不同提取方式對金針菇菇腳蛋白性質的影響

賈明月，貴香茹，原秋艷，陳美玲，簡 磊，董曉博，徐懷德

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西咸陽 712100）

金針菇是世界上工業化大規模生產水平最高的食用菌之一，據統計，2020 年金針菇年產量約為227.91 萬噸[1]。隨著金針菇產量的逐年增加，隨之而來的是其副產物金針菇菇腳（Flammulinavelutipesstembase）的大量產生。金針菇菇腳（指菇柄底部及帶有培養基部分）水分含量高，并且具有多種營養物質，極易腐敗變質。如果處理不當，會造成嚴重的環境污染[2]。通過對金針菇生產企業調查發現，當前，金針菇菇腳的處理方式主要有兩種，一種是賣給肥料公司當動物飼料或堆肥處理，另一種是混合煤炭在鍋爐中燒掉。所以按照目前的處理方式，金針菇菇腳并沒有被合理利用[3]。金針菇菇腳中含有蛋白質、多糖、纖維素、多酚、黃酮、皂苷等多種生物活性物質，具有免疫活性、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[4-5]。其中，蛋白質作為菇腳的基本營養成分之一，約占其干重的10%～20%[6]。而目前，對于金針菇菇腳的研究主要集中在增加金針菇產量以及用作飼料喂養家禽等方面，而對于金針菇菇腳蛋白的研究較少。林忠寧等[7]測定了金針菇菇腳中的蛋白質以及氨基酸含量，結果表明其氨基酸種類齊全，含有較豐富的谷氨酸和天冬門氨酸，其中人體必需的賴氨酸色氨酸含量分別達到13.02 mg/g、14.68 mg/g，與雞蛋蛋白的貼近度達0.8257，是一種良好的氨基酸來源。金針菇菇腳進行水解可以生產蛋白小肽，得到的蛋白小肽粉末富含VB1、VB2、VC等多種維生素和鈣、磷、鐵等多種礦物質，營養豐富，易被人體吸收，具有優異的抗氧化性，可用于制備功能性食品。因此從金針菇菇腳中提取蛋白質具有很大的實用意義。

目前對于植物蛋白提取主要有水提法、堿提法、酶法和有機溶劑提取法等，其中堿提法因提取率高、操作簡單而被廣泛應用，已經成功運用于各種植物蛋白的提取，各種物理輔助法也有較為廣泛的應用[8]。崔曉瑞等[9]優化了超聲輔助堿法提取大球蓋菇蛋白的工藝，其產物具有一定的熱穩定性。Jin 等[10]采用鹽析和等電點沉淀兩種不同的方法提取平菇蛋白，結果發現等電點沉淀的蛋白具有更高的蛋白含量，鹽析法的蛋白具有更高的總酚含量。李妍等[11]用膠體磨輔助酶法提取鹿茸蛋白，結果發現產物具有良好的免疫活性。張艷榮等[12]優化了超聲-微波復合輔助堿法提取白靈菇蛋白。劉家希等[13]發現超聲輔助堿法能夠有效提高米糠蛋白質的提取率和功能性質。許鳳等[14]發現膠體磨超聲輔助堿法能夠顯著提高米糠蛋白的提取率。蔣益等[15]優化了凍融輔助堿法從蛹蟲草中提取蛋白質的工藝。研究發現，物理輔助堿提會對蛋白性質具有一定影響[14]，而目前的研究多集中在物理輔助堿法的優化上。

因此，本實驗擬采用堿提法、超聲輔助堿提法、膠體磨輔助堿提法、膠體磨聯合超聲輔助堿提法以及凍融輔助堿提法提取金針菇菇腳中的蛋白質，比較幾種提取方法下菇腳蛋白功能性質（持水性、持油性、起泡及起泡穩定性、乳化及乳化穩定性、溶解性）、理化性質（電位、粒徑、表面疏水性、巰基）及結構性質（紅外光譜、熒光光譜、二級結構）的差異，為金針菇生產的副產物的綜合利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮金針菇菇腳（白金針菇）陜西眾興高科食用菌有限公司；牛血清白蛋白、十二烷基硫酸鈉、考馬斯亮藍G250、磷酸、乙醇、8-苯胺基-1-萘磺酸、溴化鉀、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸 分析純，北京索萊寶科技有限公司。

ZEN3600 型納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；LS55 型熒光分光光度計 美國PE 公司；PB-10 型pH 計 賽多利斯（德國）集團；JM-30D 型超聲波清洗器 深圳潔盟公司；FDA5-2.5 型冷凍干燥機 北京GOLD SIM 儀器有限公司；UV-1780 型紫外-可見分光光度計 日本島津實驗器材公司；GL-10MD 型大容量高速冷凍離心機 湘儀儀器（湖南）有限公司；Vertex 70 型傅里葉變換紅外光譜儀德國Bruker 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將新鮮菇腳在60 ℃鼓風干燥箱中干燥24 h，粉碎后過孔徑0.25 mm 的篩，密封后置于干燥器中待用[9]。

1.2.2 金針菇菇腳基本成分測定 水分的測定：參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》進行；總糖的測定：參照GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》進行；粗蛋白的測定：參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》的凱氏定氮法進行；粗纖維的測定：參照GB/T 5009.10-2003《植物類食品中粗纖維的測定》進行；粗灰分的測定：參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》進行；粗脂肪的測定：參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》進行。

1.2.3 金針菇菇腳蛋白的提取 堿提酸沉法[16]（CK）：將金針菇菇腳粉與蒸餾水按照一定料液比混合置于燒杯中，攪拌均勻，室溫溶脹30 min 后用1 mol/L NaOH 調節pH 至12.0，40 ℃水浴振蕩提取1 h，結束后在4 ℃條件下8000 r/min 離心20 min，用2mol/L HCl 調節上清液的pH 至蛋白等電點（pH3.0），4 ℃沉淀3 h，取出在8000 r/min 條件下離心20 min，將沉淀用蒸餾水反復水洗2～3 次，將沉淀復溶于少量蒸餾水中，調pH 至中性，透析脫鹽48 h，真空冷凍干燥得到菇腳蛋白，-20 ℃保存備用。

超聲輔助堿提酸沉法[14]（US）：調節pH 至堿性后，40 ℃、500 W 超聲條件下提取20 min，之后繼續40 ℃水浴振蕩提取40 min，其余步驟同堿提酸沉法。

膠體磨輔助堿提酸沉法[14]（CM）：調節pH 至堿性后，膠體磨處理10 min，其余步驟同堿提酸沉法。

膠體磨＋超聲輔助堿提酸沉法[14]（CM+US）：調節pH 至堿性后，膠體磨處理10 min，40 ℃、500 W超聲條件下提取20 min，之后繼續40 ℃水浴振蕩提取40 min，其余步驟同堿提酸沉法。

凍融輔助堿提酸沉法[15]（FT-20 ℃、FT-80 ℃）：調節pH 至堿性后，分別置于-20 ℃、-80 ℃冰箱中完全凍結后再解凍，反復凍融三次后，40 ℃水浴振蕩提取1 h，其余步驟同堿提酸沉法。

1.2.4 蛋白質提取率測定 采用考馬斯亮藍法測定蛋白提取液中的蛋白含量，根據公式（1）計算蛋白提取率：

1.2.5 持水性和持油性測定 持水性測定：準確稱取0.25 g 菇腳蛋白，放入已精確稱重并編號的10 mL離心管中，添加5 mL 蒸餾水，渦旋混勻，室溫條件下靜置1 h，8000 r/min 條件下離心10 min，倒去上清液，傾斜排空上清液測定離心管中剩余物的質量[17]。計算公式如式（2）：

式中，M1表示棄去上清液后離心管和蛋白的質量；M2表示初始離心管和蛋白的質量；M 表示蛋白樣品的質量。

持油性測定：準確稱取0.25 g 菇腳蛋白放入已精確稱重的10 mL 離心管中，添加5 mL 玉米油，渦旋混勻，室溫條件下靜置1 h，8000 r/min 條件下離心10 min，倒去上清液，并傾斜排空，測定離心管中剩余物的質量[17]。計算公式如式（3）：

式中，M1表示棄去上清液后離心管和蛋白的質量；M2表示初始離心管和蛋白的質量；M 表示蛋白樣品的質量。

1.2.6 起泡性及起泡穩定性測定 準確稱取0.25 g菇腳蛋白，添加50 mL 蒸餾水，渦旋混勻后，用0.1 mol/L HCl 或NaOH 溶液調pH 至7.0，用高速分散機在9500 r/min 條件下高速攪打2 min，隨后迅速將其倒入量筒中，并且記錄上層泡沫體積V0，室溫下靜置30 min，測定泡沫體積V1[18]。按照公式（4）、（5）計算：

式中，V 表示初始體積量；V0表示攪拌截至時刻的起泡體積；V1表示靜置30 min 后的起泡體積。

1.2.7 乳化性及乳化穩定性測定 準確稱取0.25 g蛋白樣品，添加25 mL 蒸餾水，渦旋振蕩，混勻，用0.1 mol/L HCl 和NaOH 溶液調節pH 至7.0，量取15 mL 各溶液轉移到離心管中，分別加入5 mL 玉米油，用高速分散機在15000 r/min 條件下高速攪打2 min。

攪拌完成后，立即從管內液面下方2 cm 處吸取50 μL 溶液，加入含有5 mL 0.1% SDS 溶液的離心管中，渦旋振蕩后立即測定500 nm 處的吸光值A0。溶液室溫放置15 min 后，再次吸取50 μL，按照同樣的步驟測定吸光值At[18]。按照公式（6）、（7）計算：

式中，A0表示樣品初始吸光值；At表示樣品放置15 min 后的吸光值；c 表示蛋白樣品濃度；DF 表示稀釋倍數；?表示乳化液中油相的比例，本實驗中為0.25；t 表示時間。

1.2.8 溶解性測定 用蒸餾水配制2.0 mg/mL 的菇腳蛋白溶液，用0.1 mol/L HCl 或0.1 mol/L NaOH調溶液pH 至7.0。室溫條件下磁力攪拌45 min 后，8000 r/min 條件下離心10 min，用考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白含量[19]。按公式（8）計算：

1.2.9 表面疏水性測定 采用ANS 熒光法[20]。配制1.0 mg/mL 的菇腳蛋白溶液，用0.01 mol/L、pH 7.0 的PBS 緩沖液稀釋成0.1～1.0 mg/mL 不同濃度的溶液。取各濃度的樣品溶液4 mL，分別加入20 μL 8 mmol/L 的ANS 溶液，渦旋混勻，在暗處靜置15 min，用熒光分光光度計測定熒光強度。參數為：激發波長390 nm，發射波長為470 nm，狹縫寬度5 nm。以熒光強度為縱坐標和蛋白質濃度為橫坐標作圖，初始段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數。

1.2.10 巰基含量測定 配制20.0 mg/mL 菇腳蛋白溶液，取1.0 mL 蛋白溶液，加入4.0 mL Tris-Gly-10 mol/L Urea 溶液渦旋混合均勻后，再加入50 μL的Ellman 試劑。室溫條件下反應15 min 后，測定412 nm 處的吸光值A。同時以不加Ellman 試劑的溶液作為空白對照，測定吸光值。每個樣品平行測定三次。測定游離巰基含量時只需用Tris-Gly 緩沖液（0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Gly，4 mmol/L Na2EDTA·H2O，pH8.0）替換測定總巰基時的Tris-Gly-10 mol/L Urea 溶液即可[21]。計算公式如式（9）：

式中：73.53 為Ellman 試劑的摩爾消光系數；A412nm表示加Ellman 試劑時樣品溶液吸光值；A 表示不加Ellman 試劑時樣品溶液吸光值；D 為稀釋倍數；C 為蛋白樣品的質量濃度（mg/mL）。

1.2.11 傅里葉變換紅外光譜測定 準確稱取1 mg菇腳蛋白，加入100 mg 溴化鉀在研缽中混合碾磨，用壓片機進行壓片，放于樣品架上進行光譜掃描，用溴化鉀壓片做空白背景，光譜掃描范圍設置為400～4000 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，信號掃描累加32 次[22]。使用OMINIC9.0，Peak Fit 軟件處理得到的FT-IR 紅外光譜圖后，對酰胺I 帶（1600～1700 cm-1）的數據進行處理。由擬合峰面積得到菇腳蛋白中各個二級結構的相對含量[23]。

1.2.12 Zeta 電位和平均粒徑測定 使用納米激光粒度儀測定菇腳蛋白的Zeta 電位和平均粒徑。配制濃度為0.1 mg/mL 的菇腳蛋白溶液，用0.1 mol/L NaOH溶液將蛋白溶液pH 調至7.0，取800 μL 樣品溶液加入電位皿，放入樣品池中，測量電位，再測量平均粒徑，在室溫下重復檢測3 次。

1.2.13 內源性熒光光譜測定 配制0.1 mg/mL 的菇腳蛋白溶液，利用熒光分光光度計固定 295 nm 激發波長，得到300～450 nm 之間的發射光譜，掃描速度設置為1200 nm/min，狹縫寬度設置為5 nm，得到蛋白質的內源性熒光光譜[24]。

1.3 數據處理

所有實驗數據均測定3 個平行，結果以平均值±標準差表示。采用Excel 和SPSS 20.0 軟件對數據進行處理和統計分析，采用Origin 2023 進行制圖。采用方差分析中的Tukey 檢驗分析不同組的差異顯著性，P<0.05 時差異顯著。

2 結果與分析

2.1 金針菇菇腳基本成分

由表1 可知，菇腳中的總糖含量較高，且脂肪含量很低，金針菇菇腳的蛋白質含量可以達到12.45%（干基），金針菇子實體中的蛋白質含量約為15%～25%[25]。

表1 金針菇菇腳基本成分（%）Table 1 Nutritional compositions of flammulina velutipes (%)

2.2 不同提取方式對菇腳蛋白提取率的影響

由圖1 可知，膠體磨聯合超聲輔助提取組具有最高的蛋白提取率，可以達到39.57%，其次是膠體磨組和超聲組，都顯著高于對照組，但凍融輔助組的蛋白提取率降低。這可能是由于超聲和膠體磨的機械作用能夠促進蛋白質的溶出，從而提高了提取率[26]，許鳳等[14]得出了相似的結論。反復凍融可能使蛋白質不易溶出，因此提取率下降。

圖1 不同提取方式對金針菇菇腳蛋白提取率的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the extraction rate of flammulina velutipes protein

2.3 不同提取方式對菇腳蛋白持水性和持油性的影響

由圖2 可知，凍融-80 ℃輔助提取組的持水性和持油性均最高，聯合輔助提取組的持水性有所降低，其他處理組之間的持水性和持油性差異不顯著，這可能是由于反復凍融冰晶反復形成使蛋白內部空隙變大，具有更好的持水性和持油性。

圖2 不同提取方式菇腳蛋白的持水性（A）和持油性（B）Fig.2 Oil (A)/water (B) holding capacity of flammulina velutipes stembase protein by different extraction methods

2.4 不同提取方式對菇腳蛋白起泡性、起泡穩定性及乳化性、乳化穩定性的影響

由圖3 可知，膠體磨輔助提取以及聯合輔助提取組的蛋白質起泡性降低，但具有較高的起泡穩定性，凍融-20 ℃輔助提取組的起泡穩定性降低。這可能是嚴重的空化效應引起的蛋白質群體變化導致的。空化效應產生的瞬時的高溫高壓以及膠體磨的高速剪切力可能會破壞蛋白質分子中的基團，導致蛋白質的發泡性能下降。超聲組、膠體磨組以及聯合輔助提取組的乳化性相比對照組降低，但乳化穩定性提高；凍融處理組的乳化性提高，但乳化穩定性降低。這與Nazari 等[26]的結論相似，高強度超聲可能導致蛋白質變性，從而減慢油水界面處的蛋白質吸收，從而降低蛋白質的乳化性。乳化穩定性的增加可能與蛋白質分子更有效地吸附在油水界面上有關，這一變化趨勢與溶解性的基本一致。

圖3 不同提取方式菇腳蛋白的起泡性、起泡穩定性（A）及乳化性、乳化穩定性（B）Fig.3 Foaming capacity and foaming stability (A)/ emulsifying activity (EAI) and emulsifying stability (B) of flammulina velutipes stembase protein by different extraction methods

2.5 不同提取方式對菇腳蛋白溶解性、巰基含量和表面疏水性的影響

從表2 可知，膠體磨輔助提取組和聯合輔助處理組溶解性降低，蛋白的溶解性變差，使得在O/W 界面上吸附的蛋白減少，界面薄膜的穩定性被破壞，這也與乳化性和乳化穩定性的降低有關。各處理組的總巰基和游離巰基含量相比對照組都顯著（P<0.05）降低。超聲輔助提取組、膠體磨輔助提取組以及聯合輔助提取組的表面疏水性顯著高于對照組，凍融組的表面疏水性顯著（P<0.05）降低。表面疏水性是用于評估暴露于蛋白質表面的疏水基團數量的一種方法，通常用于反映蛋白質結構的變化。超聲和膠體磨的空化效應和剪切作用會破壞蛋白質的分子結構，導致蛋白質的結構發生重排，其中更多的疏水性基團暴露，增加了蛋白的表面疏水性[27]。游離巰基參與二硫鍵的形成，對于穩定蛋白質結構有重要作用。超聲波的空化效應會使空腔的氣相中產生瞬態的自由基，彼此之間會交叉反應產生過氧化氫。這些過氧化氫能與蛋白質分子發生反應，導致蛋白質分子的結構發生改變，一些敏感的官能團也會被氧化，其中就包括游離的巰基。通常，巰基主要存在于蛋白質分子的疏水區中。超聲和膠體磨提取組的菇腳蛋白，其分子結構發生改變后，內部的游離巰基就會暴露出來，更多的游離巰基被氧化，所以含量有所減少，這與Fu 等[28]的結論相似。

表2 不同提取方式菇腳蛋白的溶解性、巰基含量和表面疏水性Table 2 Solubility,sulfhydryl content and surface hydrophobicity of flammulina velutipes stembase protein

2.6 不同提取方式對菇腳蛋白紅外光譜的影響

從圖4 可以看出，不同提取方式得到的金針菇菇腳蛋白均具有酰胺A、B 和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征吸收峰。有幾個特征峰吸收強度有所不同，說明不同菇腳蛋白的氨基酸殘基存在不同。其中，酰胺A 帶主要是由 N-H 鍵的伸縮振動引起，N-H 伸縮振動發生的范圍是 3400～3450 cm-1，但當 N-H 基團參與氫鍵形成時，其振動頻率會向右偏移，各提取組的酰胺A 帶均位于3300 cm-1左右，說明有較多的 N-H 基團參與氫鍵形成，2900 cm-1左右的強吸收峰是由酰胺B 帶CH2基團的反對稱收縮振動產生的；1650～1700 cm-1的吸收峰是由酰胺Ⅰ帶C=O 的伸縮振動產生的，其中，超聲輔助組和膠體磨輔助以及聯合處理組的吸收峰強度相比對照組顯著增強，這是因為C=O 的伸縮振動發生了改變；1500～1550 cm-1的吸收峰是酰胺Ⅱ帶的C-N 伸縮振動和COO-伸縮振動產生的；1230～1260 cm-1的吸收峰是由于酰胺Ⅲ帶的C-N 伸縮振動和N-H 彎曲振動。

圖4 不同提取方式菇腳蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig.4 Fourier transform infrared spectra of flammulina velutipes stembase protein

2.7 不同提取方式對菇腳蛋白二級結構的影響

從表3 中可以看出，大多處理組的α-螺旋含量為0，在酸性條件下α-螺旋相對含量低可能是因為蛋白分子間電荷發生中和反應，產生靜電作用，影響氫鍵的穩定性；超聲輔助組、膠體磨輔助組以及聯合輔助組與對照組相比，β-折疊顯著（P<0.05）減少，β-轉角顯著增加；而凍融輔助組的β-折疊、β-轉角含量具有相反的變化趨勢。這是因為超聲波的空化效應以及膠體磨的高速剪切作用，破壞了氫鍵和靜電相互作用這些非共價鍵相互作用，導致β-折疊的含量降低，并同時使β-轉角的含量升高；而反復凍融破壞了維持蛋白質二級結構的氫鍵，使得蛋白質的結構發生了變化，部分有序結構變為無序構象，Xu 等[20]研究具有相似的結果，蛋白質二級結構中β-折疊含量的減少表明負責疏水相互作用的蛋白質位點暴露，這也會使蛋白質分子的表面疏水性增加。

表3 不同提取方式菇腳蛋白二級結構含量Table 3 Secondary structure content of flammulina velutipes stembase protein

2.8 不同提取方式對菇腳蛋白粒徑和電位的影響

圖5 顯示，各物理輔助提取組的粒徑相比對照組顯著（P<0.05）減小。可能是由于超聲的空化作用會產生瞬時的高溫高壓、膠體磨的高速剪切作用以及反復凍融破壞了蛋白質的非共價鍵相互作用，比如氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用，會使得一些較大的蛋白質聚集體解離，產生更小的蛋白質分子，從而平均粒徑減小，這提高了體系穩定性，與其起泡穩定性和乳化穩定性的提高相互印證。各物理輔助提取組的Zeta 電位絕對值相比對照組顯著增加。Zeta 電位絕對值較高的體系，表明分子間的排斥力較強，彼此之間不易形成聚集體，這種體系相對來說比較穩定，反之則體系不穩定[29]。先前隱藏在蛋白結構中的帶電離子經過超聲和膠體磨以及反復凍融處理后會相互排斥，表面所帶的負電荷越多，從而使Zeta 電位絕對值增加，更多的同性電荷間的相互排斥會使蛋白質溶液更穩定，蛋白的聚沉減少[30]。

圖5 不同提取方式對菇腳蛋白粒徑（A）和電位（B）的影響Fig.5 Effects of different extraction methods on the particle size (A) and zeta potential (B) of flammulina velutipes stembase protein

2.9 不同提取方式對菇腳蛋白熒光光譜的影響

蛋白質的熒光光譜反映了蛋白質的構象變化，可以改變色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基團的局部分子環境。如圖6 所示，超聲組和膠體磨組的熒光強度明顯增強，這可能是由于超聲和膠體磨處理的過程中產生的高剪切力，蛋白質分子內部的疏水相互作用被破壞，會暴露出更多蛋白質分子內部的疏水基團，從而引起熒光強度的增強[31]。但聯合輔助提取組和凍融組的熒光強度有所下降，這可能是因為過度的剪切力使得一些小的蛋白質顆粒通過疏水相互作用又再次形成大的蛋白質聚集體，一些氨基酸殘基暴露出來，相互作用增強，從而產生熒光猝滅，進而使熒光強度降低[32-33]。

圖6 菇腳蛋白內源性熒光光譜圖Fig.6 Endogenous fluorescence spectrum of flammulina velutipes stembase protein

3 結論

本研究對比了不同提取方式提取的金針菇菇腳蛋白的理化、功能和結構性質之間的差異。結果表明，超聲輔助堿提、膠體磨輔助堿提可以顯著（P<0.05）提高菇腳蛋白的提取率，并能在一定程度上改善菇腳蛋白的功能性質，乳化穩定性和起泡穩定性顯著（P<0.05）提高；二級結構中β-折疊含量顯著（P<0.05）降低，β-轉角含量顯著（P<0.05）增加，這些結構性質的變化與表面疏水性和穩定性等理化性質的提高密切相關。二者聯合輔助提取雖然具有最高的提取率，但由于其過度的剪切力會導致蛋白的乳化性和起泡性等功能性質顯著降低；凍融輔助提取具有相對較低的提取率，并且會降低菇腳蛋白的表面疏水性和巰基含量，其最大缺點是需要時間較長，而且需要冷凍設備且能耗較大。基于此，超聲和膠體磨輔助提取可以作為一種高效率提取金針菇菇腳蛋白的方法，在金針菇副產物的綜合利用方面具有重要意義。

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