反復(fù)凍融法制備靈芝多糖工藝優(yōu)化、結(jié)構(gòu)表征及抗氧化活性分析

任洪飛，逄夢(mèng)玉，隋昕怡，劉 丹，楊飛燕，劉養(yǎng)山，張 景，杜秀菊

（聊城大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東聊城 252000）

靈芝（Ganodermalucidum），又稱瑞草，據(jù)《中國藥典》記載，主要有補(bǔ)氣安神，止咳平喘的功效[1]。研究表明，靈芝中含有400 多種生物活性化合物，包括多糖、三萜、甾醇、核苷酸、脂肪酸和多肽等[2]，是一種極佳的食藥同源真菌。多糖是靈芝的主要活性成分之一[3]，主要存在于靈芝子實(shí)體和菌絲體中[4]，具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、抗衰老[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、防治心血管疾病[10]、保肝護(hù)肝[11]、保護(hù)神經(jīng)[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等藥理活性及功能。

傳統(tǒng)靈芝多糖提取方法主要包括水提法、酶提法[14]、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法[15]、酸提法、堿提法等[16]，但存在提取率低、設(shè)備要求高、經(jīng)濟(jì)效益低等諸多弊端。改進(jìn)現(xiàn)有的靈芝多糖提取方法和探究新的提取方法以提高靈芝多糖的提取率、降低提取成本仍然具有重大意義。反復(fù)凍融法原理是在反復(fù)凍結(jié)和解凍過程中，細(xì)胞內(nèi)部的水分形成冰晶刺破細(xì)胞壁，使得胞內(nèi)物質(zhì)更容易透過細(xì)胞壁溶出。該技術(shù)條件溫和，不會(huì)破壞熱不穩(wěn)定性成分，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)上放大，是一種環(huán)境友好且經(jīng)濟(jì)的提取方法。目前已用于拐棗多糖[17]、刺麒麟菜多糖[18]、枸杞多糖[19]、油菜花粉多糖[20]和小球藻多糖[21]等多種多糖的提取，均取得了較好的效果。此外，反復(fù)凍融法已應(yīng)用于靈芝孢子粉的破壁[22]，但采用反復(fù)凍融提取靈芝子實(shí)體多糖及其工藝優(yōu)化鮮有報(bào)道。

本研究?jī)?yōu)化反復(fù)凍融法提取靈芝多糖（G.lucidumpolysaccharide freeze-thaw，GLPf）工藝，并利用乙醇對(duì)其進(jìn)行分級(jí)（GLPf30、GLPf60、GLPf80）。比較多糖的抗氧化活性并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，旨在篩選活性較高的多糖組分，為靈芝資源的合理開發(fā)奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實(shí)體 購于山東聊城冠縣，經(jīng)聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院戴明勛副教授鑒定為赤芝；單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma 公司；苯酚、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；濃硫酸 萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；葡萄糖、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨（ABTS）、抗壞血酸（vitamin C，VC）北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇 煙臺(tái)遠(yuǎn)東精細(xì)化工有限公司；三氯化鐵、三氯乙酸 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

xt-200 高速多功能粉碎機(jī) 浙江省紅太陽機(jī)電有限公司；HHS-22-8 電熱恒溫水浴鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵 河南省予華儀器有限公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；721 可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；GFL-140 電熱鼓風(fēng)干燥箱天津市萊玻特瑞儀器有限公司；Sorvall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機(jī)、Nicolet iS50 傅里葉紅外光譜儀 Thermo Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝樣品預(yù)處理 靈芝子實(shí)體預(yù)處理參照田淑雨等[23]的方法，略作改動(dòng)。靈芝子實(shí)體60 ℃烘干至恒重，粉碎，過80 目篩。按照1:15（g/mL）的比例加入95%的乙醇，浸泡24 h，重復(fù)2 次。濾渣60 ℃烘干后備用。

1.2.2 靈芝多糖的提取工藝 精確稱取3.0 g 已處理的靈芝子實(shí)體粉末，按照一定的溶脹比加入蒸餾水，充分混勻，置于-27 ℃冰箱中冷凍一定時(shí)間后取出，50 ℃水浴解凍10 min，冷卻至室溫后再次凍結(jié)，重復(fù)數(shù)次后利用熱水浸提。

靈芝多糖熱水浸提參照田淑雨等[15]的條件，略作改動(dòng)。選取料液比1:25（g/mL），提取時(shí)間2.5 h，提取溫度85 ℃。提取液4000 r/min 離心10 min，上清液抽濾2 次后蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，加入4 倍體積95%的乙醇，醇沉過夜。醇沉后5000 r/min 離心20 min，棄上清，沉淀冷凍干燥，即為靈芝粗多糖。

1.2.3 反復(fù)凍融法單因素實(shí)驗(yàn) 以粗多糖提取得率為考察指標(biāo)，固定溶脹比15:1（mL/g），凍融時(shí)間為2 h，凍融次數(shù)2 次，對(duì)反復(fù)凍融過程中的溶脹比、凍融時(shí)間和凍融次數(shù)三個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。固定其他凍融條件，分別選取5:1、10:1、15:1、20:1、25:1（mL/g）得溶脹比，1.5、2、2.5、3 和3.5 h得凍融時(shí)間，1、2、3、4、5 次得凍融次數(shù)，按照1.2.2 的提取條件進(jìn)行提取，得靈芝粗多糖。多糖提取得率公式計(jì)算如下：

式中，m 為靈芝多糖質(zhì)量（g）；M 為靈芝子實(shí)體粉末質(zhì)量（g）。

1.2.4 反復(fù)凍融法響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素結(jié)果，以溶脹比、凍融時(shí)間、凍融次數(shù)為考察因素，多糖提取得率為考察指標(biāo)，運(yùn)用Design-Expert 8.0.5 軟件，設(shè)計(jì)Box-Behnken 試驗(yàn)，采用3 因素3 水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，各因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.5 乙醇分級(jí)靈芝多糖 乙醇分級(jí)靈芝多糖參照張景等[24]的方法，略作改動(dòng)，具體如下：利用1.2.4 最優(yōu)條件提取獲得靈芝多糖提取液，濃縮后加入95%的乙醇，邊加邊攪拌均勻，至乙醇濃度達(dá)到30%，4 ℃靜置4 h 后，離心（5000 r/min，20 min），收集沉淀，透析（3500 Da），冷凍干燥后即得靈芝多糖GLPf30。同樣操作，將上清液加95%乙醇至乙醇濃度分別為60%和80%，分別獲得靈芝多糖組分GLPf60 和GLPf80。具體流程如圖1。

圖1 乙醇分級(jí)靈芝多糖制備圖Fig.1 Preparation diagram of ethanol graded Ganoderma lucidum polysaccharides

1.2.6 多糖和蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用苯酚-硫酸法[25]和DNS（3,5-二硝基水楊酸，3,5-Dinitrosalicylic acid）法[26]測(cè)定樣品中總糖含量和還原糖，分別根據(jù)公式（2）和公式（3）計(jì)算含量。多糖含量的計(jì)算按公式（4）進(jìn)行。

式中，C 為根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算得到的樣品總糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質(zhì)量（mg）。

式中，C 為根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算得到的樣品還原糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質(zhì)量（mg）。

蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法[27]測(cè)定，根據(jù)公式（5）進(jìn)行計(jì)算。

式中，C 為根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算得到的樣品蛋白質(zhì)量濃度（mg/mL）；V 為樣品溶液總體積（mL）；M 為粗多糖質(zhì)量（mg）。

1.2.7 抗氧化活性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除力測(cè)定 參考Wei 等[28]的方法，略作改動(dòng)。取1 mL 不同濃度樣品液（62.5、125、250、500、1000、1500 μg/mL），加入1 mL 0.2 mmol/L 的DPPH 無水乙醇溶液，混勻后避光反應(yīng)30 min，測(cè)定517 nm 處吸光值，記作Ai；分別將Ai中的DPPH 溶液、樣品溶液換成無水乙醇，同樣方法測(cè)得吸光值，分別記作Aj和A0。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.2.7.2 羥自由基清除力測(cè)定 參照Bulu 等[29]的方法，略作改動(dòng)。將1 mL 30%的H2O2溶液（4 mmol/L）、1 mL 不同濃度樣品液、1 mL FeSO4溶液（4 mmol/L）、1 mL 水楊酸無水乙醇溶液（4 mmol/mL）混勻，37 ℃避光反應(yīng)30 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液，測(cè)定510 nm 處吸光值，記作Ai。分別以無水乙醇代替Ai中的水楊酸無水乙醇溶液，以超純水代替Ai中的樣品液，其余步驟同Ai，測(cè)得吸光值，分別記作Aj和A0。以VC為陽性對(duì)照。羥自由基清除率公式如下：

1.2.7.3 總還原力測(cè)定 總還原力測(cè)定方法參照田淑雨等[30]，略作改動(dòng)。將1 mL 不同濃度樣品液與2 mL 1%的鐵氰化鉀溶液、2 mL 0.2 mol/L pH=6.6的PBS 緩沖液混合均勻，50 ℃恒溫20 min。再加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻，3000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液、2.5 mL 超純水和1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液混勻，靜置10 min，測(cè)700 nm 處吸光值。

1.2.7.4 ABTS+自由基清除力測(cè)定 ABTS 溶液配制及清除力測(cè)定參照劉養(yǎng)山等[31]的方法，略作改動(dòng)。將50 μL 樣品液與150 μL ABTS 溶液混合均勻，避光5 min 測(cè)定734 nm 吸光值，記作Ai。以PBS 緩沖液分別替代Ai中的ABTS 溶液和樣品液，測(cè)得吸光值分別記作Aj和A0。以VC為陽性對(duì)照。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下：

1.2.8 多糖結(jié)構(gòu)表征

1.2.8.1 傅里葉紅外光譜分析 利用傅里葉紅外光譜對(duì)五種單糖的特征性官能團(tuán)進(jìn)行分析，參照Xu等[5]的方法，略作改動(dòng)。取1 mg 多糖樣品混入100 mg KBr 粉末研磨均勻，壓片，掃描范圍為4000～400 cm-1，累積掃描32 次。

1.2.8.2 單糖組分分析 采用高效離子交換色譜（HPAEC）法進(jìn)行檢測(cè)，參照Li 等[32]的方法，略作改動(dòng)。稱取樣品2 mg 加入10 mL 3 mol/L 三氟乙酸，120 ℃水解6 h，冷卻減壓蒸干，加3 mL 甲醇蒸干，稀釋100 倍，過0.22 μm 的微孔濾膜。利用CarboPac PA20 陰離子交換分析柱，以2 mmol/mL 的NaOH溶液洗脫，流速0.45 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量25 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用 Excel 2021 整理，用SPSS Statistics 19、Origin 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置三個(gè)平行，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同字母（a～d）表示數(shù)據(jù)之間有顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖2a 可知，隨著溶脹比的增加，多糖提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在15:1（mL/g）時(shí)提取得率達(dá)到最高，之后下降，然后略有上升（圖2a）。可能原因是隨著溶脹比的增大，在一定時(shí)間內(nèi)無法形成足夠的冰晶刺破細(xì)胞壁，阻礙了多糖的溶出。所以選取溶脹比為15:1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 不同因素對(duì)靈芝多糖提取得率的影響Fig.2 Influence of different factors on Ganoderma lucidum polysaccharide extraction yield

隨著凍融時(shí)間的增加，多糖提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在2.5 h 時(shí)提取得率達(dá)到最大（圖2b）。分析其原因可能是隨著凍融時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)水結(jié)晶度升高，更容易刺破細(xì)胞壁，多糖釋放的阻力減小。但時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致分子熱運(yùn)動(dòng)長(zhǎng)時(shí)間處于抑制狀態(tài)，多糖難以溶出[32]。所以選取2.5 h 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

隨著凍融次數(shù)的增加，多糖提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在凍融2 次時(shí)提取得率達(dá)到最高（圖2c）。分析其原因可能是隨著凍融次數(shù)的增加，細(xì)胞破壁更加充分，提取得率提高。凍融次數(shù)過多導(dǎo)致機(jī)械強(qiáng)度過大，使得多糖結(jié)構(gòu)變化，提取得率降低[33]。所以凍融次數(shù)2 次進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken 試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。響應(yīng)面分析的回歸方程為：Y=2.64-0.012A+0.033B+0.12C-0.10A2-0.050B2-0.090C2+0.057AB-0.0075AC-0.063BC。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Designs and results of Box-Behnken test

根據(jù)表3 可知，響應(yīng)面模型P<0.01，表示該模型極其顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著。R2=0.9671，表明該模型擬合度較好；R2Adj=0.9247，表明該模型能夠解釋92.47%的響應(yīng)值變化。C.V.<10%，表明實(shí)驗(yàn)可信度和精確度較高；精密度>4 為合理[34]，模型精密度為13.633，符合精密度要求。

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface results

響應(yīng)面及等高線圖如圖3 所示。響應(yīng)面曲線越陡，交互作用越強(qiáng)；陡峭程度越低，交互作用越弱。等高線越趨于橢圓形，因素間的交互作用越強(qiáng)，越趨于圓形，交互作用較弱。由圖3 可以看出：BC 的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響最強(qiáng)，AB 次之，AC 最弱。

圖3 不同因素交互作用對(duì)靈芝多糖（GLPf）提取得率的影響Fig.3 Effect of different factor interactions on GLPf extraction yield

響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)條件為：溶脹比14.21:1（mL/g）、凍融時(shí)間2.38 h、凍融次數(shù)2.75 次，預(yù)測(cè)提取得率為2.68%；對(duì)預(yù)測(cè)條件稍作調(diào)整進(jìn)行驗(yàn)證，提取條件為：溶脹比14:1（mL/g）、凍融時(shí)間140 min、凍融次數(shù)3 次，多糖實(shí)際提取得率為2.71%±0.035%，與預(yù)測(cè)值誤差1.2%。

2.3 靈芝多糖抗氧化活性結(jié)果

5 種靈芝多糖清除DPPH 自由基試驗(yàn)結(jié)果如圖4（a）和表4 所示。利用不同濃度的樣品進(jìn)行測(cè)定，每種多糖對(duì)于DPPH 自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強(qiáng)。根據(jù)DPPH 自由基清除力的EC50值可知，清除能力大小排序?yàn)椋篏LPf30>GLPw>GLPf>GLPf80>GLPf60。GLPw 與GLPf 的DPPH 自由基清除能力接近，GLPf60 與GLPf80 的DPPH 自由基清除能力相對(duì)較弱，30%乙醇分級(jí)組分GLPf30 相較于其他4 種多糖具有較強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。

圖4 5 種靈芝多糖抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity of 5 polysaccharides from Ganoderma lucidum

表4 不同多糖抗氧化活性EC50 值（mg/mL）Table 4 EC50 values of antioxidant activity of different polysaccharides from Ganoderma lucidum (mg/mL)

5 種靈芝多糖清除羥自由基能力如圖4（b）和表4 所示。每種多糖對(duì)于羥自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強(qiáng)。清除能力大小排序?yàn)椋篏LPf30>GLPf60>GLPw>GLPf>GLPf80。GLPw 與GLPf 的羥自由基清除力相近，GLPf80 的清除力最弱，GLPf60 清除力略低于GLPf30，30%乙醇分級(jí)組分GLPf30 相較于其他4 種多糖具有較高的羥自由基清除能力。

以VC為陽性對(duì)照，5 種靈芝多糖清除ABTS+自由基能力如圖4（c）和表4 所示。每種多糖對(duì)于ABTS+自由基清除能力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強(qiáng)。ABTS+自由基清除力大小排序?yàn)椋篏LPf30>GLPf>GLPw>GLPf60≈GLPf80。5 種多糖均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力，GLPf30甚至高于陽性對(duì)照VC。

5 種靈芝多糖總還原力如圖4（d）和表4 所示。利用不同濃度的樣品進(jìn)行測(cè)定，每種多糖總還原力均具有濃度依賴性，濃度越高清除能力越強(qiáng)。GLPf30的總還原力最強(qiáng)（RP0.5AU=3.32），反復(fù)凍融提取所得的多糖GLPf 總還原力（RP0.5AU=4.84）略強(qiáng)于熱水浸提多糖GLPw（RP0.5AU=5.94）。

2.4 傅里葉紅外光譜分析

傅里葉紅外光譜法是根據(jù)不同波數(shù)吸收峰鑒定多糖分子中原子或官能團(tuán)振動(dòng)情況的方法，5 種多糖的紅外光譜結(jié)果如圖5 所示。各多糖的紅外吸收峰大致相似，而峰面積有較大差異，具體分析如下：

圖5 5 種靈芝多糖傅里葉紅外光譜圖Fig.5 FT-IR of five Ganoderma lucidum polysaccharides

首先對(duì)水提靈芝多糖GLPw 和凍融靈芝多糖GLPf 進(jìn)行分析。2 種多糖在3415.98 和3393.75 cm-1處存在較寬的吸收峰，為O-H 鍵伸縮振動(dòng)引起，表明多糖中含有羥基[35]；2927 cm-1左右存在的較窄的吸收峰為C-H 鍵振動(dòng)峰，表明多糖中含有-CH、-CH2、-CH3[36]；在1600 cm-1左右的吸收峰是是由于多糖結(jié)合水引起或C=O 的伸縮振動(dòng)峰[37]；1401.65 和1407.61 cm-1處的吸收峰是糖醛酸中的-COOH 伸縮振動(dòng)峰，暗示多糖中含有糖醛酸[38]，這與單糖組成結(jié)果相吻合；1322.44 和1321.96 cm-1為C-H 的振動(dòng)峰[5]；1261.21 和1245.79 cm-1為S=O 振動(dòng)峰，表明多糖中有硫酸鹽的存在[39]；GLPw 中1078.46、1047.16 cm-1和GLPf 中1077.78、1046.68 cm-1均為吡喃環(huán)中的糖苷鍵伸縮振動(dòng)引起的[40]；890.47 和894.33 cm-1為典型的β糖苷鍵吸收峰[41]；610.66 和613.09 cm-1有吸收峰，說明多糖中含有吡喃糖骨架[14]。

對(duì)乙醇分級(jí)所得3 種多糖（GLPf30、GLPf60、GLPf80）進(jìn)行分析。3416.69、3396.96、3416.69 cm-1處的吸收峰為羥基吸收峰；2924.81、2927.73、2927.15 cm-1處為C-H 鍵振動(dòng)峰；1600 cm-1左右的吸收峰是是由于多糖結(jié)合水引起或C=O 的伸縮振動(dòng)峰；1407.29、1409.15、1408.18 cm-1處的吸收峰暗示多糖中有糖醛酸的存在，與單糖組成結(jié)果相互佐證；1384.59（GLPf30）、1321.28（GLPf30）、1384.63（GLPf60）、1384.63（GLPf80）cm-1為C-H 的振動(dòng)峰；1262.18、1260.73、1260.25 cm-1為S=O 振 動(dòng)峰；1076.53、1043.30、1077.16、1045.71、1081.45、1050.53 cm-1均為吡喃環(huán)糖苷鍵伸縮振動(dòng)引起；890.47、889.99、893.84 cm-1為β糖苷鍵吸收峰；3 種多糖在500～900 cm-1均有吸收峰，說明多糖中含有吡喃糖骨架[36]。

綜上所述，5 種多糖均是以吡喃糖為骨架的酸性多糖，且均含有β構(gòu)象。5 種多糖的紅外吸收峰在4000～500 cm-1范圍內(nèi)非常相似，表明反復(fù)凍融和乙醇分級(jí)不會(huì)影響靈芝多糖的主要結(jié)構(gòu)。

2.5 靈芝多糖理化性質(zhì)和單糖組分分析

靈芝粗多糖中糖含量及蛋白含量如表5 所示，總糖、還原糖及蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6 所示。相較于熱水浸提法提取所得的靈芝多糖，反復(fù)凍融法所得的多糖中還原糖含量較低，蛋白含量也較低。有研究表明反復(fù)凍融法可用于多糖的脫蛋白[42]，為本研究結(jié)果提供了佐證。經(jīng)乙醇分級(jí)后所得三個(gè)組分中，GLPf30 質(zhì)量占比偏低，GLPf60 與GLPf80 占比相近。利用不同濃度的乙醇分級(jí)最終得到的各組分質(zhì)量占比有所不同，田淑雨等[30]利用乙醇分級(jí)得到GLP40、GLP60 和GLP80 的質(zhì)量占比分別為45%、29%、26%。不同組分的物理性狀也有所差異，五種多糖均以棕色為主，GLPf30 凍干后為片狀，而其余四種組分均為塊狀。

圖6 總糖（a）、還原糖（b）及蛋白質(zhì)（c）的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.6 Standard curves for total sugars (a),reducing sugars (b)and proteins (c)

表5 靈芝多糖的理化性質(zhì)與單糖組成Table 5 Analysis of polysaccharide content and monosaccharide composition

5 種多糖的HPAEC 結(jié)果如圖7 及表5 所示。5 種多糖均由巖藻糖（Fuc）、氨基葡萄糖（GlcN）、半乳糖（Gal）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、甘露糖（Man）六種單糖組成，且均含有少量的葡萄糖醛酸（GlcA）；GLPw、GLPf、GLPf30、GLPf60、GLPf80 摩爾比分別為2.70:15.06:5.43:37.44:2.38:4.31，3.04:13.72:6.11:41.31:2.63:4.69，1.73:20.79:1.60:27.95:1.18:1.96，5.32:13.74:12.39:40.38:3.24:5.86，2.85:14.08:6.27:49.71:4.11:6.22。不同提取方法以及乙醇分級(jí)后獲得多單糖組成種類相同，但摩爾比有較大差異。

圖7 5 種靈芝多糖的高效陰離子色譜圖Fig.7 High performance anion exchange chromatography of 5 polysaccharides from Ganoderma lucidum

3 討論與結(jié)論

本研究表明反復(fù)凍融法提取靈芝多糖（GLPf）比傳統(tǒng)的水提得率（2.36%）提高了14.8%，且凍融多糖（GLPf）的抗氧化活性高于水提多糖（GLPw），此方法可以提高靈芝多糖的提取得率及抗氧化活性。楊靜等[17]利用反復(fù)凍融與回流技術(shù)相結(jié)合提取拐棗多糖，最終拐棗中多糖的含量為1.68%；陳玉芳等[18]利用冷凍法提取刺麒麟菜多糖，多糖得率達(dá)到53.98%，硫酸酯基含量23.76%；溫梓辰等[19]利用反復(fù)凍融提取枸杞多糖，多糖融出率可達(dá)到15.651%。以上研究均表明反復(fù)凍融是一種有效的多糖提取方法，與本研究結(jié)論相吻合。

采用乙醇分級(jí)法，由GLPf 成功分離獲得3 種靈芝多糖，GLPf30 的抗氧化能力明顯高于其他兩種多糖（GLPf60 和GLPf80）及其前體物GLPf，是一種具有抗氧化活性潛力的多糖組分，值得進(jìn)一步深入研究。王宣東[43]利用乙醇分級(jí)得到3 種金耳多糖，發(fā)現(xiàn)TAP30 的抗氧化能力最強(qiáng)；常雪飛等[44]利用乙醇分級(jí)獲得3 種辣木葉多糖，發(fā)現(xiàn)80%乙醇分級(jí)組分MP-3 具有較強(qiáng)的抗氧化能力；景永帥等[45]利用乙醇對(duì)北沙參多糖進(jìn)行分級(jí)，發(fā)現(xiàn)50%乙醇分級(jí)所得多糖抗氧化性較強(qiáng)；吳楊洋等[46]分級(jí)得到四種蛹蟲草多糖，發(fā)現(xiàn)CMP60 的還原力和DPPH 自由基清除率均為最高，CMP80 的羥自由基的清除率最高。本研究再次表明，乙醇分級(jí)法對(duì)于篩選靈芝多糖的抗氧化活性部位是一個(gè)有效的方法。

HPAEC 和FT-IR 結(jié)果表明，GLPf30 與其他4 種多糖的單糖組分相似，但其摩爾比、理化性質(zhì)有明顯不同，尤其是GLPf30 的氨基葡萄糖（GlcN）占比為最高（達(dá)到37.66%）。推測(cè)這大概就是GLPf30的抗氧化活性明顯優(yōu)于其他組分的物質(zhì)基礎(chǔ)。

后續(xù)將對(duì)GLPf30 進(jìn)一步純化，對(duì)其一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行深度解析，并對(duì)其構(gòu)效關(guān)系做進(jìn)一步的研究。

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