酶解-動態高壓微射流制備納米淀粉及對其結構性質的影響

黃佳卉，趙 雷，朱 杰，張書艷

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642；2.東莞理工學院生命健康技術學院，東莞市特色食品精準設計重點實驗室，中國輕工業健康食品開發與營養調控重點實驗室，廣東東莞 523808）

蠟質玉米淀粉（Waxy Maize Starch，WMS）產量豐富、價格低廉，具有較高的膨脹度、透明度、粘度和穩定性，是現代食品工業的重要原料，也是生產變性淀粉的優質原料[1]。納米淀粉是由原淀粉通過物理、化學、生物等方法制備而成的一種具有粒徑小、比表面積大、生物相容性好等優良特性的淀粉顆粒，在食品、生物、包裝等領域均有較廣泛應用[2-3]。目前制備納米淀粉的主要化學方法包括酸水解法、化學沉淀法等，此類方法具有良好的可控性，但需要引入化學試劑且反應耗時較長[3-4]；物理方法包括超聲波法、螺桿擠壓法等，此類方法具有耗時短、環境友好等優點，但其制備的樣品較難控制粒徑及均勻度[5-6]。

動態高壓微射流技術（Dynamic High Pressure Microfluidization，DHPM）是一種可連續化作業的新興均質手段，可在短時間內同步實現料液的輸送、混合、超微粉碎、加壓、均質等一系列操作[7-9]。在瞬時壓力的推動下，流動的混合物料在相互作用腔內受到強烈撞擊、高頻剪切、高速振蕩和氣穴爆炸等一系列綜合作用力達到剪切破碎、碰撞破碎或聚結的效果[10]，基于高壓微流射技術處理淀粉，可實現對其結構、理化性質的調控。有研究表明，通過動態超高壓微射流技術使淀粉顆粒均勻分散在水中，形成的納米顆粒可轉變為穩定凝膠，與傳統的均質方法相比，動態超高壓微射流制備的樣品細碎度更高，穩定性更好[5,11]。淀粉顆粒在物理破碎下引起大小、形貌和均勻度的改變，淀粉的分子結構也發生變化，從而導致理化性質如分散性、溶解度、糊化性質和化學活性等相應發生變化。然而，利用高壓微射流技術直接處理蠟質玉米淀粉制備納米淀粉顆粒時，易使腔體堵塞，且樣品穩定性較差，阻礙其進一步應用[11-12]，普魯蘭酶（普魯蘭1,6-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.41），是淀粉加工中一種重要的脫支酶，與異淀粉酶相比，其能切下支鏈淀粉和其它相關多聚糖的α-1,6 糖苷鍵，形成短直鏈淀粉，但酶的成本高、且酶解過度會促使淀粉水解，無法得到預期的淀粉納米粒子。因此，本文利用酶解-高壓微射流技術聯合制備蠟質玉米納米淀粉，以期得到均相且粒徑可控的淀粉納米粒子體系，同時探討淀粉多尺度結構、粒徑和熱學性能的變化，為蠟質玉米納米淀粉乳液的制備及其在活性包裝材料中的應用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟質玉米淀粉（直鏈淀粉含量為0.67%±0.07%）東莞東美食品有限公司；普魯蘭酶（2000 U/g）、溴化鋰（分析純）、二甲基亞砜（色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；溴化鋰 分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

MR Hei-Tec（CN）型磁力攪拌器 德國Heidolph 公司；M-110EH-30 型高壓微射流均質機 美國MFIC 公司；SCIENTZ-18 N 型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；EM-30 PLUS+型掃描電子顯微鏡 韓國COXEM 公司；DX-27mini 型X-射線衍射儀 遼寧丹東浩元儀器有限公司；Spectrum Two 型傅立葉紅外光譜儀 美國PE 公司；LS13 320 型激光粒度儀 貝克曼庫爾特有限公司；Eclipse DualTec 型分子排阻色譜-多角度激光光散射聯用儀美國WYATT 公司；DSC3 型差示掃描量熱儀梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶解淀粉的制備 稱取三份50 g 蠟質玉米淀粉（WMS），分別置于500 mL 去離子水中，于100 ℃下攪拌30 min，使原淀粉糊化完全，攪拌速率為500 r/min。待WMS 淀粉糊溫度降低至50 ℃，加入添加量均為6 U/g（以淀粉干基計算）的普魯蘭酶，并將其置于50 ℃水浴鍋中進行酶解，酶解時間分別為0.5、1、2 h，酶解之后將三種酶解淀粉置于100 ℃水浴鍋中進行滅活，滅活時間為30 min，待其降至室溫后得到酶解淀粉并將部分樣品進行冷凍干燥保存（樣品分別記為E-0.5、E-1、E-2）。

1.2.2 納米淀粉的制備 分別稱取2 g 不同酶解時間的淀粉置于200 mL 去離子水中，充分分散后經動態超高壓微射流處理，壓力為10000 PSI，循環次數為1 次，將處理后的淀粉乳液冷凍干燥后得到納米淀粉（樣品分別記為E-0.5-N、E-1-N、E-2-N）。

1.2.3 微觀形貌觀察 將原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉樣品分散在貼有導電雙面膠的掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）樣品臺上，并用洗耳球輕吹樣品使其單層平鋪樣品臺表面，樣品經過離子濺射噴金40 s，電壓為5 kV，后于SEM 中觀察不同放大倍數下的淀粉顆粒形貌。

1.2.4 結晶結構測定 分別取原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉置于樣品槽內，將樣品表面壓平放入X-射線衍射儀中，X-射線為Cu-Kα射線（λ=0.15 nm），30 kV×15 m A），測量范圍為10°～40°，步長0.02，掃描速度0.1°/s，每個樣品測三次，經Jade 6.0 軟件計算樣品的相對結晶度。

1.2.5 分子結構測定 分別將1 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉分別與150 mg 溴化鉀混合，充分研磨使二者混合均勻，取適量進行壓片處理并用紅外光譜儀進行測定，每個樣品平行測定三次，得到傅里葉紅外（Fourier Transform Infrared，FT-IR）圖譜。

1.2.6 粒徑測定 用一次性滴管吸取原淀粉逐滴加入到激光粒度儀的進樣口中，待其PIDS 檢測器值達到40%，開始測量淀粉樣品粒徑，每個樣品平行測定三次。

1.2.7 分子量分布測定 分別稱取4 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉，將三種淀粉分別用4 mL 二甲基亞砜（DMSO，含溴化鋰（0.5% w/w））進行混合，后將溶液置于80 ℃的水浴搖床中過夜，使其充分溶解，待溶液冷卻至25 ℃，利用0.45 μm過濾膜過濾，備用。使用分子排阻色譜測定淀粉的分子量分布，測定過程中洗脫液為含0.5%（w/w）溴化鋰的DMSO，柱溫80 ℃，流速為0.5 mL/min，每個樣品平行測定三次。

1.2.8 熱學性能測定 分別準確稱取4 mg 原淀粉、冷凍干燥處理后的酶解淀粉和納米淀粉，置于差式掃描量熱儀（Differential Scanning Calorimetry，DSC）專用的鋁坩堝中，加入12 μL 蒸餾水，然后將鋁坩堝密封，于室溫下平衡12 h，同時以空盤作為空白對照。樣品測定溫度為30～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min，氮氣流速40 mL/min。利用DSC 熱譜圖計算起始溫度、峰值溫度、結束溫度（分別為To、Tp和Tc）以及焓值（ΔH），每個樣品平行測定三次。

1.3 數據處理

實驗均進行三次平行測定，所得數據均利用SPSS 軟件（24.0 版）進行方差分析，通過鄧肯多重檢驗來表示組間顯著性差異（P<0.05），結果使用平均值±標準差表示，數據通過Origin 9.0 軟件進行統計分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 微觀形貌觀察

圖1 為不同酶解時長以及進一步高壓微射流處理后淀粉經冷凍干燥處理后的形貌。由圖1a 所示，原淀粉為圓形或多角形、表面光滑、無氣孔[13]，酶的加入使淀粉顆粒形貌發生明顯變化，變成無規則的碎片顆粒（圖1b～圖1d），且隨著酶解時間的延長，酶解淀粉形態明顯變小且出現更多碎片。該現象可能是糊化引起顆粒的膨脹，從而導致顆粒結構的破壞。

圖1 不同處理條件WMS 的微觀形貌圖Fig.1 SEM of WMS under different treatment conditions

酶解淀粉進一步經微射流處理后，微射流劇烈的沖擊力使大顆粒破碎成塊狀顆粒，顆粒的比表面積增大，淀粉的形狀發生改變，且淀粉原本光滑的表面變得粗糙，淀粉顆粒進一步被破壞[10,14-15]。納米淀粉的形貌分析證實了微射流的高壓作用使淀粉顆粒變得更加細小，并且出現明顯的層狀條帶（圖1e～圖1g）。

2.2 結晶結構分析

圖2 為不同酶解時長以及進一步高壓微射流處理后淀粉的XRD 衍射圖譜。如圖2 所示，原淀粉在2θ為15.01°、17.00°、18.03°、23.08°處有強的衍射峰，為典型的A 型結晶。原淀粉經過糊化處理后，當酶解時間為0.5 h 時，結晶度從66.21%下降到3.04%，隨著酶解時間的進一步增加，淀粉呈彌散衍射特征，表明結晶結構消失[1]。研究表明，當淀粉經普魯蘭酶水解后，淀粉分子中晶態和非晶態結構中氫鍵作用均被破壞[16-18]。

圖2 不同處理條件WMS 的X-射線衍射圖Fig.2 X-ray diffractions of WMS under different treatment conditions

進一步經微射流處理后，淀粉整體仍呈現彌散衍射峰，未有明顯變化，表明酶解淀粉經微射流處理后繼續呈現無定型態。經微射流制備得到的納米淀粉衍射圖譜與酶解淀粉相比變化不大。有研究表明，原淀粉經過微射流處理后，X-射線衍射圖譜呈現彌散衍射狀態，可能是因為淀粉結晶有序程度降低或是淀粉顆粒尺寸減小引起的結晶過小[19]。本實驗中酶解使淀粉結晶被顯著破壞，且酶解時間越長結晶結構破壞越顯著，同時高壓微射流處理并沒有對淀粉結晶結構進一步產生明顯的影響。

2.3 分子結構分析

圖3 為不同酶解時長以及進一步高壓微射流處理后淀粉的紅外光譜圖。如圖3 所示，3300 cm-1處為O-H 伸縮振動和羥基氫鍵締合后的特征吸收峰[1,20]，2930 cm-1處左右為C-H 的伸縮振動，1640 cm-1為C=O 伸縮振動，經酶解和微射流處理后，該處波長發生紅移，可能是因為微射流處理一定程度上使淀粉的功能基團發生變化；也有報道稱1640 cm-1處的峰強和峰位置與淀粉顆粒中結合水的能力有關[21]。由圖3可知，經酶解處理后，1047 和1018 cm-1處的峰條帶變寬甚至消失，這可能與酶解淀粉的長程有序性（結晶度）降低有關[22]。該現象可能是糊化引起顆粒的膨脹，從而導致顆粒結構的破壞。經微射流處理后，1047 cm-1處的峰完全消失，該現象是由微射流過程中高壓、高剪切力、湍流力和空化作用導致納米淀粉從有序變為無序構象[12]。1040 cm-1為無水葡萄糖環C-O 拉伸振動特征峰，990 cm-1左右為O-H 彎曲振動吸收峰[23]。對比可知，經酶解后，淀粉中的葡萄糖環C-O 拉伸振動吸收峰向1020 cm-1進行藍移，可能是因為在酶解過程中α-1,6-糖苷鍵被水解并產生羥基，形成氫鍵。另外，圖3 中所有樣品均沒有出現新的紅外吸收峰，表明酶解淀粉和納米顆粒并沒有產生新的化學鍵。

圖3 不同處理條件WMS 的紅外光譜Fig.3 FT-IR spectrum of WMS under different treatment conditions

通過去卷積處理后將透射率轉換為吸光度，1047 和1022 cm-1處的吸光度比值R 可表征淀粉的短程有序結構[15,24]。根據表1 可知，酶解淀粉和納米淀粉的R 值都高于原淀粉，說明經過處理后，分子短程有序性增強[18]，這是由于酶解后淀粉鏈間氫鍵數目增加或淀粉中多尺度聚集結構進行了重排所致的[25]。另外，酶解淀粉經微射流處理后R 值降低，可能是微射流的高壓作用影響淀粉的短程有序結構，使R 值略微降低。

表1 不同處理條件WMS 的R 值Table 1 R value of WMS under different treatment conditions

2.4 粒徑分布

由表2 可知，與原淀粉相比，當酶解時間為0.5 h時，淀粉粒徑顯著增大（P<0.01），這是由于淀粉在糊化的過程中氫鍵作用促使淀粉分子與水分子發生強烈的水合作用，使淀粉鏈不斷展開，導致顆粒逐漸膨脹，體積增大[2,26]。當酶解時間為1 h 時，粒徑顯著減小（P<0.05），可能是淀粉顆粒的溶脹促進了普魯蘭酶與淀粉分子間的接觸，普魯蘭酶分子與淀粉分子結合后催化糖苷鍵裂解，促使淀粉粒徑降低；隨著酶解時間增加到2 h，支鏈淀粉進一步被裂解，線性直鏈淀粉分子的纏繞作用促使淀粉粒徑增大[17,27]。

表2 不同處理條件WMS 的粒徑Table 2 Particle size of WMS under different treatment conditions

與原淀粉和酶解淀粉相比，不同酶解時間的蠟質玉米淀粉經微射流處理后，淀粉粒徑均顯著減小至納米級（P<0.01）。當與酶解時間為0.5 h 相比，酶解時間為1 h 時，納米淀粉粒徑略微增加，可能是因為微射流處理后淀粉顆粒發生了一定聚集[10,12]，酶解時間增加到2 h，納米淀粉粒徑明顯減小，表明微射流顯著降低粒徑。

2.5 分子量分布

圖4 為不同酶解時長以及進一步高壓微射流處理后淀粉的分子量激光信號，物質分子量越大，保留時間越短。由圖4 可知，隨著酶解時間的增加，淀粉的分子量越小，經微射流處理納米淀粉的分子量也隨酶解時間增加而降低。重均分子量（Mw）如表3 所示，酶解淀粉分子量與原淀粉相比顯著減小，且隨著酶解時間的增加而進一步減小[28]，WMS 經普魯蘭酶酶解后，淀粉的α-1,6 糖苷鍵斷裂，形成了短直鏈淀粉，這與已有研究結果相似[29-30]。在經微射流處理后，納米淀粉的分子量較WMS 和酶解淀粉均顯著降低（P<0.05），且分子量隨酶解時間的增加而降低，這主要是因為微射流的高壓作用使淀粉分子鏈發生斷裂[19,31]。

表3 不同處理條件WMS 的分子量Table 3 Molecular weight of WMS under different treatment conditions

圖4 不同處理條件WMS 的分子量激光信號圖Fig.4 Laser signal pattern of WMS under different treatment conditions

2.6 熱學性能分析

糊化溫度作為淀粉的一個重要指標，與淀粉顆粒結晶結構、直鏈淀粉含量等因素密切相關。由表4 可知，與原淀粉的起始糊化溫度To（64.76 ℃）和吸熱峰值溫度Tp（71.23 ℃）相比，酶解淀粉的糊化To（48.04 ℃）和Tp（53.81 ℃）顯著降低，但隨著酶解時間的增加到2 h，To（49.36 ℃）、Tp（55.81 ℃）略有升高。同時，經過酶解后，淀粉的焓變（ΔH）出現不同程度降低，是因為酶解破壞了淀粉結晶區，導致其糊化溫度降低[32]。

表4 不同處理條件WMS 的熱學參數Table 4 Thermodynamic parameters of WMS under different treatment conditions

經過微射流處理后得到的納米淀粉（E-1-N）的To進一步降低（39.72 ℃），Tp也明顯向低溫方向移動（圖5），可能是因為淀粉的結晶區被破壞，導致水分子更容易進入淀粉結晶區[12]。由于動態超高壓使淀粉鏈降解，使淀粉短側鏈被打斷致其結構松散，導致E-0.5-N 的ΔH 降低（5.65 J/g），但隨酶解時間增加到2 h，納米淀粉的ΔH 顯著（P<0.05）增大（13.33 J/g），可能和納米淀粉短程有序性結構增加有關[19]。

圖5 不同處理條件WMS 的DSC 圖Fig.5 DSC curves of WMS under different treatment conditions

3 結論

蠟質玉米淀粉經酶解處理后其微觀結構發生明顯變化，結晶結構被破壞，形成短鏈淀粉分子、分子量顯著減小（P<0.05）；與原淀粉和酶解淀粉相比，進一步經微射流處理后的淀粉粒徑和分子量均顯著減小（P<0.05），達到納米級；同時，淀粉顆粒形態變成更加無規則的碎片狀，納米淀粉具有更低的糊化溫度。通過酶解-微射流處理，制備了一種粒徑均勻的納米淀粉，使蠟質玉米淀粉結構和熱學性能得到明顯改善；提供了一種環境友好、操作簡單且穩定性良好的納米淀粉制備方法，有利于進一步對納米淀粉進行開發利用，為后續制備淀粉納米乳液及淀粉基納米活性材料提供基礎。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).