鐵皮石斛中性多糖的分離純化及抗炎作用

林曉亮，謝玲娜，陳夢香，梁 明，梁逸恒，杜志云,*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510623；2.廣東工業大學生物醫藥學院，廣東廣州 510006）

鐵皮石斛（DendrobiumofficinaleKimura et Migo）是一種稀有的多年生草本植物，是蘭科的第二大屬[1]。它的地理分布廣泛，包括印度、澳大利亞、美國和日本，在中國廣泛分布，主要分布于安徽、浙江和福建等地[2-3]。其莖入藥，味甘，性微寒，具有生津養胃，滋陰清熱，潤肺益腎等功效。現代醫學研究表明鐵皮石斛具有廣泛的藥理作用，包括抗癌，抗血管生成，抗炎，抗氧化，抗糖尿病，免疫增強，保肝，抗真菌，抗菌，抗病毒等[4-5]。研究表明，鐵皮石斛的主要生物活性化合物是具有保濕、抗氧化、抗衰老和增強免疫作用的鐵皮石斛多糖[6-8]。

炎癥是一種由感染、組織壓力、組織損害或者細胞應激引起的人體自動防御反應[9-10]。正常情況下炎癥能消除有害刺激，啟動愈合過程并恢復受傷組織的正常功能，對機體有益；但是過度炎癥會破壞正常組織的穩態，例如過度炎癥引起的炎癥因子風暴會造成多器官衰竭，嚴重時甚至會造成死亡[11]。因此，抑制失調或者過度的炎癥對人類的身體健康十分重要。巨噬細胞是先天性免疫和細胞免疫中的重要組成部分，具有吞噬、呈遞抗原和分泌細胞因子等重要作用[12-13]。巨噬細胞能參與炎癥過程中炎癥反應的誘發、維持和消退[12]。脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），又稱內毒素（Endotoxin），由類脂A、核心多糖和0-抗原重復序列組成，能夠誘導炎癥[14]。LPS 誘導巨噬細胞炎癥是由細胞膜上的Toll 樣受體4（tolllike receptor 4，TLR4）介導的，細胞膜上的TLR4 識別LPS 后，巨噬細胞被激活,并導致一系列的細胞因子和其他炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6 等的過度表達[15]。據報道，75%醇沉的鐵皮石斛多糖能促進RAW 264.7 細胞的M2極化，顯著降低TNF-α、IL-6 和NO 的釋放水平，但蔡海蘭等和黃杰等[16-17]的研究報道的鐵皮石斛純多糖對RAW 264.7 細胞具有激活作用，能促進TNFα的分泌，這可能與鐵皮石斛原料的產地、多糖的分子量與結構相關。童微等[18]的研究發現，分子質量為960 kDa 的鐵皮石斛多糖能顯著增強RAW 264.7細胞的免疫活性，不同化學修飾對其免疫活性的影響不同。但以上研究未對鐵皮石斛多糖進行進一步的結構解析和構效關系研究。

因此，本文對分離得到的鐵皮石斛多糖進行結構解析，以巨噬細胞RAW 264.7 為研究對象，探究鐵皮石斛分子量、結構與抗炎功效之間的關系，為開發鐵皮石斛在抗炎功效上的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛原料（昆植1 號）產地為中國云南；小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7 購于上海ATCC細胞庫；DMEM（dulbecco's modified eagle medium）培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素雙抗 美國Gibco 公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、果糖、甘露糖、肌醇標準品 美國Sigma 公司；氯仿、正丁醇、氫氧化鈉、濃硫酸、苯酚、吡啶 天津市大茂化學試劑廠；IL-4 酶聯免疫試劑盒（96T）、TNF-α酶聯免疫試劑盒（96T）江蘇酶免實業有限公司。

RE-2000A 旋轉蒸發儀 上海亞索生化儀器廠；ML204T/02 電子分析天平 梅特勒-托利多（中國）；H1650 離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；Sigma Alpha1-2LD 真空冷凍干燥機 美國Sigma公司；ICS-5000 型離子色譜分析系、Dionex Carbo-PacTMPA10 離子交換柱、Aglient 1200 型高效液相色譜儀、CO2培養箱 美國Thermo 公司；UV-3200 紫外-可見分光光度計 島津企業管理（中國）有限公司；Sunrise 型多功能酶標儀 奧地利Tecan公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鐵皮石斛多糖的提取與純化

1.2.1.1 鐵皮石斛粗多糖的制備 通過水提醇沉法提取鐵皮石斛多糖，稱取一定量的曬干鐵皮石斛原料，使用加熱水提法制備石斛粗多糖，實驗條件為：提取料液比1:20、提取溫度100 ℃、提取時間1 h、提取次數2 次，最終得到提取液4 L。按照1:4（去離子水:95%乙醇）的比例加入乙醇溶液，醇沉過濾，40 ℃恒溫干燥過夜，獲得干燥的石斛粗多糖。

1.2.1.2 鐵皮石斛純化多糖的制備 稱取鐵皮石斛粗多糖1.0 g，溶于30 mL 純水中，使用DEAE-25 纖維素交換層析柱進行分離。將石斛多糖溶液加入到層析柱中，用純水洗脫層析柱，控制流速1 mL/min，每120 s 收集1 管洗脫液。在收集終點附近，取樣少量的洗脫液，用苯酚硫酸法鑒定收集終點。對洗脫液進行選擇性合并，獲得不同的鐵皮石斛多糖組分，收集獲得的石斛多糖溶液濃縮后過Sephadex G-100葡萄糖凝膠柱，控制流速約0.1 mL/min，每管收集1 mL 洗脫液，溶液內多糖含量為0 時證明已到達收集終點。檢測已收集的40 管的洗脫液中的多糖含量，并使用酶標儀在波長為490 nm 處檢測吸光度，得到洗脫液中多糖的含量情況，并以此數據繪制多糖含量變化色譜圖，根據色譜圖中多糖物質的洗脫的先后順序，判斷多糖組分的分離效果。對主要出峰部分的洗脫液進行合并，凍干后獲得了多糖組分DOP-1。

1.2.1.3 多糖的純度鑒定 將多糖DOP-1 溶于蒸餾水配制成濃度為1 mg/mL 的溶液，用蒸餾水作參比，在波長范圍為190～400 nm 處對其進行紫外光譜掃描。

1.2.2 鐵皮石斛多糖的結構鑒定

1.2.2.1 DOP-1 的糖含量測定 利用苯酚硫酸法[19-20]測定樣品中的總糖含量，將多糖DOP-1 溶于蒸餾水配制成濃度為0.1 mg/mL 的溶液，吸取1.0 mL，然后分別加入0.5 mL 的6%的苯酚溶液和l mL 的濃硫酸，渦旋充分混合，30 ℃水浴20 min，室溫冷卻，在490 nm 下測定吸光度。

采用DNS 法[21]測定樣品中的還原糖含量，將多糖DOP-1 溶于蒸餾水配制成濃度為0.1 mg/mL 的溶液，吸取1.0 mL，然后分別加入2 mL DNS 溶液，加熱15 min，室溫冷卻，在540 nm 下測定吸光度。

1.2.2.2 鐵皮石斛多糖的單糖組成分析 參考于小芳[22]的實驗方法，配制濃度為10.0 μg/mL 的各單糖（阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、果糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖）標準溶液，然后再配制成5.0 μg/mL 的混合標準溶液。從混合標準溶液中分別取出5、1、0.5、0.1、0.05 mL 溶液，并在每個樣品中加入10 μg肌醇作為內標，然后用氮吹儀吹干。標準溶液及石斛多糖在100 ℃下用2 mol/L TFA 被水解6 h。移除過量的TFA 后，用0.3 mL TriSil 試劑（吡啶:六甲基二硅胺烷:三甲基氯硅烷=10:2:1（V:V:V））對多糖水解產物進行硅醚化，反應條件是80 ℃水浴加熱1 h，反應完成后用氮氣吹干，1 mL 正己烷定容，取0.5 μL 進行氣相色譜法分析。氣相色譜條件為：色譜柱DB-17（30 m×0.32 mm×0.5 m）；檢測器為氫火焰離子化檢測器；檢測器溫度280 ℃；柱溫190 ℃；進樣口溫度280 ℃；載氣N2；流速1 mL/min。

1.2.2.3 鐵皮石斛多糖的分子量測定 基于侯重文等[23]采用高效液相凝膠色譜儀分析多糖的均一性和平均分子量的實驗方法，儀器配制了Ultrahydrogel 250 柱子（7.8×300 mm），流動相為0.1 mol/L NaNO3，柱溫為30 ℃，流速為0.6 mL/min，進樣量為20 μL。將不同分子量的葡聚糖標準品（Mw=70、130、175、300、256 和580 kDa）分別配制成5 mg/mL 溶液，由小分子到大分子依次進樣，記錄各標準品相應的保留時間，以保留時間為橫坐標，以分子量的對數為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線計算分離獲得的多糖的平均分子量。

1.2.2.4 鐵皮石斛多糖的紅外光譜分析 將KBr 與干燥的多糖樣品充分研磨混合后壓制成薄片，然后于400～4000 cm-1波長范圍進行紅外掃描分析[24]。

1.2.2.5 鐵皮石斛多糖的核磁分析 將樣品溶解在0.55 mL 的D2O 中并用D2O 交換兩次。1H NMR，13C NMR 光譜在Bruker 光譜儀上以298 K 的探針溫度記錄并在400 MHz 下操作。

1.2.3 鐵皮石斛多糖DOP-1 的抗炎活性

1.2.3.1 細胞培養 小鼠腹腔巨噬細胞RAW 264.7細胞復蘇，使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養基，在含有5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.3.2 DOP-1 對細胞增殖的影響 將RAW 264.7細胞以1×103個/mL 的密度接種于96 孔板中，在含有5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，棄去上清液，每孔加入含各濃度（1000、500、250、125、25、5 μg/mL）多糖的培養基，培養24 h。避光條件下向96 孔板中每孔加入100 μL 的0.5 mg/mL MTT 溶液，培養箱中孵育4 h。4 h 后吸除MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶標儀中570 nm 檢測吸光值。統計分析，計算出多糖對RAW 264.7 細胞存活率的影響。選取對細胞無增殖抑制作用濃度進行實驗。

1.2.3.3 DOP-1 對細胞炎癥因子表達量的影響 將RAW 264.7 細胞以5×104個/mL 的密度接種于24孔板中，在含有5%二氧化碳的37 ℃恒溫培養箱中培養24 h 后，棄去上清液，分別設置為空白組、LPS 組（5 μg/mL LPS）、DOP-1 組（5 μg/mL LPS+（125～500）μg/mL DOP-1 溶液），每組分別加入對應的供試液（或空白培養基）1 mL。培養24 h 后，按照試劑盒說明書操作，測定樣品中的NO、TNF-α和IL-1β的含量[25]。

1.3 數據處理

實驗結果采用單因素方差分析，各組間差異比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），進行組間兩兩多重比較，P<0.05 表示差異有統計學意義（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）。采用Graph Pad軟件作圖。使用Image J 軟件處理染色圖片，所有數值均用“均數±標準誤差”。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛多糖的提取及純化

鐵皮石斛粗多糖的DEAE-25 纖維素柱洗脫曲線見圖1，收集主要洗脫組分，再經過Sephadex G-100 葡萄糖凝膠柱洗脫，獲得鐵皮石斛中性多糖DOP-1。

圖1 鐵皮石斛多糖的DEAE-25 洗脫曲線Fig.1 DEAE-25 elution curve of polysaccharides from Dendrobium officinale

將鐵皮石斛多糖DOP-1 在波長范圍為190～400 nm 處進行紫外光譜掃描，UV 光譜顯示其在260 和280 nm 處沒有吸收峰（圖2），說明DOP-1 中不存在核酸和蛋白質。

圖2 DOP-1 的UV 光譜Fig.2 UV spectrum of DOP-1

2.2 鐵皮石斛多糖的結構分析

2.2.1 多糖含量測定 利用苯酚-硫酸法和DNS 法測定DOP-1 的總糖含量和還原糖含量，求得DOP-1的總糖含量為94%，純度較高，且結果與之前的報道一致[26]。且DOP-1 中不存在還原糖。

2.2.2 多糖分子量測定 使用標準右旋糖酐已知分子量的T 系列標準，得到一個線性標準曲線方程：y=-0.3501x+9.3765，R2=0.9495，x 代表Rt，y 代表lg Mw。采用高效凝膠色譜法對DOP-1 的平均分子量進行分析，結果如圖3 所示，根據分子量分布及保留時間（Rt）求鐵皮石斛多糖組分的分子量，求得DOP-1 的分子量為59.2 kDa，可能是均一性的多糖。之前的研究報道表明，不同的產地、提取方式、分離純化方法對鐵皮石斛多糖的分子量均有較大影響[27]。

圖3 DOP-1 的分子質量分布曲線Fig.3 Molecular mass distribution curves of DOP-1

2.2.3 多糖的單糖組成及含量測定 將鐵皮石斛中性多糖DOP-1 進行酸水解，硅醚化反應后，采用氣相色譜法進行單糖組分分析，將DOP-1 的氣相色譜圖與單糖混合標準品的氣相色譜圖進行比對，根據各單糖標品的出峰時間可以判斷出各組分的單糖組成，在根據色譜圖上的峰面積大小能夠計算出各組分中的單糖構成和摩爾比。DOP-1 單糖組成及摩爾比見表1，單糖組成為鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，單糖摩爾比為0.6:9.0:2.7:2.9。根據趙小丹等[28]的報道，鐵皮石斛多糖的單糖組成主要為葡萄糖和甘露糖，李鏡銳等[26]的報道表明鐵皮石斛多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖4 種單糖組成，其中主要的單糖為甘露糖和葡萄糖。以上的研究報道與我們的實驗結果較為接近，本實驗中DOP-1 的單糖組成為鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其中鼠李糖含量較少，可忽略不計。

表1 鐵皮石斛多糖的單糖組成分析Table 1 Analysis of the monosaccharide composition of Dendrobium officinale polysaccharides

2.2.4 鐵皮石斛多糖的紅外光譜分析 通過對鐵皮石斛多糖DOP-1 進行紅外光譜分析，可得DOP-1 的傅里葉紅外光譜圖如圖4 所示，根據文獻[29]查詢可得，多糖分子中羥基基團的O-H 伸縮振動能夠在3400 cm-1左右處出現較大的吸收峰，2900 cm-1附近較強的吸收峰來自于多糖分子-CH2-中的C-H 伸縮振動，說明DOP-1 有多糖的特征官能團；DOP-1 在1732 cm-1處有吸收峰，說明含有-COOH 基團；DOP-1在1641 cm-1處的吸收峰是由-COOR 中的C=O振動引起的；硫酸基基團中的伸縮會在1250 cm-1處有吸收峰，DOP-1 在1250 cm-1處有一定的吸收峰，表明含有硫酸基；DOP-1 在810 cm-1處的吸收峰是D-Man 的結果。

圖4 DOP-1 的FT-IR 光譜Fig.4 FT-IR spectrum of DOP-1

2.2.5 多糖的核磁共振分析 多糖的1H 譜中質子信號大部分集中于δ3.0～δ4.0 ppm 的區域，重疊現象嚴重，但是異頭氫質子的信號在δ4.3～δ5.9 ppm 處，因此譜圖解析的關鍵是異頭信號。α-糖苷鍵中C-1處質子的化學位移大于5.0 ppm，而β-糖苷鍵中C-1處的質子的化學位移小于5.0 ppm。在圖5a 中，在δ4.2～δ5.0 ppm 和δ5.0～δ5.5 ppm 處均存在信號，這表明DOP-1 包含α-糖苷鍵和β-糖苷鍵。DOP-1的H-1 質子在δ4.2～δ5.5 ppm 內主要含有四種不同類型的異頭氫，說明DNP4 主要含有四種不同類型的單糖，這與單糖組成分析的結果接近，其中δ5.32 ppm有主要位移，說明有α-葡萄糖存在，這與紅外光譜的結果相符合。

圖5 DOP-1 的1H 譜（a）、13C 譜（b）Fig.5 1H spectrum (a),13C spectrum (b) of DOP-1

13C NMR 中化學位移在90～103 ppm 的異頭碳是α-型糖苷，化學位移在103～106 ppm 之間的異頭碳是β-型糖苷。在圖5b 中，在DOP-1 的13CNMR譜中，在低場160～180 ppm 處有微弱信號，說明多糖組分可能含有糖醛酸。根據DOP-1 的13CNMR 譜圖，DOP-1 中存在α-糖苷鍵和β-糖苷鍵，這與1HNMR分析一致。

DOP-1 的HSQC 譜如圖6 所示，H/C 信號在5.34/99.59、4.45/102.51、4.70/100.08、4.91/98.52、91.83/5.17、4.58/95.71 ppm 分別歸屬對應→4）-α-Glcp-（1→、β-GlcpA-（1→、→4）-β-D-Manp-（1→、→4,6）-α-D-Glcp-（1→、α-reducing-Manp、β-reducing-Manp 糖殘基，這與單糖組成結果一致。

圖6 DOP-1 的HSQC 譜圖Fig.6 HSQC spectrum of DOP-1

2.3 鐵皮石斛多糖DOP-1 的抗炎活性

2.3.1 DOP-1 對巨噬細胞存活率的影響 DOP-1 對巨噬細胞RAW 264.7 細胞存活率的影響如圖7 所示，在藥物濃度小于500 μg/mL 的條件小，DOP-1 對RAW 264.7 細胞沒有細胞毒性。

圖7 DOP-1 對RAW 264.7 細胞存活率的影響Fig.7 Effect of DOP-1 on the survival rate of RAW 264.7 cells

2.3.2 DOP-1 對RAW264.7 細胞NO、TNF-α和IL-1β表達量的影響 LPS 誘導巨噬細胞炎癥模型中，NO 和多種促炎細胞因子的分泌都會顯著增加，NO 釋放量是衡量炎癥反應程度的重要指標，IL-1β和TNF-α是關鍵的促炎細胞因子。如圖8 所示，與空白組相比，LPS 組的NO 相對含量顯著升高（P<0.001），DOP-1 處理后細胞NO 的分泌顯著減少了，并呈劑量依賴性。如圖9 所示，LPS 刺激24 h 顯著促進了RAW 264.7 細胞IL-1β的分泌，經125、250、500 μg/mL 的DOP-1 處理后，IL-1β的相對含量顯著下降（P<0.01）。如圖10 所示，相比于空白組，LPS 組 的TNF-α表達量顯著升高了（P<0.001），DOP-1 處理顯著降低了細胞TNF-α的表達水平（P<0.001）。

圖8 DOP-1 對RAW 264.7 細胞NO 表達量的影響Fig.8 Effect of DOP-1 on NO expression in RAW 264.7 cells

圖9 DOP-1 對RAW 264.7 細胞IL-1β 表達量的影響Fig.9 Effect of DOP-1 on IL-1β expression in RAW 264.7 cells

圖10 DOP-1 對RAW 264.7 細胞TNF-α 表達量的影響Fig.10 Effect of DOP-1 on the expression of TNF-α in RAW 264.7 cells

由上述實驗結果可知，DOP-1 在沒有細胞毒性的濃度下，能顯著抑制LPS 誘導的巨噬細胞NO、IL-1β和TNF-α的分泌，表明鐵皮石斛多糖DOP-1 可以通過下調炎癥因子表達量來起到抗炎作用。Xiang 等[30]的研究發現，從厚殼貽貝中提取分離得到的多糖能夠通過改善LPS 誘導的RAW 264.7 細胞中TNF-α和IL-6 的過度產生，抑制NF-κB 信號通路的激活，改善DSS 誘導的結腸炎等。因此，推測鐵皮石斛多糖可能可以通過抑制炎癥細胞因子的信號傳導，抑制NF-κB 通路的信號激活，從而抑制炎癥反應，具有良好的抗炎功效。

3 結論

本實驗通過水提醇沉法從鐵皮石斛中提取分離純化得到組分DOP-1，其中DOP-1 為均一性多糖，理化性質分析表明DOP-1 的糖含量為94%，且不含有糖醛酸和蛋白質。DOP-1 的分子量為59.2 kDa，單糖組成為鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，單糖摩爾比為0.6:12.0:6.4:0.4。DOP-1 的紅外光譜結果顯示，DOP-1 含有多糖的特征官能團，且含有硫酸基團和D-Man。DOP-1 的核磁波譜分析表明DOP-1 含有→4）-α-Glcp-（1→、β-GlcpA-（1→、→4）-β-DManp-（1→、→4,6）-α-D-Glcp-（1→、α-reducing-Manp、β-reducing-Manp 糖殘基，這與單糖組成和紅外分析的結果一致。體外細胞實驗表明，DOP-1 能抑制LPS 誘導的巨噬細胞NO、IL-1β和TNF-α的分泌，具有較好的抗炎功效。不同的產地來源、提取分離方法等因素都會可能對提取得到的鐵皮石斛多糖的分子量、單糖組成和結構造成影響，而不同的分子量結構的鐵皮石斛多糖，其生物活性往往也存在較大差異。先前對鐵皮石斛多糖的研究中發現了鐵皮石斛多糖的抗炎功效，但沒有進行進一步的構效關系驗證。本研究中對分離純化得到的鐵皮石斛多糖DOP-1 進行了結構表征并驗證了其對LPS 誘導的炎癥的抑制作用。本研究對鐵皮石斛多糖的結構及其活性的探討，可為鐵皮石斛多糖在抗炎產品的開發利用提供理論依據。

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