人體二十二碳六烯酸檢測方法的研究進展*

陸佳露,周春艷 綜述,余曉丹△ 審校

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心:1.發育行為兒科;2.轉化所,上海 200127

二十二碳六烯酸即DHA(C22:6n-3),是一種n-3多不飽和脂肪酸(PUFAs)。n-3 PUFAs為一種碳原子數為18～22個并含有2個及以上雙鍵的PUFAs,因第1個雙鍵出現在碳鏈甲基端的第3位,所以稱為n-3 PUFAs,也叫ω-3 PUFAs。DHA為人體內占比最高的n-3 PUFAs,不僅與嬰兒大腦生長和功能發育相關,在維持成人腦功能方面也有重要作用。因此,DHA素有“腦黃金”之稱。目前已報道與DHA缺乏相關的疾病包括兒童注意缺陷多動障礙、抑郁癥、精神分裂癥、孤獨癥等[1-2]。此外,DHA還具有預防心血管疾病、抗炎、抗癌及免疫調節等功能[3-4]。由此可見,保證人體充足的DHA對于維持其健康至關重要,尤其是在生命的早期階段。人體DHA主要來源于膳食,如攝入的魚油、海藻等[5]。另外,人體也可以通過α-亞麻酸(ALA,C18:3n-3)合成DHA。ALA也屬于n-3 PUFAs,其作為人體必需的脂肪酸之一同樣僅能從食物中獲得,但其大部分被氧化用以提供能量,僅有極少部分轉化成DHA,可見人體內合成的DHA并不能滿足日常生長、發育所需。因此,保證膳食中充分的DHA攝入是預防或改善因DHA不足或缺乏導致相關疾病的最有效方法。事實上,人體不同部位DHA水平不同,用于人體DHA水平檢測的方法也多種多樣。如何選取最佳的生物標本及合適的檢測方法對監測人體DHA水平至關重要。本文對近幾年發表的人體內DHA檢測方法的文章進行綜述,為準確評估人體DHA水平提供依據。

1 人體DHA分布

DHA廣泛分布于人體所有器官,其中神經組織大腦和視網膜部位的DHA水平最高[6]。有研究表明,DHA在大腦脂肪酸中的水平為12%～15%[7]。DHA還可酯化成甘油三酯儲藏在脂肪組織中,但水平極低。相對于神經組織,DHA在血液中的水平同樣較低。血液中的DHA主要分布在血漿中,以及單核細胞、紅細胞和血小板等細胞上,其中血漿中的DHA主要酯化成磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、膽固醇和甘油三酯等,并且與蛋白結合形成脂蛋白。紅細胞主要為磷脂形式的DHA。除神經組織、血液和脂肪組織外,DHA還廣泛分布在精子、肝臟、脾臟和心臟等部位,因取樣困難,一般不作為常規生物標本用于人體DHA水平檢測。

中樞神經系統部位的DHA水平最受關注,但因取樣困難,極少檢測該部位的DHA水平。脂肪組織中DHA周轉率較低且不受急性疾病的影響,被視為研究DHA攝入與人體DHA水平變化的最佳選擇。相對于脂肪組織,DHA在血漿或紅細胞膜中的周轉率較快,血漿中為幾天或幾十天,紅細胞膜中為幾個月[5]。因此,對短期DHA攝入后人體DHA水平變化的研究,血液標本則應用更廣。同時,血液標本還具有取樣容易,標本預處理簡單等優勢。另外,血漿和紅細胞中的DHA還是大腦、視網膜、肝臟和其他器官DHA的主要來源。因此,血漿和紅細胞磷脂DHA成為研究和分析人體DHA水平的常規生物材料[8]。

2 DHA檢測方法

最初,研究者們采用膳食調查法,如食物頻率問卷法(FFQ)、24 h膳食回顧法(24HRs)等對個體膳食中攝入的脂肪酸水平進行分析以了解人體血液DHA水平,但該方法存在回憶偏倚等不足,且無法準確反映人體DHA水平。目前主要采用色譜法,如薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)等對取自人體的生物材料進行脂肪酸水平檢測。色譜法涉及固定相和流動相,當流動相流過加有標本的固定相時,基于待分析物在2個相之間的水平比例不同最終以不同速度移動而互相分離開來。此外,核磁共振技術(NMR)、近紅外光譜技術(NIR)等也被用于脂肪酸的檢測中。本研究對以上幾種方法的原理、優勢和局限性進行匯總,見表1。

表1 4種DHA檢測方法的原理、優勢和局限性

2.1膳食調查法 膳食調查法是調查人群在一定時間內所攝入的能量和各種營養素的數量和質量,以判斷個體正常營養需要是否得到滿足的方法。目前應用于脂肪酸攝入量評價的有FFQ、24HRs等[9]。

2.1.1FFQ FFQ是通過問卷調查人群在過去限定的某段時間內某些食物的攝入頻率或食用量實現對能量或各種營養素攝入量進行計算,分為定性和定量兩類。定性FFQ是指某種食物特定時期內所食用的次數,不包括食物量和份額大小;定量FFQ是指某種食物在特定的時期內食用的平均估量,包括食物名稱、攝入頻率和攝入量信息。FFQ已廣泛用于調查飲食和疾病之間聯系的流行病學研究中。趙芮等[10]利用FFQ分析了上海市居民 n-3 PUFAs膳食攝入情況,提出上海市18歲以下、18～25歲、>25～60歲、>60歲4個年齡段人群預防心血管疾病的n-3 PUFAs推薦攝入量分別為1 032～2 569、759～3 170、419～3 569、209～3 729 mg/d。SALA-VILA等[11]通過FFQ對DHA攝入水平與攜帶阿爾茲海默病易感基因的中年人發生阿爾茲海默病的比率進行分析發現,在認知功能未受損的載脂蛋白E-ε4純合子中,較高的DHA攝入量與較輕的阿爾茲海默癥相關的病理改變相關。FFQ雖存在回憶偏倚,但其簡單易行、可操作性強且費用較低,適用于評估人群中期或長期膳食攝入情況。

2.1.224HRs 24HRs通過詢問調查對象過去24 h實際的膳食攝入情況,對其食物和營養素攝入量進行計算和評價。24HRs成熟、目的明確、易于實施、適用范圍廣,是目前人群營養調查使用最普遍的膳食調查方法[12]。ZHANG等[13]調取中國健康與營養調查報告中的中國9個省份的15 100名成年人(≥20歲)3 d 24 h膳食報告數據中魚類或海洋類食物中n-3 PUFAs攝入量,分析與2型糖尿病(T2DM)發生風險的關系,結果顯示,當前膳食海洋類來源的n-3 PUFAs攝入量太低(250 mg/d),95%的受試者并不能降低發生T2DM的風險。ZHANG等[13]利用同一批數據,分析n-6/n-3 PUFAs攝入比例與病死率的關系,結果顯示,n-6/n-3 PUFAs攝入比例在6～10時可降低病死率[14]。24HRs優點是調查對象負擔較小、配合度較高,但同時也存在相應要求,如需要對調查人員進行培訓,營養素需要精細計算等。24HRs局限性同樣為存在回憶偏倚、不適合記憶不清的老人或兒童、食物份額的重量很難被準確評估,比較適合用于家庭中個體食物消耗狀況的調查。在實際運用中,24HRs常與稱重法、FFQ等方法相結合以獲取更全面的信息。

2.2色譜法 色譜法檢測主要分為3個基本步驟:(1)提取標本中的脂肪酸;(2)待分析物的分離并將目標脂肪酸進行硅烷衍生化或甲酯化;(3)待分析物的鑒定和量化。其中步驟(1)為關鍵步驟,因生物組織中的脂質通常與蛋白質相互作用形成脂蛋白,脂質提取的成功往往決定了后續分析、鑒定和定量的準確程度。

2.2.1TLC TLC是基于待分析物在流動相和固定相(常為硅膠)中存在極性差異,實現對待檢測標本分離、鑒定和定量的一種層析分離技術,是最早用于脂質分析的色譜方法。方景泉等[15]采用高效TLC-GC-四極桿質譜聯合應用的方法對母乳中的各類脂肪酸水平進行檢測,其中DHA水平檢出限為2.3 mg/L。GUO等[16]采用TLC-GC研究攝入相應n-3 PUFAs制劑后人體血液(紅細胞和血漿)中的二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸和DHA的代謝差異。有研究采用TLC-GC研究男性弱精子和正常精子中的PUFAs水平,結果顯示弱精子DHA水平明顯下降[17]。TLC操作簡便、快速、價格便宜、通量高、標本前處理簡單,而流動相的多樣性可使復雜混合物得到有效分離。但薄層色譜板表面暴露于環境中在短時間內易被氧化而影響使用,精密度和重現性差,分離性能有限。目前TLC主要用于脂質分析前的標本制備并結合LC、GC或質譜技術(MS)等進行標本分析。

2.2.2GC GC的流動相為氣體,其原理同樣是利用物質在相對運動的2個相中具有不同的分配系數實現對物質的分離和檢測。目前用于生物標本中各類脂肪酸檢測方法主要包括與MS聯合GC(GC-MS)和GC-以火焰離子化檢測器(GC-FID)[18]。BROS-KONOPIELKO等[19]采用GC-FID檢測孕婦及其孩子血清標本中的n-3 PUFAs和n-6 PUFAs水平,比較了不同膳食補充劑的有效性。血漿中各類脂肪酸水平可用于監測糖尿病和糖尿病腎病患者疾病的發展進程,也可用于各種風險評估,如ZHANG等[20]研究妊娠期孕婦脂肪酸水平與妊娠期糖尿病亞型的關系時,采用GC定量分析血清脂肪酸發現,妊娠早期ALA和DHA水平升高明顯增加妊娠期空腹血糖升高女性發生妊娠期糖尿病的風險;汪潔云等[21]使用GC檢測肥胖兒童與健康兒童多不飽和脂肪酸水平時發現,肥胖兒童血清ω-3 PUFAs水平為(6.75±2.27)%,健康兒童為(10.35±3.30)%。GC有效率高、選擇性強、分析過程耗時短和標本量需求少等優點,目前為生物標本中各類脂肪酸檢測和定量的首選方法。GC-MS不僅可以提供更多的結構信息,同時因為MS完善的脂肪酸數據庫,該方法的有效性和選擇性也更高[18]。

2.2.3LC 目前普遍采用的是高效LC(HPLC),該方法基于待分析物在高壓下被固定相分離,隨后被相應的溶劑洗脫后實現對物質的檢測。檢測器主要包括紫外/可見光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。SUN等[22]采用LC-MS/MS對精神分裂癥患者血漿中未酯化的DHA進行檢測,利培酮單藥治療患者血漿DHA水平為(6.40±2.74)μg/mL,氯氮平單藥治療患者血漿DHA水平為(6.67±2.77)μg/mL,氯氮平和利培酮聯合治療患者血漿DHA水平為(5.93±2.75)μg/mL,對照健康人群血漿DHA水平為(12.31±4.89)μg/mL。目前,LC或HPLC檢測人體血液或組織中包括DHA在內的多不飽和脂肪酸通常需要對標本進行前處理,如甲基酯衍生化等,以提高檢測的靈敏度,因而會導致耗時較長。此外,相對于TLC,LC成本更高,與GC相比則存在溶劑消耗量較大和選擇性較低等缺點[18]。

2.3NMR NMR是一種用于結構解析或物質定量的分析技術,其原理是利用原子核的磁矩,在恒定磁場和高頻電磁波共同作用下且滿足一定條件時,發生共振吸收某一定頻率的射頻輻射的物理過程。其中1H和31P由于高度靈敏是NMR光譜進行脂肪酸定量分析的主要自旋原子核[23],13C由于靈敏度較低,13C在NMR中的應用相對較少。如THESING等[24]采用NMR對2 724例來自荷蘭抑郁和焦慮研究的受試者血漿DHA水平進行檢測,結果顯示,中位DHA水平為0.13 mmol/L。BARRILERO等[25]開發出一款針對1H NMR檢測人體血漿脂肪酸并進行定量的生物信息學工具(LipSpin),其定量的DHA結果與質譜結果呈明顯正相關(r=0.96,P=4.9×10-26)。

目前,因NMR設備昂貴且結果需要專業人士解讀,采用該設備分析人體脂肪酸水平并不普遍。此外,與MS定量脂肪酸比較,NMR存在靈敏度低、信號重疊、信號分離能力差等問題,其中31P NMR只能用于含P的脂肪酸或DHA分析[23]。但NMR的優勢在于重復性好、輕松辨別分子結構、儀器穩定性好、提供分子動力學信息和直接獲取定量數據,同時進行分析時不會破壞標本等。

2.4NIR NIR是一種利用近紅外譜區(650～1 100 nm)包含的光譜信息對有機物質水平及結構進行分析的技術,信息源主要是物質內部原子間振動的倍頻與組合頻。由于NIR在采樣技術上獨有的快速、無損、高效、低成本、采樣重現性好、測量方便、操作性強等優點,被廣泛用于農業、工業、醫學等多個領域。

目前,NIR在醫學方面的應用主要集中在對大腦功能的分析[26]、血液中各成分,如血糖、總膽固醇、甘油三酯、轉移酶和尿酸等的檢測及體液中的一些蛋白檢測,對DHA水平分析的研究較少見。已報道的主要針對三文魚、豬、牛、羊等動物肉或魚油、藻油中DHA水平檢測[27-28]。目前,還沒有基于近紅外的人體血液DHA水平檢測的報道,僅有部分采用傅里葉變換紅外光譜技術檢測人體口腔黏膜和人乳多不飽和脂肪酸水平的研究[29]。

目前,NIR檢測DHA技術有限,且因DHA水平較低,采用NIR檢測誤差通常相對于其他脂肪酸偏大。NIR也存在設備昂貴及結果解讀要求專業人士等不足。另外,NIR獲得的數據尚缺乏標準化的分析方法及無法進行絕對定量。

3 小結與展望

DHA作為人類必需的長鏈多不飽和脂肪酸之一,在人體無法自主合成。因此,準確檢測人體DHA水平成為預防因DHA不足或缺乏引起的疾病的關鍵。目前,DHA尚無標準化檢測方法,而已有的檢測方法多種多樣,這導致人體DHA水平檢測結果參差不齊,無法對DHA水平與疾病狀態相關性進行有效評估,更無法提出一個合理的健康人群DHA水平參考區間。為此,本研究對當前廣泛使用的人體DHA水平檢測方法進行綜述。

3.1優化色譜技術 目前,廣泛用于人體DHA水平評估和檢測的方法包括膳食調查法、色譜法及近幾年逐漸開始使用的NMR和NIR。其中膳食調查法雖然能夠對膳食攝入脂肪酸水平與疾病之間相關性進行評價,但膳食攝入量不能替代人體內實際的脂肪酸或DHA水平。而NMR和NIR設備昂貴,無法普遍使用。因此,當前最理想的可實現DHA水平標準化檢測的是色譜法,尤其是廣泛使用的GC。近年來,GC的檢測靈敏度、特異度或檢測下限因需要偶聯各種質譜儀[23],如三重四極桿質譜、時間飛行質譜或離子阱質譜等有了明顯改善。當下,色譜技術仍存在標本前處理時間久和脂肪酸內標缺乏導致脂肪酸定量不精準等問題。因此,色譜法DHA檢測方法仍需繼續優化以期更加簡潔、直接、精準。

3.2完善標本收取、保存和結果解讀的科學性 人體DHA水平的準確測量還存在其他干擾因素,如生物標本的保存方式。目前最常用于檢測DHA的生物標本為血漿和紅細胞。將紅細胞凍存于-20 ℃條件下數日,DHA水平明顯下降;當置于室溫或零度以上的冰箱,紅細胞中DHA水平則較為穩定;將標本凍存在-80 ℃條件下,紅細胞中的DHA水平可以穩定保持數年[30]。此外,盡管血漿或紅細胞中的DHA水平被廣泛用于人體DHA水平評估,然而因人群年齡、疾病狀態等差異,通過膳食攝入的DHA或使用DHA制劑補充的DHA與人體DHA水平的變化并非始終有相關性[31]。因此,根據實驗目的選擇合適的生物標本、注意標本保存方式并基于人群特點對檢測結果進行科學評估和分析,對準確獲取人體DHA水平并進行合理補充至關重要。

3.3提出健康人群DHA水平參考區間 目前國內外均少見推薦人體DHA水平正常參考區間的報道。今后有望在比較現有檢測方法優缺點的基礎上,國內各大醫院檢驗科能共同制訂1項DHA檢測標準化指南,就檢測標本類別、標本檢測相關設備及檢測結果的科學解讀等達成共識,并將該指南廣泛推廣應用,將為未來預防和治療DHA缺乏提供重要指導。