高效液相色譜-串聯質譜法同時測定面粉中7種非法添加劑

王穎怡?吳玉田?鄒璐?孟春楊?鐘雪?周貽兵

摘 要：目的：建立一種分析面粉中7種非法添加劑的高效液相色譜-串聯質譜檢測方法。方法：試樣經乙腈∶水（1∶1，V∶V）提取、超聲、離心、氮吹濃縮后，經Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱分離、0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水和甲醇為流動相進行等度洗脫，采用多反應監測模式分析。結果：7種目標化合物在0.10～8.00 ng·mL-1呈良好的線性關系（R2＞0.990），檢出限為0.03～0.15 mg·kg-1，定量限為0.10～0.45 mg·kg-1；回收率在88.6%～104.3%，相對標準偏差在2.1%～5.8%（n=6）。結論：該方法簡便、靈敏、準確，可滿足小麥粉中7種非法添加物的同時檢測要求。

關鍵詞：高效液相色譜-串聯質譜法；小麥粉；非法添加劑；噻苯咪唑；苯甲羥肟酸

Simultaneous Determination of 7 Illegal Additives in Flour by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Abstract： Objective： To establish a high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the determination of 7 illegal additives in flour. Method： The samples were extracted by acetonitrile∶water （1∶1，V∶V）， concentrated by ultrasound， centrifugation and nitrogen blowing， separated by Agilent Eclipse Plus C18 RRHD column， and then eluted with 0.1% formic acid -5 mmol·L-1 ammonium formate water and methanol as mobile phase， and analyzed by multi-reaction monitoring mode. Result： There was a good linear relationship （R2＞0.990） between 0.10～8.00 ng·mL-1 for the 7 target compounds. The limit of detection was 0.03～0.15 mg·kg-1， and the limit of quantification was 0.10～0.45 mg·kg-1. The recoveries were 88.6% ～104.3%， and the relative standard deviations were 2.1%～5.8%（n=6）. Conclusion： The method is simple， sensitive and accurate， and can satisfy the simultaneous detection of 7 illegal additives in wheat flour.

Keywords： high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; wheat flour; illegal additives; thiobenzimidazole; benzohydroxamic acid

國內三大糧食作物之一的小麥是僅次于稻谷的第二大糧食作物，其含有大量碳水化合物和蛋白質，小麥粉（面粉）是其主要加工產品。國家統計局發布的資料表明，伴隨著國內小麥出產量的不斷增加，面粉的產量與消費量也在不斷增加，但其安全性與品質也曾出現過嚴重的問題[1]。隨著經濟增長與生活水平的提升，市場對面粉類產品的品質有著越來越嚴苛的標準[2]。部分生產者為了追求最大利益，利用化學制劑提高面粉質量，掩蓋其存在的質量問題，如使用硫脲作為增白劑、曲酸作為保鮮劑，以及使用噻二唑作為抗生素等非食品原料。此外，如果貯存環境或條件達不到國家規定的要求，小麥在貯藏期間易發霉變質，或者受到昆蟲與老鼠啃食，從而造成面粉污染。目前，不法商家為了避免小麥粉出現醒發、復色和黑點，向其中非法添入了苯甲羥肟酸以及三聚硫氰酸三鈉鹽成分，最終使產品達到出廠標準。上述行為不僅給消費者的身體健康帶來很大危害，還會對食品安全產生影響。原國家食藥監管總局2017年公布的《總局關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告》的第4條內容針對企業的生產過程明確規定，嚴格禁止將非食品原材料添入面粉中，如過氧化苯甲酰、次磷酸鈉、硫脲、間苯二酚、過硫酸鹽、噻二唑和曲酸等[3]。因此，在使用添加劑時，需堅持“安全、合理、有限、有效”的原則，嚴格執行國家相關規定。

當前，國內與國際上針對上述非法添加劑主要采用高效液相色譜法[4]、高效液相色譜-串聯質譜法[5-6]、近紅外光譜法[7]和電化學方法[8-9]等多種檢測手段。申科敏等[4]通過HPLC法測定小麥粉中的曲酸、噻二唑、硫脲等化學成分；國振等[10]建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測器同時測定小麥粉及面粉處理劑中的4種違法添加劑的方法，以上兩種方法的檢出限均偏高；林芳[6]以純水溶液為提取劑，超聲提取，建立超高效液相色譜串聯質譜法同時測定面粉中曲酸和噻二唑，雖然HPLC-MS/MS填補了曲酸和噻二唑檢測方法的空白，但在實際樣本篩查中需要進一步完善。除此之外，同時測定食品中噻苯咪唑和四環素等成分含量的報道仍然較少。因此，本研究采用HPLC-MS/MS篩查確認樣品中的硫脲、曲酸、噻苯咪唑、噻二唑、四環素、苯甲羥肟酸和三聚硫氰酸三鈉鹽7種化合物，通過含量檢測分析，了解市售小麥粉非法添加劑的污染水平，為食品安全監管提供有效手段和技術支持，全面保障小麥粉的安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為2022年貴陽市市售小麥粉樣品。

噻二唑（純度＞99.6%），北京振翔科技有限公司；四環素（純度＞95.5%）、三聚硫氰酸三鈉鹽（純度＞98.3%）、硫脲（純度＞99.2%）、苯甲基羥肟酸（純度＞99.9%）、曲酸（純度＞98.3%）和噻苯咪唑（純度＞99.9%），上海安譜實驗科技股份有限公司；乙腈和甲醇，美國飛世爾試劑公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 6470三重四極桿串聯質譜儀，美國Agilent公司；Agilent 1290超高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Milli-Q超純水設備，美國Merck；3-30KS臺式高速冷凍離心機，德國Sigma；MS3漩渦混勻設備，德國IKA；T460 H超聲波清洗設備，北京博勱行儀器。

1.3 前處理方法

稱取均質試樣5 g，于已備好的50 mL聚丙烯離心管中，加入5 mL水渦旋混勻后加入5 mL乙腈，漩渦混合30 s，超聲提取20 min，10 000 r·min-1離心10 min后（處理溫度小于5 ℃），移取1 mL上清液于離心管中，氮吹至近干即可。加入流動相

1 mL，經過渦旋混合均勻后，經0.22 ?m有機微孔濾膜過濾，待上機。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus C18 RRHD色譜柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；流動相：A為0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水溶液，B為甲醇溶液，A+B=74+26；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；等度洗脫。

1.4.2 質譜條件

離子源模式：電噴霧離子源（ESI）；正模式噴霧電壓：3 000 V；負模式噴霧電壓：2 500 V；鞘氣溫度：250 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；噴霧器：35 psi；鞘氣流速：11 L·min-1；采集模式：多反應監測MRM模式。化合物質譜參數見表1。

2 結果與分析

2.1 質譜及色譜條件的優化

化合物中的吸電子基團具有高度親電性，能夠吸引周圍電子，從而使H+易于生成[M+H]+類型的離子峰。例如，硫脲、噻苯咪唑結構中硫原子和氮原子上的孤對電子使得硫脲分子具有親電性，而苯甲羥肟酸、曲酸及四環素結構中含有酰胺、羰基等極性官能團，具有中等親電性。所以，上述化合物都采用了電噴霧離子正離子模式。由于噻二唑及三聚硫氰酸三鈉鹽具有雜環結構，電子云密度分布不均勻，使其容易丟失H+，從而產生[M-H]-型離子峰。因此，試驗擬采用電噴霧離子負離子模式。分別配制濃度均為500 ng·mL-1的7種化合物的標準溶液，在ESI+和ESI-模式下對目標物進行全掃描，通過對準分子離子的信號響應進行篩選，改善碎裂電壓和碰撞能量，獲得最佳的母離子豐度。在此基礎上，通過二級質譜掃描，篩選出兩個具有代表性的碎片離子，并對碰撞電壓進行改善，將豐度較高的子離子選擇為定量離子。

在優化色譜條件中，探究不同流動相（甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、0.1%甲酸水-乙腈溶液、0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水-甲醇溶液）對7種目標檢測物的分離情況。結果表明，使用甲醇-水溶液、乙腈-水溶液時，四環素峰發生峰拖尾現象；當流動相為0.1%甲酸水-乙腈溶液時，硫脲、三聚硫氰酸三鈉鹽的色譜峰形態發生分叉。因此，為改善峰形及分離度，試驗最終選擇0.1%甲酸-5 mmol·L-1甲酸銨水-甲醇溶液作為流動相，采用Agilent Eclipse Plus C18 RRHD（3.0 mm×150 mm）色譜柱，在等度洗脫方式下7種檢測物分離效果良好。

2.2 提取條件的優化

鑒于硫脲、曲酸和苯甲羥肟酸的強極性，分別研究了水、甲醇、甲醇-水（1∶1，V∶V）、乙腈以及乙腈-水（1∶1，V∶V）對化合物提取率的影響。結果表明，以水為溶劑進行提取試驗時，其提取強極性成分的效果最好，而對極性比較弱的噻二唑和噻苯咪唑則反之；而甲醇作為提取液時，曲酸及硫脲會產生嚴重的溶劑效應，如果利用甲醇-水（1∶1，V∶V）為溶劑進行提取，樣品溶液渾濁且呈凝膠狀，無法進行后續實驗；采用純乙腈溶液進行提取時，化合物的極性越大，提取率越低。相反極性相對較低的化合物如苯甲羥肟酸、噻二唑、噻苯咪唑等，其提取率均有所增加。綜上，本研究選擇水-乙腈（1∶1，V∶V）作為提取溶劑，確保色譜峰峰形的正常。

2.3 基質效應

在液質分析中，食品樣品中的內源性成分及樣品前處理過程中的外源性成分會影響目標物的離子化效率，從而導致基質效應的產生，常表現為基質增強或基質抑制。在此基礎上，使用提取后的空白樣品溶液進行加標，可評價化合物的基質效應（Matrix Effect，ME），依據基質效應數學模型進行評估，即ME=Y/X×100%。其中，Y為空白樣品基質中標準物質的響應均值，X為純溶劑中添加等量標準物質的響應均值[11-12]。結果表明，噻二唑、四環素、三聚硫氰酸三鈉鹽、硫脲、苯甲羥肟酸、曲酸和噻苯咪唑這7種目標分析物表現出較弱的基質效應并在可接受范圍，其結果分別為87%、110%、83%、91%、96%、105%和102%。為減少基質效應對定量分析的干擾，本文的定量方法使用基質匹配標準曲線法。

2.4 線性范圍、檢出限、定量限

根據1.3樣品前處理步驟，采用基質匹配標準曲線法，將7種違禁添加劑配制為一系列不同濃度的混合標準液，于最佳色譜和質譜條件下進樣，并繪制標準曲線。與此同時，本實驗通過在空白基質中添加低質量濃度混合標準溶液，按以上方法進行測定，經響應值3倍和10倍的信噪比計算檢出限和定量限。由表2可知，7個目標物均存在很好的線性關系（R2＞0.99）。

2.5 準確度及精密度

采用3種濃度水平的加標實驗，每個平行組測6次，計算回收率和相對標準差。由表3可知，目標化合物在不同濃度水平下的平均回收率在88.6%～104.3%，相對標準偏差在2.1%～5.8%，該方法的重復性良好，可滿足實際檢測的需要。

2.6 實際樣品檢測

隨機抽取市售包裝小麥粉樣品5批次、散裝小麥粉5批次，經樣品前處理后使用上述方法進行檢測。由表4可知，1批次小麥粉樣品檢測到苯甲羥肟酸殘留。《小麥粉》（GB/T 1355—2021）中規定，除了小麥與水之外，不得加入其他的輔料（如淀粉）以及食品添加劑（如酶制劑、增稠劑、乳化劑、還原劑等）。而實際樣品測定結果反映出在小麥粉生產加工、儲存、出售等過程中，或存在非法添加現象，因此需要對小麥粉進一步加強監管。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜串聯質譜法測定小麥粉樣品中7種非法添加劑的方法。結果表明，目標分析物在0.10～8.00 ng·mL-1具有良好的線性關系，其中噻苯咪唑、噻二唑、三聚硫氰酸三鈉鹽、曲酸、四環素的檢出限為0.15 mg·kg-1，定量限為0.45 mg·kg-1；硫脲及苯甲羥肟酸的檢出限為0.03 mg·kg-1，定量限為0.10 mg·kg-1。在不同加標濃度下，加標回收率在88.6%～104.3%，相對標準偏差在2.1%～5.8%，該方法的靈敏度及精密度良好，可滿足對大量和多樣化面粉中7種違禁添加劑快速篩查的需要，提高了檢驗工作的工作效率，同時能為制定相應的標準及監管機構的風險監測提供一定參考。

參考文獻

[1]關炳峰，杜瑞，陳紅，等.高效液相色譜法測定小麥粉中乙二胺四乙酸二鈉的方法優化[J].食品安全質量檢測學報，2020，11（2）：516-520.

[2]SUN R，ZHANG Z M，HU X J，et al.Effect of wheat germ flour addition on wheat flour， dough and Chinese steamed bread properties[J].J Cere Sci，2015，64：153-158.

[3]國家食品藥品監督管理總局.關于進一步加強小麥粉質量安全監管的公告（2017年第132）[EB/OL].（2017-11-02）[2024-01-18].http：//law.foodmate.net/show-192675.html.

[4]申科敏，胡曉琴，郭崇政.高效液相色譜法對小麥粉中4種禁用成分的測定[J].長治醫學院學報，2019，33（2）：98-101.

[5]黃娟，劉艷，丁濤，等.高效液相色譜-串聯質譜法測定食品中曲酸[J].色譜，2012，30（6）：578-583.

[6]林芳.超高效液相色譜串聯質譜法同時測定面粉中曲酸和噻二唑[J].現代食品，2020（14）：198-201.

[7]翟紋靜，徐振東，陳娟.雞肉中16種苯并咪唑及其代謝物殘留量快速檢測方法的研究[J].中國家禽，2018，40（18）：40-44.

[8]趙昕，張任，王偉，等.基于近紅外光譜快速定量檢測面粉中曲酸的方法建立簡[J].食品科學，2018，39（8）：249-255.

[9]HEIKHSHOAIEM，SHEIKHSHOAIE I，RANJBAR M.Voltammetric amplified sensor employing RuO2 nano-road and room temperature ionic liquid for amaranth analysis in food samples[J].Journal of Molecular Liquids，2017，231：597-601.

[10]國振，周霞，趙博，等.高效液相色譜法測定面粉及面粉處理劑中新型非法添加劑[J].分析化學，2021，49（4）：504-511.

[11]MATUSZEWSKI B K，CONSTANZER M L，CHAVEZ-ENG C M.Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS[J].Anal Chem，2003，75：3019-3030.

[12]王穎怡，吳玉田，孟春楊，等.HPLC-MS/MS技術同時測定雞蛋中5種抗球蟲藥[J].食品工業，2023，44（6）：291-294.