富鍺木耳菌絲體不同溶劑提取物的體外抗氧化能力

朱雨馨，王文斌，王佳婧，朱蘊蘭,*，張翼飛，徐 薛，戴永琪

（1.徐州工程學院食品與生物工程學院，江蘇省食品生物加工工程技術研究中心，江蘇省食品資源開發(fā)與質量安全重點建設實驗室，江蘇徐州 221018；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210046）

木耳（Auriculariaauricula）又名黑木耳，屬擔子菌綱，木耳目，木耳科真菌[1]。木耳是一種營養(yǎng)豐富的藥食兩用真菌[2]，多分布于北半球溫帶氣候區(qū)域，主要分布在中國、日本、韓國等國家，其中以我國分布最多，我國木耳種植范圍比較廣泛，全國大部分地區(qū)均有種植[3]。木耳口感細嫩，風味特殊，富含蛋白質、多糖、維生素以及胡蘿卜素和鐵、磷等多種微量元素[3-4]，具有補氣、充饑、促進核酸代謝、免疫調節(jié)、降血糖、抗血栓、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞、抗氧化、抗炎、延緩衰老等功效[5-8]，可防止心肌梗塞以及預防和治療高脂血癥、動脈硬化、冠心病，減少心血管疾病的發(fā)病率[9-10]。此外還可以促進胃腸道的蠕動，有助于體內代謝廢物的排除，預防便秘和結腸癌的發(fā)生，同時可以防止肥胖并預防和治療多種老年疾病，是廣為人知的一種重要保健食品[11-12]。

鍺是一種自然界含量較少的微量元素，鍺在土壤中的含量大約是0.6～1.3 μg/g[13]，而在食用菌菌絲體中卻有含量很高的有機鍺[12,14]。有機鍺對癌細胞的生長和轉移有明顯的抑制效果，人體各組織器官中均有鍺的存在，許多酶及大腦均含有鍺，細胞壁、內質網(wǎng)、線粒體、高爾基體、溶酶體等亞細胞組分和細胞基質中也含有鍺[15]。成年人每日通過食物攝入鍺的量平均為0.4～3.5 mg，絕大部被胃腸道吸收，進入血液在體內循環(huán)[16]。人體的各組織對鍺沒有選擇性，并且無蓄積作用，無機鍺對人體毒性較大，而有機鍺對人體是有益的，是人體健康需要的微量元素，具有較好的提高人體免疫力的能力。研究表明有機鍺具有保健、延年益壽、抗衰老、抗腫瘤、降壓、強心等作用，還具有提高免疫力、參與核酸代謝、預防疾病、增白美容等功效[17-21]。食藥用真菌對微量元素具有極強的富集和轉化作用，并且能夠將無機態(tài)微量元素通過自身的代謝結合到大分子活性物質上轉化為有機態(tài)，從而降低了無機元素對人體的毒害作用，并提高了人體對微量元素的有效利用率[21-24]。食藥用真菌富集的有機態(tài)微量元素與蛋白質、氨基酸、多糖結合在一起形成化合物，易于被人體吸收利用[21]。微量元素被食藥用真菌富集后具有良好的穩(wěn)定性，便于貯存和運輸。富集微量元素的食用菌除了具有能量低、口味鮮美和營養(yǎng)豐富的特點以外，還能增加食用菌的多糖、蛋白質、氨基酸、鳥苷、胞苷等活性物質含量[21-24]。有關食用菌富集鍺的研究已有文獻報道[21-24]，但木耳富鍺菌絲體的抗氧化能力的研究還未見報道，本研究通過液體發(fā)酵富集培養(yǎng)獲得富鍺木耳菌絲體，通過不同極性的溶劑進行提取其活性物質，并研究其活性物質的體外抗氧化活性，為進一步研究和開發(fā)具有生物調節(jié)能力的功能性食品開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木耳（AuriculariaauriculaXE-987）徐州市豐縣大山河食用菌合作社提供；瓊脂粉、葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、磷酸二氫鉀、無水硫酸鎂、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、30%過氧化氫、濃鹽酸、無水乙醇、95%乙醇、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、氧化鍺、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、三羥甲基胺基甲烷、鄰二氮菲、Na2CO3、焦性沒食子酸、福林酚試劑等均為分析純、蘆丁標準品、白樺脂醇標準品 上海源葉生物科技有限公司。

HH-B11-500-BS-Ⅱ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；YXQ-LS-18SL 型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業(yè)有限公司；SW-CJ-1F 型無菌操作臺 蘇凈集團安泰公司；FA2104N 分析天平 上海精密科學儀器有限公司；HYG-型旋轉式搖床 上海欣蕊自動化設備有限公司；TU-1810 型紫外可見分光光度計、TAS-990 型原子吸收分光光度計 北京析普通用儀器有限責任公司；SENCO.R206 型旋轉蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；SHBIIIS 型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LGJ-18A 冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；XT-9900 型智能微波消解儀、XT-9700 型冷卻機中國上海新拓微波溶樣測試技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基及富鍺木耳培養(yǎng) 固體斜面培養(yǎng)基：4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉、2%瓊脂、去離子水。

液體搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖3%、蛋白胨1%、麥麩1%、豆粉1%、硫酸鎂0.15%、磷酸二氫鉀0.2%、氧化鍺（350 μg/mL）、去離子水。

富鍺木耳培養(yǎng)：將木耳斜面菌種轉接到新鮮斜面上，22 ℃恒溫培養(yǎng)至菌絲長滿試管，將固體斜面培養(yǎng)基中活化好的菌種取3～4 塊6～10 mm2大小的菌苔接入搖瓶培養(yǎng)基（裝樣量為100 mL/250 mL 三角瓶）中，22 ℃恒溫箱中靜置24 h，然后轉到回轉式恒溫調速搖瓶機中，25 ℃，轉速100 r/min，培養(yǎng)5～7 d。

1.2.2 富鍺木耳菌絲體有機鍺含量的測定 參考文獻[12]的方法進行測定。將富鍺木耳菌絲體干燥后用粉碎機粉碎，過60 目篩子，將粉末裝入透析袋流水透析2 d，經(jīng)微波消解儀消解后定容到10 mL，用原子吸收分光光度計在波長265.2 nm 下，測定樣品吸光值。通過與鍺標準曲線和回歸方程計算有機鍺含量。

1.2.3 富鍺木耳菌絲體提取物的制備

1.2.3.1 菌絲體的收集 將發(fā)酵液取出，真空抽濾，用玻璃棒輕輕撥動聚集濾紙上留下的菌絲。將菌絲體置于培養(yǎng)皿中，置于冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，得到干燥的菌絲體。

1.2.3.2 富鍺木耳菌絲體提取物的制備及得率計算

取干燥并研磨粉碎后的菌絲體干粉，取2 g 用濾紙包裹好。在濾紙上用棉線綁定包好，防止菌絲體干粉漏出。把濾紙包放入索氏提取器抽提筒中，分別用200 mL 去離子水，200 mL 70%乙醇，200 mL 乙酸乙酯加熱回流提取1 h，過濾得第一次提取物，將濾渣用同樣的方法獲得第二次、第三次提取物，合并3 次濾液。將提取后的合并濾液用旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至膏狀，放入冷凍干燥機中冷凍干燥24 h 后，取出稱重后，放入冰箱，備用。

式中：m：提取物干燥后質量（g）；M：提取用原料質量（g）。

1.2.4 相關活性物質含量測定 多糖含量測定：參考文獻[25]的方法，以95%乙醇調節(jié)醇沉濃度為70%進行沉淀多糖，以葡萄糖為標準品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。葡萄糖標準品吸光值A490nm 線性關系良好，測定的葡萄糖標準曲線回歸方程為y=0.0152X+0.0066，R2=0.9981。樣品中多糖含量以葡萄糖當量GCE（Glucose equivalent，GCE）表示，mg GCE/g DW。

總酚含量測定：參考文獻[26]的方法，以沒食子為標準品，采用福林-酚法測定樣品中的總酚含量。樣品中總酚含量以沒食子酸當量GAE（Gallic acid equivalent，GAE）表示，mg GAE/g DW。沒食子酸標準品在750 nm 下的吸光值A750nm 線性關系良好，標準曲線回歸方程為 y=104.34x-0.0243，R2=0.9974。

總黃酮含量測定：參考文獻[27]的方法，以蘆丁為標準品，采用Al（NO3）3法測定樣品中的黃酮含量。樣品中總黃酮含量以蘆丁當量RTE（Rutin equivalent，RTE）表示，mg RTE/g DW。蘆丁標準品在510 nm 下的吸光值A510nm 線性關系良好，得到的標準曲線方程為y=0.0029X+0.0052，R2=0.9983。

1.2.5 富鍺木耳提取物抗氧化能力測定 抗氧化能力的測定以正常培養(yǎng)的木耳菌絲體提取物為空白對照，以VC為陽性對照。

1.2.5.1 富鍺木耳提取物對超氧陰離子自由基清除能力測定 借鑒文獻[28]的方法，取0.05 mol/L Tris-HCI 緩沖液（pH8.2，25 ℃保溫）4.5 mL，加入供試提取液0.1 mL，混勻。加入預熱至25 ℃的2.25 mmol/L 鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L 鹽酸溶液配制）0.4 mL，迅速混勻。在25 ℃下，波長325 nm時，每隔0.5 min 測一次吸光度值，直到4 min 時停止，計算吸光度的變化值（?A樣品=A4min-A0min）。用水0.1 mL 代替供試提取液測定鄰苯三酚自氧化的速率（?A空白）。比較供試提取液抑制鄰苯三酚自氧化的程度，從而分析其對超氧陰離子自由基的清除能力的強弱。清除率的計算公式為：

式中：?A樣品為加入測試樣品的每分鐘吸光值的變化值；?A空白為加入水替代樣品的每分鐘吸光值的變化值。

1.2.5.2 富鍺木耳提取物對羥自由基清除能力測定

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法[29]：分別向3 支試管中加入1.5 mL 5 mmol/L 的鄰二氮菲溶液，然后同時加入4 mL pH7.4（0.75 mol/L）磷酸鈉鹽緩沖液，立即混勻，再馬上加入1 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，立即混勻。然后分別向試管1 中加入1 mL 待測的樣品溶液，試管2 和試管3 中加入1 mL 蒸餾水，再分別向試管1 和試管2 中加入1% H2O2溶液1.0 mL，試管3 中加入1 mL 蒸餾水，輕輕混勻，37 ℃，保溫1 h 后分別測定3 支試管中溶液在536 nm 波長下的吸光值，每組做3 個重復。

清除率的計算公式為：

式中：A2為加入樣品溶液及H2O2測得的吸光值；A1為不加樣品溶液而加H2O2測得的吸光值；A0為樣品溶液和H2O2兩者都不加測得的吸光值。

1.2.5.3 富鍺木耳提取液對DPPH 清除能力測定參考文獻[10]方法。將不同濃度的提取液2 mL 與2 mL 2×10-4mol/L DPPH 無水乙醇溶液均勻混合，30 min 后在525 nm 處測定其吸光值，同時用同法測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH 無水乙醇溶液與2 mL蒸餾水混合后的吸光值，以及2 mL 不同濃度提取液與2 mL 蒸餾水混合后的吸光值。

清除率計算公式為：

式中：Ai為加入樣品和DPPH 無水乙醇溶液測得的吸光值；Aj為加入樣品和蒸餾水測得的吸光值；A0為加入DPPH 無水乙醇溶液和蒸餾水測得的吸光值。

1.2.5.4 綜合抗氧化能力 參考文獻[30-31]方法。綜合抗氧化能力，以超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH 清除率進行評價，評價采用模糊數(shù)學中的隸屬函數(shù)值法和權重法，三種溶劑的權重系數(shù)均為1/3。每種溶劑提取物的抗氧化能力的隸屬函數(shù)值為對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH 清除能力的平均值。隸屬函數(shù)值按公式計算。

式中：R 為函數(shù)值；Xi為指標測定值；Xmax為所有測定樣品某一指標的最大值；Xmin為所有測定樣品某一指標的最小值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示；采用SPSS 21.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理和方差分析，P<0.05 表示差異顯著；采用皮爾森法（Pearson）進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 富鍺木耳有機鍺含量

經(jīng)測定鍺標準曲線回歸方程為y=0.063x+0.0038，R2=0.992，富鍺木耳菌絲體的有機鍺含量為542.83 μg/g。

2.2 富鍺木耳不同溶劑提取物的提取效果

經(jīng)測定，富鍺木耳不同溶劑提取物的得率實驗結果如表1 所示。

表1 富鍺木耳不同溶劑提取物得率Table 1 Extraction rates of germanium-rich A.auricula with different solvents

從表1 可以看出，水提取物的得率與70%乙醇提取物的得率沒有顯著差異（P>0.05）。乙酸乙酯提取物的得率最小，與其他兩種溶劑提取物的得率相比，存在極顯著差異（P<0.01）。隨著溶劑極性的降低，提取物的得率下降。根據(jù)化學的“相似相溶”原理，可能由于木耳的各種化學成分含量的差異，導致各物質在不同溶劑中溶解度不同，從而使各個溶劑的提取率不同。各種提取物相應成分含量如表2 所示。

從表2 可以看出，多糖含量最高的是水提物，其次是70%乙醇提取物?？偡雍孔罡叩氖且宜嵋阴ヌ崛∥?，然后是70%乙醇提取物，水提物的總酚含量最少。黃酮含量最高的是乙酸乙酯提取物，其次是70%乙醇提取物和水提物。各種不同溶劑提取物的多糖、總酚和總黃酮含量之間存在極顯著差異（P<0.01）。由于各種物質在不同極性中的溶解度不同，導致提取物含量不同。可能木耳成分中極性物質含量較多，導致水提物的得率較高。

2.3 富鍺木耳提取物抗氧化能力分析

2.3.1 富鍺木耳提取物對超氧陰離子自由基的清除作用 富鍺木耳不同溶劑不同濃度提取物對超氧陰離子自由基清除能力的實驗結果如圖1 所示。

圖1 不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除能力Fig.1 Scavenging ability of different solvent extracts on superoxide anion free radicals

由圖1 得知，富鍺木耳不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除率隨著提取物濃度的升高而升高。不同溶劑富鍺木耳提取物對超氧陰離子自由基的清除率彼此之間存在極顯著差異（P<0.01）。不同溶劑提取物中，水提取物對超氧陰離子自由基的清除率最強，在實驗濃度為9 mg/mL 時，水提取物對超氧陰離子自由基的清除率最高可達43.32%。對超氧陰離子自由基清除率次高的提取物是70%乙醇提取物，當實驗濃度為9 mg/mL 時，70%乙醇提物對超氧陰離子自由基的清除率達到39.36%。從實驗結果來看，富鍺木耳菌絲體不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除能力比空白對照高，且有極顯著差異（P<0.01）。但富鍺木耳不同溶劑提取物對超氧陰離子自由基的清除能力均沒有VC強。

2.3.2 富鍺木耳提取物對羥自由基的清除作用 富鍺木耳不同溶劑不同濃度提取物對羥自由基的清除效果的實驗結果如圖2 所示。

圖2 不同溶劑提取物對羥自由基的清除能力Fig.2 Hydroxyl radical scavenging ability of different solvent extracts

由圖2 可知，富鍺木耳不同溶劑提取物均對羥自由基有較好的清除作用。不同溶劑提取物對羥自由基的清除能力隨著提取物溶液濃度的升高而增強。通過比較可知，相同濃度的提取物，對羥自由基的清除能力的大小順序是：70%乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物。濃度為9 mg/mL 的70%乙醇提取物對羥自由基的清除率高達70.10%，可以看出70%乙醇提取物對羥自由基的清除能力較強。從圖2 可以看出，富鍺木耳菌絲體提取物在相同濃度情況下清除羥自由基的能力要比空白對照高，但富鍺木耳不同溶劑提取物對羥自由基的清除能力均沒有VC強。經(jīng)方差分析，不同溶劑富鍺木耳提取物對羥自由基的清除率彼此之間存在極顯著差異（P<0.01），且與空白對照之間也存在極顯著差異（P<0.01）。

2.3.3 富鍺木耳提取物對DPPH 的清除作用 富鍺木耳不同溶劑提取物對DPPH 的清除作用實驗結果如圖3 所示。

圖3 不同溶劑提取物對DPPH 自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of different solvent extracts on DPPH free radicals

由圖3 可知，富鍺木耳提取物對DPPH 的清除能力隨著提取物濃度的升高而升高，對于不同提取物清除DPPH 能力的大小順序是：70%乙醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物，不同提取物對DPPH 的清除率具有極顯著差異（P<0.01）。當提取物濃度為9 mg/mL 時，70%乙醇提取物對DPPH 的清除率最大為76.99%。通過與對照比較可以看出，富鍺木耳菌絲體提取物在相同濃度情況下對DPPH 清除能力極顯著（P<0.01）高于空白對照，但富鍺木耳不同溶劑提取物對DPPH 的清除能力均極顯著（P<0.01）低于VC。

2.3.4 富鍺木耳不同溶劑提取物綜合抗氧化能力分析 抗氧化能力是多項指標綜合作用的結果，用單一指標評價抗氧化能力不能全面反映其真實狀況，用多個指標進行綜合評價才能體現(xiàn)其綜合完整的抗氧化能力。為了較全面地反映其抗氧化性，運用隸屬函數(shù)法，綜合各項相關指標用平均隸屬函數(shù)值對其抗氧化能力進行綜合評價。通過對富鍺木耳不同溶劑提取物抗氧化能力的隸屬函數(shù)值的計算，結果如表3所示。

表3 不同溶劑提取物抗氧化能力隸屬函數(shù)值Table 3 Membership function values of antioxidant capacity of extracts with different solvents

通過表3 的隸屬函數(shù)值可以看出，70%乙醇提取物的綜合抗氧化能力最佳，其次是水提取物，抗氧化能力最小的是乙酸乙酯提取物?？偪寡趸芰﹄S著提取物濃度的增加而增加?？傮w看，極性大的溶劑提取物的抗氧化能力強，極性小的抗氧化能力弱一些。

2.3.5 相關性分析 根據(jù)對不同溶劑提取物各物質含量的測定，并對各物質含量與其抗氧化能力進行相關性分析，結果如表4 所示。

從表4 可以看出，在水提取物和70%乙醇提取物中，多糖含量與多酚含量和黃酮含量均有顯著正相關（P<0.05），多酚含量與黃酮含量也有顯著正相關（P<0.05）；水提取物中多酚和黃酮含量均與乙酸乙酯提取物中多酚含量有顯著正相關（P<0.05）。水提物中多糖、多酚和黃酮含量均與DPPH 自由基清除率有顯著正相關（P<0.05）。70%乙醇提取物中多酚和黃酮含量均與超氧陰離子自由基清除率有顯著正相關（P<0.05）；70%乙醇提取物中多酚含量與羥自由基清除率有顯著正相關（P<0.05）。乙酸乙酯提取物中多酚含量與DPPH 清除率有顯著正相關（P<0.05）。

綜合表4 分析結果，可以得出多糖、多酚和黃酮含量均與DPPH 清除率有正相關；多酚含量與超氧自由基、羥自由基和DPPH 自由基的清除率均有正相關；黃酮含量與超氧自由基和DPPH 自由基清除率有正相關。

3 結論

不同溶劑提取物的提取率不同，水與70%乙醇提取物的提取得率較高，且無顯著差異（P>0.05）。乙酸乙酯提取物的提取率較低。在水提取物中表現(xiàn)出多糖、多酚、黃酮含量的之間存在正相關。富鍺木耳菌絲體不同溶劑提取物對自由基在實驗濃度范圍內均有一定的清除能力，都表現(xiàn)出隨著提取物濃度的增加而增加的趨勢。多糖和多酚及黃酮對超氧陰離子自由基的清除率均有顯著影響（P<0.01），水提取物清除效果更顯著（P<0.01）。70%乙醇提取物中多酚含量與羥自由基清除率有顯著（P<0.05）正相關。多糖、多酚和黃酮含量均與DPPH 自由基清除率有顯著正相關（P<0.05），醇提物對DPPH 清除率的影響更顯著（P<0.05）。在不同溶劑提取物中，除了多糖、多酚、黃酮等物質外，還會有其他物質對自由基也有一定的清除作用。多糖、多酚和黃酮在清除自由基中均發(fā)揮不同的作用，70%乙醇提取物的綜合抗氧化能力最佳，其次是水提取物，抗氧化能力最小的是乙酸乙酯提取物?？傮w看，極性大的溶劑提取物的抗氧化能力強，極性小的抗氧化能力弱。富鍺木耳菌絲體提取物與空白正常培養(yǎng)的耳菌絲體提取物相比，具有更好的清除自由基的能力，富鍺木耳在開發(fā)功能性食品方面具有一定潛力。

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