PFKFB4、CXCL8與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系及在預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值*

丁文艷,陳亞軍,王 平

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院檢驗(yàn)科,江蘇南京 210004;

2.江蘇省腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,江蘇南京 210009

宮頸癌(CESC)是威脅女性健康的常見(jiàn)婦科惡性腫瘤,發(fā)病率僅次于乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌[1]。腫瘤細(xì)胞侵襲力強(qiáng)、惡性程度高、易復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是限制CESC療效和影響預(yù)后的主要因素[2]。結(jié)合CESC患者的臨床病理特征,尋找新型有效的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)CESC不良預(yù)后,對(duì)指導(dǎo)臨床治療策略、監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)、提高療效具有十分重要的意義。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶 4(PFKFB4)基因編碼的蛋白質(zhì)通過(guò)糖酵解的變構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控糖酵解和磷酸戊糖途徑代謝通量,以滿足腫瘤細(xì)胞惡性增殖的生物需求,因此,PFKFB4可作為惡性腫瘤的預(yù)后標(biāo)志物及潛在的治療靶標(biāo),具有較高的臨床研究?jī)r(jià)值[3]。CXC趨化因子配體8(CXCL8)作為一種重要的多功能趨化細(xì)胞因子,以自分泌或旁分泌的方式與腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞相互作用,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成,基于此CXCL8有望成為某些惡性腫瘤具有預(yù)后評(píng)估價(jià)值的分子靶標(biāo)[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)CESC組織中PFKFB4、CXCL8的表達(dá)水平,分析PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平與CESC患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性,旨在明確二者在CESC患者不良預(yù)后評(píng)估中的臨床價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年12在南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院/南京市婦幼保健院(以下簡(jiǎn)稱本院)接受根治性手術(shù)的62例CESC患者作為研究對(duì)象;年齡36～70歲,平均(54.34±8.87)歲;TNM分期:Ⅰa/Ⅰb期38例,Ⅱa期24例;腫瘤最大徑≤3 cm 44例,>3 cm 18例;分化程度:低分化24例,中/高分化38例;宮頸浸潤(rùn)深度≥2/3 26例,宮頸浸潤(rùn)深度<2/3 36例;病理類型:鱗癌50例,非鱗癌12例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)參照《宮頸癌診斷與治療指南(第四版)》,經(jīng)陰道鏡檢查、宮頸組織活檢、術(shù)后病理學(xué)確診為CESC;(2)入組前未接受CESC相關(guān)放、化療和免疫治療;(3)臨床資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者;(2)合并心、肝、腎等器官功能不全者;(3)合并認(rèn)知障礙及精神性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)并獲得患者知情同意。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PFKFB4、CXCL8蛋白表達(dá) 采用免疫組織化學(xué)SP法(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)檢測(cè)PFKFB4、CXCL8蛋白表達(dá)水平。手術(shù)獲取宮頸癌組織置于-80 ℃超低溫冰箱保存。將腫瘤組織以10%甲醛溶液固定、脫水、包埋后,制成4～5 μm石蠟切片。PFKFB4和CXCL8抗體均購(gòu)于Abcam公司(稀釋度1∶200)。二氨基聯(lián)苯顯色后,蘇木精復(fù)染,以組織細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕褐色或棕黃色顆粒判定為PFKFB4和CXCL8蛋白陽(yáng)性表達(dá)。染色強(qiáng)度評(píng)分如下:0分(組織無(wú)著色);1分(組織呈淡黃染色);2分(組織呈棕黃染色);3分(組織呈棕褐染色)。陽(yáng)性細(xì)胞占比如下:0分(<5%),1分(5%～25%),2分(>25%～50%),3分(>50%～75%),4分(>75%)。以細(xì)胞染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞占比乘積>6分為高表達(dá),0～5分為低表達(dá)。

1.2.2CESC患者隨訪 隨訪時(shí)間為3年。隨訪采用門(mén)診復(fù)診或電話回訪方式,以首次手術(shù)日期為隨訪開(kāi)始時(shí)間,隨訪截止時(shí)間為2022年12月30日。將CESC患者術(shù)后復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移或死亡定義為預(yù)后不良。

1.2.3基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動(dòng)態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析PFKFB4、CXCL8基因在CESC中的表達(dá) 從GEPIA在線網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)上獲取306例CESC組織和13例正常對(duì)照組織中PFKFB4、CXCL8的表達(dá)情況。

1.2.4Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)PFKFB4、CXCL8基因與CESC患者預(yù)后的相關(guān)性分析 利用Kaplan-Meier Plotter平臺(tái)(http://www.kmplot.com)分析不同PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平CESC患者生存情況,組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率[n(%)]表示,采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較。采用多因素Logistic回歸模型分析CESC不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素,采用受試者工作特征(ROC)曲線對(duì)CESC不良預(yù)后模型的預(yù)測(cè)效能進(jìn)行評(píng)價(jià),采用Kaplan-Merier生存曲線及Log-rank檢驗(yàn)比較生存情況。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平CESC患者生存情況比較 通過(guò)GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)306例CESC組織和13例正常對(duì)照組織中PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平高于正常對(duì)照組織(P<0.05),見(jiàn)圖1。Kaplan-Meier曲線生存分析表明,隨著PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平升高,CESC患者生存率降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rankP=0.028、1.5×10-5),見(jiàn)圖2。PFKFB4和CXCL8的風(fēng)險(xiǎn)比(HR)分別為1.7、2.9(HR>1為疾病的危險(xiǎn)因素),提示PFKFB4和CXCL8高表達(dá)是CESC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素。

注:*P<0.05。

圖2 不同PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平CESC患者生存情況比較

2.2PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 CESC患者的臨床病理參數(shù)中,PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平在不同TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平在不同年齡、腫瘤最大徑、肌層浸潤(rùn)及病理類型CESC患者中比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同臨床病理參數(shù)CESC患者PFKFB4、CXCL8表達(dá)水平比較[n(%)]

2.3CESC患者不良預(yù)后的多因素分析 Logistic回歸分析結(jié)果顯示,TNMⅡa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度≥2/3、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PFKFB4、CXCL8高表達(dá)是CESC患者不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 影響CESC不良預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

2.4CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型評(píng)分規(guī)則及ROC曲線驗(yàn)證 采用參考邏輯評(píng)分法,將CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型轉(zhuǎn)化為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分體系。依據(jù)Logistic回歸方程中最小的偏回歸系數(shù)(1.310)為基數(shù),賦值為1分,其他變量賦值得分為每個(gè)自變量的偏回歸系數(shù)除以最小的偏回歸系數(shù)所的數(shù)值,取整數(shù)部分,總計(jì)評(píng)分為0～7分,其中,0～2分為低風(fēng)險(xiǎn),3～5分為中風(fēng)險(xiǎn),6～7分為高風(fēng)險(xiǎn)。采用ROC曲線對(duì)CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的能力進(jìn)行評(píng)估,AUC為0.872(95%CI:0.763～0.943,P<0.001),見(jiàn)圖3及表3。以Youden指數(shù)最大值為最佳臨界點(diǎn),該預(yù)測(cè)模型靈敏度為0.925 9,特異度為0.828 6,提示該模型對(duì)CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)效果較好。

表3 CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分

注:預(yù)警模型由TNM分期、分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PFKFB4表達(dá)、CXCL8表達(dá)共6項(xiàng)指標(biāo)構(gòu)建。

3 討 論

CESC發(fā)生發(fā)展是由多基因、多因素參與的復(fù)雜的病理生理過(guò)程,宮頸上皮細(xì)胞的非典型增生導(dǎo)致原位癌的形成,CESC在晚期表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性的惡性攻擊性行為,且部分CESC患者對(duì)化療不敏感,總體預(yù)后較差,5年生存率相對(duì)較低[5-7]。因此,結(jié)合CESC的分子生物學(xué)特征和組織病理學(xué)特征,迫切需要尋找敏感性好、特異性高的生物標(biāo)記物,早期預(yù)測(cè)腫瘤的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后,以獲得更好的治療策略,對(duì)CESC患者進(jìn)行指導(dǎo)治療。有報(bào)道顯示,PFKFB4基因促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的化療耐藥與不良預(yù)后關(guān)系密切,是小細(xì)胞肺癌潛在的治療靶點(diǎn)及化療敏感性的預(yù)測(cè)因子[8]。另一項(xiàng)研究表明,膀胱癌組織中PFKFB4基因高表達(dá),誘使腫瘤細(xì)胞代謝異常,沉默PFKFB4基因表達(dá)或使用PFKFB4基因的阻斷劑有望成為膀胱癌新型的治療策略,這為膀胱癌的治療提供新的研究方向[9]。HAN等[10]研究發(fā)現(xiàn),CXCL8基因表達(dá)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞基質(zhì)血管化密切相關(guān),由此促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,這在一定程度上解釋了CXCL8基因具有預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。

本研究從生物信息學(xué)分析及組織層面分析了PFKFB4和CXCL8的表達(dá)水平及其與CESC的臨床病理特征的緊密關(guān)系。在線GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示,CESC組織中PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組織。然而,GEPIA在線網(wǎng)站并未提供306例CESC組織的臨床病理特征,為了彌補(bǔ)GEPIA在線網(wǎng)站的不足之處,本研究對(duì)62例CESC患者組織中PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平與CESC患者臨床病理特征(包含年齡、腫瘤最大徑、TNM分期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤(rùn)及病理類型)的關(guān)系進(jìn)行分析。本研究結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)PFKFB4和CXCL8與CESC患者TNM Ⅱa期、腫瘤低分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度≥2/3及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。生存曲線分析結(jié)果顯示,隨著PFKFB4和CXCL8表達(dá)水平升高,患者的生存率降低。本研究將PFKFB4和CXCL8與CESC進(jìn)展聯(lián)系起來(lái),并將PFKFB4和CXCL8高表達(dá)作為CESC患者不良預(yù)后的重要危險(xiǎn)因素。PFKFB4參與了CESC的發(fā)生發(fā)展,可能與PFKFB4在許多實(shí)體腫瘤中過(guò)表達(dá),通過(guò)加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解通量,調(diào)控自噬形成和細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)血管生成、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等過(guò)程有關(guān)[11-13]。由此推測(cè),PFKFB4在CESC進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用,是CESC不良預(yù)后潛在的新型預(yù)測(cè)因子。CXCL8通過(guò)促進(jìn)上皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、引發(fā)中性粒細(xì)胞外陷阱的形成以及促進(jìn)血管生成途徑導(dǎo)致腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,研究顯示,CXCL8基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移具有很強(qiáng)的相關(guān)性并能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移[14-16]。由此推測(cè),CXCL8是另外一種潛在的CESC預(yù)后相關(guān)生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

綜上所述,CESC患者組織中PFKFB4、CXCL8呈高表達(dá),二者能夠成為T(mén)NM期、腫瘤分化程度、宮頸浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征的有力補(bǔ)充,由此構(gòu)建的CESC不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型具有良好的評(píng)估效果,能夠指導(dǎo)臨床醫(yī)生精準(zhǔn)評(píng)估CESC預(yù)后,有效監(jiān)測(cè)高風(fēng)險(xiǎn)人群,進(jìn)行早期預(yù)防和及時(shí)治療,有助于降低CESC復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn),因此具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。