Noria-PEI改性PVA載體固定化溶菌酶用于污泥發酵產VFAs研究

王昊龍，張恩澤，王梓誠，趙瑜涵，南軍，孫彥民，馬愛靜，周立山，劉麗強，蔡巷，段興宇

（1.中海油天津化工研究設計院有限公司，天津300131；2.天津工業大學化學工程與技術學院，分離膜與膜過程國家重點實驗室，天津300387；3.河北工業大學化工學院，天津 300401）

我國污水處理廠普遍采用活性污泥法處理城鎮污水，活性污泥法利用微生物的代謝繁殖去除水中污染物，在此過程中必然產生大量剩余污泥。據統計，我國剩余污泥的復合增長率約為5%，預計2025年剩余污泥（含水率80%）總量將突破9 000萬t〔1〕。剩余污泥含有蛋白質、多糖、腐殖酸等有機物，同時還含有重金屬、病原體等有害物質，具有“污染”和“資源”雙重屬性，對剩余污泥進行妥善處置可實現污水處理過程“碳達峰、碳中和”的重要任務〔2〕。

厭氧消化是目前主流工藝中實現污泥碳回收的主要方式，包括水解、發酵酸化、產氫產乙酸和甲烷化4個階段，而微生物細胞破碎與胞外聚合物（EPS）水解是厭氧消化的限制步驟〔3〕。由于剩余污泥組分復雜，可生化性差，導致厭氧消化產甲烷率低且停留時間長（15~30 d），若對污泥進行預處理，控制反應至產揮發性脂肪酸（VFAs）階段，既可顯著縮短反應時間，又可實現有機碳的高價值回收，成為污泥厭氧消化研究的熱點〔4〕。污泥預處理包括水熱法、超聲微波機械法、高級氧化法、化學藥劑法等，相比而言，利用微生物或特定酶提高水解效率，因其溫和、環保、高效和不產生有毒副作用等特點而備受青睞〔5-8〕。

溶菌酶又稱N-乙酰胞壁質聚糖水解酶，是一種具有溶解微生物細胞壁功能酶類的統稱，目前工業溶菌酶多為蛋清溶菌酶，由129個氨基酸組成的單肽鏈蛋白質。溶菌酶可高效降解由肽聚糖和糖脂類物質組成的細胞壁，促進微生物胞內有機質溶出〔9〕。Gaige LIU等〔10〕進行了溶菌酶強化剩余污泥水解性能研究，結果表明，逐步提高溶菌酶的劑量（單位質量SS中溶菌酶質量從0到150 mg/g），總EPS中多糖質量濃度由84.6 mg/L增至143.2 mg/L，蛋白質質量濃度由325.0 mg/L增至987.7 mg/L，水解效能提升顯著。Xiuqin CAO等〔11〕報道了水熱和溶菌酶共預處理可促進污泥厭氧發酵，結果顯示相比于未預處理污泥，最大可溶性生化需氧量（SCOD）和產氣量分別提升95.89%和130.58%。溶菌酶雖然具有高催化活性、良好選擇性及水溶性，然而，其工業化應用仍受到回收困難和催化穩定性差等限制。為此研究者提出采用固定化技術解決上述問題，通過吸附法、包埋法或交聯法將酶固定在支撐材料上，支撐材料包括聚合物基質、多孔材料、碳納米材料、金屬有機框架（MOFs）、磁性材料等〔12-16〕。聚乙烯醇（PVA）價格低廉、機械強度高、可定制化成型，被廣泛用做生物載體，已商業化應用于生物菌劑固定〔17〕，但其固定酶的能力較差，在生物酶固定化領域研究較少，通過引入含氧基團、氨基及構建網狀結構可有效提高PVA的固載酶能力和酶的穩定性〔18〕。水輪酚（Noria）是一種梯狀連接的雙環低聚物，具有多個親水性酚羥基官能團，同時其內部的空腔近似立體圓柱狀，聚乙烯亞胺（PEI）具有豐富的伯仲叔胺基團，Noria和PEI的反應產物具良好的生物酶相容性〔19-20〕。

因此，本研究采用Noria-PEI共沉積法對PVA載體進行改性，以提高其固定溶菌酶能力，對比分析了游離酶、固定酶對剩余污泥厭氧發酵產酸的效果；并對發酵系統中剩余污泥的粒徑分布和微生物菌落進行分析，以揭示固定化酶促進剩余污泥發酵產酸機理。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用剩余污泥取自天津市某污水處理廠二沉池，污泥取回后靜置48 h，將棄去上清液后的污泥作為實驗用剩余污泥，其性質如下：pH為7.18±0.16，TSS為（7 124±458） mg/L，VSS為（4 516±296） mg/L，TCOD為（6 185±355） mg/L，SCOD為（103±12） mg/L。實驗所用溶菌酶購自河北某生物技術有限公司，酶活性2 000 U/g，適宜pH 5.5~8.5，適宜溫度30~55 ℃。

聚乙烯亞胺（M.W. 70 000，50%水溶液）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，間苯二酚（AR）和戊二醛50%（AR）購自天津市大茂化學試劑廠，2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES，99%）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Noria的合成

H. KUDO等〔21〕首次用一鍋法以高收率合成了Noria，本研究參考該方案制備Noria。在四口圓底燒瓶中加入22 g間苯二酚，接著注入45 mL無水乙醇，攪拌，繼而加入30 mL濃鹽酸，并緩慢滴入5 g戊二醛。將混合物升溫至80 ℃，經過48 h反應后，將體系冷卻至室溫，注入150 mL甲醇使產物析出沉淀（12 h）。隨后進行過濾，在60 ℃真空條件下干燥12 h去除多余溶劑，獲得亮黃色Noria產物。具體合成的化學反應如圖1所示。

圖1 Noria合成反應Fig.1 The synthesis of Noria

1.2.2 Noria-PEI改性PVA載體制備及溶菌酶固載

在10 mL去離子水中加入3 g PEI將其溶解。將1 g Noria碾碎成小顆粒，隨后將Noria顆粒加入NaOH（0.28 mol/L）溶液中溶解，并在持續攪拌下加入PEI溶液，制備Noria-PEI浸漬改性溶液。隨后直接將PVA載體材料浸入Noria-PEI溶液中改性5 min，使用去離子水多次沖洗后于60 ℃真空干燥備用，記作mPVA。

稱取0.1 g mPVA載體，置于15.0 mL pH=6.2的MES緩沖溶液中活化30 min，用去離子水清洗后加入到15 mL質量濃度為1 g/L溶菌酶溶液中，4 ℃下振蕩12 h，得到固定化溶菌酶。利用Bandford方法測定溶菌酶的固定化量，計算如式（1）所示。本研究中改性PVA的酶固載量為（74.3±0.1） mg/g，作為對比，未改性PVA的酶固載量為（20.8±0.3） mg/g。

式中：w——溶菌酶固定化量，mg/g；

m1——溶菌酶的初始質量，mg；

m2——聚乙烯醇載體的質量，g；

C——待測上清液中溶菌酶的質量濃度，mg/L；

V——待測上清液總體積，L。

1.2.3 剩余污泥厭氧發酵產酸

將實驗用剩余污泥加至3個相同的反應器中，未投加酶的反應器為空白組，另外兩個反應器中分別按照污泥VSS的1%（質量分數）投加游離酶和固定酶，充入足量氮氣，維持溫度（35±1） ℃和攪拌（120±10） r/min的條件下進行厭氧消化，定期取樣分析。

1.3 測試方法

1.3.1 Noria和改性PVA載體表征

對合成的Noria單體用紅外光譜儀（FT-IR，德國Bruker公司，Vertex7.0）分析其化學組成，并采用X衍射分析儀（XRD，荷蘭PANalytical公司，X’Pert PRO）分析其晶體結構，最后取痕量Noria顆粒溶解于二甲基亞砜-d6（DMSO-d6）中對其進行液體核磁共振氫譜（1H NMR，德國Bruker公司，AV500）測試。用X射線光電子能譜儀（XPS，美國Thermo Fisher公司，Escalab 250Xi）分別對改性前后PVA載體表面化學組成變化進行分析。

1.3.2 厭氧消化產物的測定

SCOD采用哈希試劑法進行測定，可溶性蛋白含量采用Lowry-Folin法以牛血清蛋白為標準物質檢測，多糖濃度采用苯酚-硫酸分光光度法測定，VFAs采用氣相色譜法（Agilent，7890A）進行測定，具體步驟參考文獻〔22〕，污泥粒徑采用激光粒度儀測定（MASTERSIZER 2000，Malvern，英國），每個樣品平行測定3次。

1.3.3 微生物分析

使用快速DNASPIN試劑盒（MPBiomedicals，SantaAna，CA，USA）提取污泥DNA，用真/古細菌兼容通用前端引物341F（5’-CCTACGGGRBGCAGCAG-3’）和后端806R（5’-GGACTACHVGGGTATC TA-3’）對細菌16S rRNA基因的V3~V4區進行PCR擴增，采用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE 250進行測序。

2 結果與討論

2.1 Noria-PEI改性PVA載體表征

2.1.1 Noira單體的表征

為驗證Noria單體的合成，對合成產物進行了FT-IR、XRD和1H NMR表征，見圖2。

圖2 Noria的FT-IR、XRD及1H NMRFig.2 FT-IR，XRD and 1H NMR of Noria

由圖2（a）可以看出，圖中1 617、1 503、1 440 cm-1處的吸收峰為苯環上C= = C的伸縮振動峰，2 934 cm-1和2 860 cm-1的吸收峰對應于—CH2—，2 903 cm-1處的吸收峰則對應C—H鍵的伸縮振動峰，3 345 cm-1處較強的峰來自于Noria的24個—OH吸收振動〔23〕。

Noria單體的XRD如圖2（b）所示，在2θ=10.1°出現了一較強的衍射峰，正對應Noria分子的內部空腔，與化學結構式相對應。

由圖2（c）可知，Noira的1H NMR主要化學位移歸屬如下：δ=（1.09~1.66）×10-6（—CH2CH2CH2—），δ=4.16×10-6（>CH—），δ=6.19×10-6（Ar—H），δ=（8.94~9.37）×10-6（—OH），以上結果對照文獻〔23〕可知Noria被成功合成。

2.1.2 Noria-PEI浸漬PVA載體變化

采用XPS對改性前后的PVA載體進行表面化學組成分析，結果如圖3所示。

圖3 PVA、mPVA的XPS（a）和mPVA的N 1 s分峰譜（b）Fig.3 XPS of PVA and mPVA （a） and N 1 s core-level of mPVA （b）

由圖3可以看出，Noria-PEI成功負載使mPVA載體的XPS能譜曲線在396 eV處出現了N 1s峰。此外，對mPVA載體的N元素進行分峰如圖3（b），出現分別來自于PEI內部的C—N單鍵和Noria-PEI發生席夫堿反應生成的C= = N雙鍵〔24〕的兩個峰，印證了Noria-PEI在PVA上的共沉積。

如圖4所示，左為原始PVA載體，右為改性后的mPVA載體。可以顯著觀察到載體表面顏色由白色變為黃棕色。

圖4 原始PVA載體和改性后的mPVA載體Fig.4 Original PVA carrier and modified mPVA carrier

2.2 剩余污泥水解效能分析

剩余污泥溶胞水解過程中微生物的有機質被降解成可溶性有機物，圖5以SCOD質量濃度隨時間的變化來反映剩余污泥厭氧消化降解程度。

圖5 各系統中SCOD隨時間變化Fig.5 The variation of SCOD with time in each system

由圖5可知，各組SCOD在12 d內均呈現先升高后降低的趨勢，但是最高SCOD質量濃度差異較大，游離酶和固定酶的最高SCOD質量濃度分別為2 387.5 mg/L和2 892.4 mg/L，是空白組（845.4 mg/L）的2.8倍和3.4倍，結果表明溶菌酶可顯著提高污泥絮凝體的瓦解和微生物細胞的水解，促使有機質溶出并被降解為小分子可溶性有機物，固定酶對剩余污泥中有機質的水解有更好的效果。此外，空白組、游離酶組和固定酶組獲得最高SCOD質量濃度的時間也同樣有所差距，分別為6 d、48 h和36 h，且在初期發酵的24 h內，游離酶和固定酶的發酵系統表現出了快速水解過程。生物酶作為催化中心，可與有機質通過特定化學鍵形成過渡態，從而降低反應活化能，促進有機質的水解。固定酶因在Noria-PEI改性PVA載體材料的網狀結構保護下，能在厭氧環境中保持比游離酶更高的催化活性，而游離酶自身的蛋白質結構在長期發酵過程中易變性失活。與本研究相似，Juanjuan WAN等〔25〕對比了以Fe3O4@SiO2-NH2為載體的固定酶和游離酶對污泥厭氧發酵溶出有機質的影響，結果表明，固定酶系統中SCOD的最高濃度〔（5.04±0.02） g/L，第8小時〕大于游離酶系統〔（3.45±0.04） g/L，第64小時〕，且發酵時間顯著縮短。Qinxue YANG等〔18〕制備了氧化石墨烯聚乙烯醇水凝膠（GO@PVA-H）用于固載過氧化物酶，GO@PVA-H的籠狀三維網絡結構很好地保護了固載酶，使其表現出優于游離酶的穩定性和高效性。隨著發酵的進行，SCOD的濃度逐漸降低，這是由于微生物自身代謝消耗部分溶解性有機物。

胞外聚合物（EPS）及溶解態微生物代謝產物主要由多糖化合物和蛋白質組成，兩者之和占剩余污泥VSS總量的90%以上〔26〕。圖6為厭氧消化過程中多糖和蛋白質的變化。

圖6 各系統中多糖（a）和蛋白質（b）濃度隨時間變化情況Fig.6 The variation of polysaccharide （a） and protein （b）with time in each system

由圖6可以看出，厭氧消化12 d內，空白組、游離酶組、固定酶組上清液中多糖最高質量濃度分別為42.6、111.2、131.4 mg/L，蛋白質最高質量濃度分別為100.5、259.0、359.3 mg/L，游離酶組、固定酶組中多糖和蛋白質均分別在48 h和36 h達到峰值，與SCOD的變化相似，說明大部分的溶出SCOD是由多糖和蛋白質的溶出所貢獻。溶菌酶能打破細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖間的β-1，4糖苷鍵，從而導致微生物細胞壁破裂〔27〕。同樣，以固定酶系統為例，在24 h的發酵時間內，多糖化合物和蛋白質快速升高，分別由19.7 mg/L上升至78.6 mg/L和由45.7 mg/L上升至258.3 mg/L。上清液中蛋白質的質量濃度顯著高于多糖類物質，說明溶解態蛋白質是剩余污泥厭氧發酵基質的主要貢獻者。

2.3 剩余污泥發酵產VFAs變化

在污泥發酵酸化階段，氨基酸和葡萄糖等水解產物轉化為揮發性脂肪酸（VFAs），VFAs的生成速率受底物濃度、功能微生物和傳質效率的影響。空白組、游離酶組和固定酶組中VFAs質量濃度在發酵酸化階段隨時間變化情況見圖7。

圖7 各系統中VFAs質量濃度隨時間變化Fig.7 The variation of VFAs with time in each system

由圖7可知，游離酶組和固定酶組的VFAs峰值均出現在第4天，而空白組的VFAs峰值出現在第8天，空白組、游離酶組、固定酶組的VFAs最高值分別為451.1、1 453.6、2 130.8 mg/L。溶菌酶的存在促使微生物內物質更易溶出，同時由于固定酶載體錯綜復雜的內部結構及其親水性特征，使得有機物的傳質阻力大幅降低，進而提高了污泥發酵產酸效率和產酸量。VFAs質量濃度達到峰值后隨時間增加逐漸下降，這是由于VFAs為產甲烷菌便于利用的底物，實驗過程中也檢測到有氣體產生。據報道，使用混合酶提高污泥降解能力，發酵15 d后VFAs的累積量（以COD計）達到最大值3 400 mg/L〔28〕，而本研究固定酶系統中VFAs最大質量濃度出現在第4天。

在整個發酵過程中，乙酸、丙酸主要由液相中蛋白質和多糖化合物發酵獲得，較長鏈的脂肪酸（如戊酸）主要來自于蛋白質發酵〔29〕。由圖7可知，空白組中乙酸和丙酸為總VFAs的38.3%~49.5%，而經生物酶調控后，乙酸和丙酸為總VFAs的主要組成部分，占據總VFAs的61.8%~80.7%。對于固定酶，在第4天產酸量最高時，乙酸占總VFAs的58.2%，占比高于游離酶組和空白組，丙酸占總VFAs的18.1%。由以上結果可知，固定酶系統發酵過程更為徹底，其他VFAs易于被厭氧微生物降解為乙酸，在促進剩余污泥發酵產SCOD、VFAs和小分子VFAs，固定酶的效果均為最好。

2.4 固定酶促污泥產酸機理分析

2.4.1 污泥粒徑分布

污泥粒徑分布常被作為指標參數用以表征剩余污泥的水解程度，一般認為污泥平均粒徑越小，污泥厭氧消化越容易進行。空白組在第8天的粒徑及游離酶組和固定酶組在第4天（對應最高產酸時間）的粒徑分布見圖8。

圖8 污泥粒徑分布Fig.8 Particle size distribution of sludge

由圖8可知，空白組、游離酶組、固定酶組系統中污泥的平均粒徑（D50）分別為81.026、45.016、42.957 μm，比表面積分別為0.279、0.394、0.413 m2/g。從微觀層面看，固定酶組將污泥絮體解離更為徹底，污泥粒徑減小和比表面積的增加會增大厭氧微生物與有機物的接觸反應幾率，從而強化污泥發酵產酸。

2.4.2 微生物群落

為表征微生物在不同發酵系統中組成和分布變化，解釋生物酶促污泥發酵產VFAs機理，對最高產VFAs時的微生物群落進行了16s rRNA測序，各發酵系統微生物在門水平上的豐度見圖9。

圖9 前20位微生物群落菌門Fig.9 Top 20 phyla of microbial communities

由圖9可以看出，投加游離酶組和固定酶組的污泥中微生物組成與空白組有明顯區別。空白組中變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，為總序列的42.6%，其他菌門的相對豐度均小于10%，物種分布較為均勻。在固定酶組中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides）的相對豐度分別為29.5%、16.1%和45.6%，占總序列的91.2%。在游離酶組中，厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）占總序列的86.9%，而擬桿菌門（Bacteroides）的相對豐度僅為3.12%。變形菌門（Proteobacteria）在污泥消化過程中消耗以乙酸、丙酸為主的揮發性脂肪酸〔30〕，在空白組中變形菌門（Proteobacteria）豐度的絕對優勢表明VFAs的積累能力差，大部分VFAs被消耗，與實驗結果相一致。厚壁菌門（Firmicutes）中的大多數微生物與蛋白質、纖維素等復雜有機物的降解和胞外酶活性有關，是降解復雜有機物的主要菌門〔31〕，擬桿菌門（Bacteroides）能夠產生纖維素酶、蛋白酶等水解酶，使污泥中的復雜碳水化合物初步分解為可溶性物質〔32〕，游離酶組和固定酶組中微生物在擬桿菌門（Bacteroides）的差異可能是由于固定酶能保持較高的酶活性，自身具有降解復雜有機物的能力。

在屬水平上，各發酵系統微生物群落分布也有明顯差異，見圖10。

圖10 前20位微生物群落菌屬Fig.10 Top 20 genera of microbial communities

由圖10可知，對照空白組，固定酶組屠場桿狀菌屬（Macellibacteroides）相對豐度由3.9%提升至32.5%，屠場桿狀菌屬（Macellibacteroides）是擬桿菌門的一種，具有將葡萄糖等多碳有機物降解為乙酸、正丁酸和異丁酸的能力；Petrimonas菌屬的相對豐度為15.6%，在厭氧消化過程中具有協同代謝能力，既可以直接傳遞電子，又具有代謝有機底物產乙酸的功能〔33〕；乳桿菌屬（Lactobacillus）和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）能代謝多糖化合物和蛋白質轉化為脂肪酸〔34〕。游離酶組中，除屠場桿狀菌屬（Macellibacteroides）和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）的相對豐度較高外，丙酸螺菌屬（Propionispira）的相對豐度為25.4%，丙酸螺菌屬（Propionispira）為一種水解產酸菌，可以將多糖類氧化為乙酸、丙酸等VFAs〔35〕。可見生物酶的投加可強化系統中厭氧消化菌屬的相對豐度，從而改善厭氧發酵底物環境，促進剩余污泥水解產酸過程。

3 結論

1）采用Noria和PEI共沉積法改性PVA載體，FT-IR、XRD和1H NMR表征證實了Noria的成功合成，XPS印證了Noria-PEI改性PVA使載體具有更豐富的官能團結構。

2）Noria-PEI改性PVA固定化溶菌酶可強化污泥發酵產SCOD，固定酶系統在36 h內SCOD達到最高質量濃度2 892.4 mg/L，相比空白組提升3.4倍（第6天），上清液中多糖和蛋白質的變化與SCOD相似，且蛋白質質量濃度明顯高于多糖類物質。

3）固定酶系統中VFAs質量濃度在第4天達到峰值2 130.8 mg/L，高于游離酶系統（1 453.6 mg/L）和空白組（451.1 mg/L），VFAs組分中乙酸和丙酸的占比達到61.8%~80.7%。

4）固定酶系統中污泥的平均粒徑為42.957 μm，比表面積為0.413 m2/g，表明固定酶強化了顆粒態污泥水解。在固定酶系統中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroides）等水解產酸菌門占比較高；在屬水平上，以屠場桿狀菌屬（Macellibacteroides）、Petrimonas菌屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）和嚴格梭菌屬（Clostridium_sensu_stricto_1）為主。