反硝化菌〔35〕，其與AnAOB可能會產生對鐵機制的競爭作用。AnAOB與SBR1031中的norank_f_A4b和norank_o_SBR1031正相關，SBR1031是異養菌屬，能夠利用各種有機小分子，能將氨轉化為硝酸鹽〔36〕。上述分析表明，在ZVI介導下的SNAD系統中ANAMMOX和異養反硝化的共同作用是脫氮的主要途徑。

2.3.3 群落功能預測分析

從微生物氧需求、生物膜形成以及革蘭氏性質對4個污泥樣品中的微生物功能進行分析，并進行BugBase表型預測，結果見圖10。

圖10 物種表型貢獻Fig.10 Phenotypic contribution of species

經過ZVI介導馴化后，污泥中好氧型菌屬整體豐度減少，但具有反硝化基因的好氧菌Thermus〔37〕豐度增加，尤其是50 nZVI介導的S1中。厭氧型菌屬在兩種尺寸nZVI介導下豐度增加，而在mZVI的介導下，厭氧型菌屬豐度減少，厭氧型菌屬豐度的變化主要是由AnAOB中Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia的變化造成。兼性厭氧型菌屬在ZVI介導馴化后豐度增加，且與ZVI粒徑呈現出正相關，其中Gemmobacter和norank_ f_Comamonadaceae兩種兼性厭氧反硝化菌增加最明顯。對菌群氧需求的分析表明，ZVI的介導會抑制好氧菌的生長，但mZVI能夠促進菌群中兼性厭氧菌的生長，nZVI能夠促進厭氧菌的生長。

生物膜形成菌屬在nZVI介導下豐度減少，主要變化在于unclassified_ f_Enterobacteriaceae和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium豐度減少；而在mZVI介導下生物膜形成菌屬豐度增加，主要變化在于Gemmobacter豐度增加。但前面EPS的數據表明，在ZVI介導下，微生物EPS不論是含量還是熒光強度都有所增加，分析產生這種現象的原因可能是nZVI抑制了一部分生物膜形成微生物的生長，但同時促進了另一部分生物膜形成菌的生長與活性，比如Gemmobacter在ZVI介導下豐度增長明顯。

活性污泥大部分微生物屬于革蘭氏陰性菌，在ZVI的介導下，革蘭氏陽性菌豐度減少，陰性菌豐度增加，且ZVI粒徑越小，這種介導作用就越明顯。

圖11為4個污泥樣品中微生物FAPROTAX功能預測熱圖。

圖11 FAPROTAX功能預測熱圖Fig.11 FAPROTAX functional prediction heat map

由圖11可以看出，在檢測到的50種功能細菌群落中，與氮代謝相關的菌群主要包括氮呼吸型（Nitrogen_respiration）、硝酸鹽還原型（Nitrate_reduction）、硝酸鹽呼吸型（Nitrate_respiration）、亞硝酸鹽呼吸型（Nitrite_respiration）、厭氧氨氧化型（Anammox）、氮固定型（Nitrogen_fixation）、硝酸鹽反硝化型（Nitrate_denitrification）、亞硝酸鹽反硝化型（Nitrite_denitrification）、氧化亞氮反硝化型（Nitrous_oxide denitrification）、反硝化型（Denitrification）10種類型。氮呼吸型、硝酸鹽還原型、硝酸鹽呼吸型、亞硝酸鹽呼吸型、厭氧氨氧化型為主要的氮代謝菌群。氮呼吸型、硝酸鹽還原型、硝酸鹽呼吸型菌群在ZVI介導下豐度增加，且硝酸鹽還原型、硝酸鹽呼吸型菌群的豐度隨著ZVI粒徑的增大而增大，在mZVI介導的S3中硝酸鹽還原與硝酸鹽呼吸菌群豐度最大。亞硝酸鹽呼吸型和厭氧氨氧化型菌群在兩種粒徑的nZVI介導下豐度增加，在mZVI介導下豐度減少。以上分析與微生物物種組成中與BugBase表型預測的變化現象相符合。

3 結論

1）nZVI對TIN的去除效率影響較大，nZVI能夠顯著促進NO2--N的積累，更好地為AnAOB的富集提供底物條件。

2）通過對EPS含量的定量分析與3D-EEM的定性分析發現，ZVI對微生物EPS的產生有促進作用，其中50 nZVI更容易被EPS吸附，并在其促進下單位質量VSS中PN達到了44.193 mg/g，更有利于促進生物膜形成菌屬的活性，提高污泥絮體的穩定性。

3）與鐵元素密切相關的AMO和NOR酶活性在ZVI影響下均有明顯提升，其中mZVI對其促進作用較nZVI影響更加顯著，經mZVI馴化的污泥中AMO和NOR酶活性分別是接種污泥的5.513倍和7.860倍。電子傳遞活性在50 nZVI的促進下增長為接種污泥的1.484倍，明顯高于粒徑更大的ZVI的促進作用。

4）不同粒徑的ZVI對AnAOB的富集作用有不同程度的影響，在nZVI影響下Candidatus_Brocadia和Candidatus_Kuenenia兩種AnAOB的豐度分別從接種污泥中的2.438%和0.279%最高增長到4.650%和0.692%。

5）ZVI介導會促進對氧需求不敏感的微生物的富集，不同的是nZVI介導的SNAD系統中更容易形成由以Candidatus_Brocadia為代表的厭氧氨氧化與以Gemmobacter和norank_ f_Comamonadaceae為代表的兼性厭氧反硝化的共同脫氮過程。而mZVI介導下兼性厭氧反硝化為系統中的主要脫氮過程。