板棗發酵酒的生產工藝優化及體外消化

汪江波，薛超越，朱嘉璐，何 超，沈 艷，蔡鳳嬌，張瑞景，徐 健,*

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，工業發酵省部共建協同創新中心，發酵工程教育部重點實驗室，工業微生物湖北省重點實驗室，湖北武漢 430068；2.湖北畢圣泉酒業有限公司，湖北黃岡 438700；3.浙江興業集團有限公司，浙江舟山 316100）

板棗生產于山西省運城市稷山縣，是當地一種特色的支柱產業，屬于山西的四大名棗之一，果實呈紫紅色，果肉呈白綠色，口感甘甜，有天然的芬芳香味，含糖豐富，烘烤過后可以拉出金黃的細絲，維生素和礦物質是所有棗類中含量最高的，被稱為“中華棗中之王”[1]。板棗的主要生物活性成分是維生素C、酚類、類黃酮、三萜酸和多糖[2]。棗果有抗癌、抗炎、抗肥胖、免疫刺激、抗氧化、保肝、胃腸保護活性以及抑制巨噬細胞中泡沫細胞的形成等作用，為高級補品，藥用價值極高[3-4]。

作為當地農民增收的主要來源，稷山板棗容易受天氣影響，生產出裂果、小果，缺乏產品商業價值，且目前市場上紅棗發酵酒匱乏，人工配制紅棗酒基本壟斷了紅棗酒的市場。人工配制酒香氣不足、口感欠佳且北方許多棗酒廠的生產工藝不能反映棗酒本身的特性，缺乏典型性，將板棗進行深加工，同時目前板棗發酵酒多以單原料進行發酵，通過添加輔料例如：青蘋果，山楂，橘子等，不僅可以提高板棗酒的酸度，又可以生產出香氣豐富的板棗釀造酒，提高板棗商業價值[5-6]。板棗酒在發酵過程中總酚含量，抗氧化活性均有所提高，但對于其進入人體后在胃和腸道消化過程中的變化情況卻少有研究。本實驗通過體外消化模擬人體消化時的生理條件，對板棗酒進入人體后進行胃消化模擬和腸消化模擬，研究攝入物質的變化、相互作用以及營養物質生物可及性。

本研究采用板棗發酵制作果酒。以酸度和感官評價為指標，對輔料的選擇進行單因素實驗，以感官評價為指標，選擇對影響釀酒生產的3 個因素（物料比，發酵溫度，浸提溫度）進行Box-Behnkn 試驗設計，隨后進行神經網絡模擬與遺傳算法優化板棗酒的發酵工藝參數，并對其進行體外消化分析，以期為后續的板棗發酵酒提供借鑒和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板棗（干棗）、青蘋果、山楂、橘子 市購；果膠酶（500 U/mg）安琪酵母股份有限公司；SO2分析純，上海國藥集團有限公司；安琪果酒專用釀酒酵母 安琪酵母股份有限公司；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）、豬膽鹽 美國Sigma 公司。

VWR UV-1600PC 紫外可見分光光度計 美國VWR 公司；MJP-250 恒溫培養箱 上海精宏設備有限公司；JJ-2B 組織搗碎機 方科儀器（常州）有限公司；TGL-16M 立式冷凍離心機 常州市金壇高科儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 板棗酒發酵工藝 板棗→篩選→清洗→浸提→加輔料→打漿→板棗棗漿→酶解→冷卻待用→添加二氧化硫→添加酵母→發酵→過濾→澄清→棗酒

參照楊智剛[7]的方法，將板棗洗凈破碎，放入50 ℃、500 mL 錐形瓶用純水水浴浸提2 h，山楂洗凈與板棗混合打漿，加入40 mg/L 果膠酶酶解1 h，添加50 mg/L 二氧化硫滅菌10 h，添加200 mg/L 已活化釀酒酵母（酵母活化：將10 g 酵母、90 mL 純水、1 g 葡萄糖混合加入250 mL 錐形瓶中30 ℃水浴加熱30 min），發酵結束后放入500 mL 藍蓋瓶中80 ℃密閉加熱1 h 進行滅菌（滅菌方式的選擇進行預實驗：采用75 ℃、2 h 和80 ℃、1 h，進行感官驗證后發現后者香味損失最小，且滅菌時間小于1 h 會造成雜菌污染，滅菌時間過長會造成香味損失），過濾離心得到棗酒。

1.2.2 輔料的選擇 將板棗與輔料（青蘋果、山楂、橘子）以3:1（w/w）的比例分別混合并制成相應的棗漿，然后按照1.2.1 工藝流程進行發酵，測定其酸度，并進行感官評價。

1.2.3 板棗果酒發酵工藝優化單因素實驗設計 通過預實驗選擇了對實驗結果影響最大的3 個因素：浸提溫度、物料比、發酵溫度。理化指標的檢測有6 項：酒精度、總酸、發酵時間、DPPH 自由基清除率、總酚、總黃酮。不同的單因素對理化指標的影響程度不同，選擇對其影響程度最大的幾個理化指標作為最終指標。

1.2.3.1 浸提溫度的確定 板棗清洗篩選后放入25、50、75、97 ℃溫水中浸提2 h，其他按1.2.1 操作，以DPPH 自由基清除率和總黃酮作為指標，確定浸提溫度。

1.2.3.2 物料比的確定 在板棗浸提過后，按板棗與山楂比例為1:1、2:1、3:1、4:1（w/w）添加輔料，使板棗與輔料的總量保持在130 g，加入325 g 水混勻打漿，接下來按1.2.1 到發酵結束（發酵結束指標：發酵過程中連續2 d 重量差不超過0.5 g），以總酸、酒精度和感官評分作為指標，確定輔料添加量。

但是我心里明白，只要古意有一絲的動搖，那我就完全是一只沒人要的小狗了。因為我是一個有障礙的小孩，我的存在嚴重阻礙了古意的前程，不被任何關愛古意的人喜歡和接受，只好時時驚恐著被拋棄的命運。

1.2.3.3 發酵溫度的確定 添加酵母后將棗漿放入20、25、30、35 ℃恒溫培養箱，其他按1.2.1 操作，以發酵時間和抗氧化活性作為指標，確定發酵溫度。

1.2.4 發酵優化Box-Behnkn 試驗設計 通過單因素實驗，在其分析結果的基礎上選擇輔料添加量，發酵溫度，浸提溫度為自變量，感官評價為響應值，優化棗酒發酵條件。試驗因素水平如表1 所示。

表1 發酵條件優化Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test design for optimization of fermentation conditions

1.2.5 神經網絡實驗設計 參考Wang 等[8]的方法，利用Matlab 2016a 軟件對Box-Behnken 試驗結果進行BP 神經網絡分析。將BB 實驗結果分為12 個訓練組和5 個驗證組，訓練過程進行1000 次，直到預測值與實際輸出結果之間的均方誤差（MSE）小于10-3，最后運用遺傳算法對BP 神經網絡分析得到的模型進行最優值求解。

1.2.6 理化指標測定 酸度和總糖采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的直接滴定法和指示劑法；酒精度采用GB 5009.225-2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》中的酒精計法；總酚采用Folin-Ciocalteu 酚法[9]，測定總多酚含量；總黃酮參照靳玉紅等[10]的方法，測定總黃酮含量。

DPPH 自由基清除能力參照唐蘭芳等[11]的方法：配制100 μmol/L 的DPPH 甲醇溶液，準確吸取稀釋50 倍后的0.5 mL 樣品溶液與3.0 mL DPPH溶液混合，搖勻，室溫避光反應30 min，采用分光光度計在波長517 nm 處測其吸光度值OD樣品。對照組以0.5 mL 甲醇溶液代替樣品，測其吸光度值OD空白，計算DPPH 自由基清除率按式（1）計算：

式中，OD空白：甲醇溶液與DPPH 溶液混合液的吸光度；OD樣品：樣品溶液與DPPH 溶液混合液的吸光度。

ABTS＋自由基清除率測定：ABTS 母液的配制：將245 μL（100 mmol/L）過硫酸鉀溶液和9.5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液混合于10 mL 容量瓶中，然后用純水定容并混合均勻，置于黑色瓶子中并用牛皮紙包裹于黑暗中靜置15 h。使用時用無水乙醇對母液進行稀釋，使其在734 nm 波長處的吸光度為0.7±0.02，即得ABTS 工作液。取1 mL 板棗酒消化液加入5 mL ABTS 溶液，室溫避光反應7 min 后在734 nm 波長處測吸光度；以1 mL 蒸餾水代替消化液測其吸光度作為空白對照。每組樣品平行3 次，按式（2）計算ABTS+自由基清除率：

式中，OD空白為空白對照的吸光度；OD樣品為樣品的吸光度。

1.2.7 感官指標評價方法 依據GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》和相關研究確定板棗發酵酒的感官評價標準，滿分100 分（見表2）。選擇5 名專業品酒師進行感官評價[12-13]。

表2 板棗發酵酒感官評分標準Table 2 Sensory scoring standard of chinese jujube fermented wine

1.2.8 體外消化實驗設計 體外模擬消化模型參考Brodkorb 等[9]的方法進行。

胃消化模擬液（SGF）：0.69 mL KCl、0.09 mL KH2PO4、1.25 mL NaHCO3、1.18 mL NaCl、0.04 mL MgCl2、0.05 mL（NH4）2CO3、36.7 mL 水。

腸消化模擬液（SIF）：0.68 mL KCl、0.08 mL KH2PO4、4.25 mL NaHCO3、0.96 mL NaCl、0.11 mL MgCl2、33.92 mL 水。

胃消化模擬：將11.25 mL 的SGF 溶液與15 mL樣品混合，加入0.75 mg 胃蛋白酶（1:3000）和0.5 mL HCL 溶液并將pH 調整為2，并在37 ℃下預熱15 min。后在37 ℃厭氧避光環境下振蕩孵育2 h，消化過程中每隔20 min 取樣。

腸消化模擬：在胃消化液的混合物中取15 mL樣品加入8.25mg SIF、3.75 mL 胰蛋白酶（20 mg/L）和1.875 mg 豬膽鹽（0.15 mg/L）混合溶液，并使用NaHCO3（1 mol/L）將混合后消化物pH 調節至7.5，后在37 ℃厭氧避光環境下振蕩孵育2 h，消化過程中每隔20 min 取樣。

所取消化混合物樣品以8000×g 離心15 min，取上清液并立即置于-20 ℃冰箱中，后續測定胃腸道消化過程中板棗棗漿的多酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率。

1.3 數據處理

本研究中所有實驗和檢測均重復進行三次，數值以平均值±SD 表示。采用IBM SPSS 25.0 版統計軟件對數據進行顯著性分析，P<0.05 認為數值間存在顯著性。使用Origin 2021b（OriginLab，USA）進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 輔料的篩選

添加輔料的目的是增加棗酒的酸度，酸含量顯著影響果酒的口感，使其具有清爽的特性，減少可感知的甜度，適當的低pH 對于果酒的顏色穩定性至關重要，它還可以防止酚類化合物的氧化，果酒的高酸度也有抑菌作用[14]。從表3 可知，添加山楂的棗酒酸度為4.92 g/L，是發酵果酒比較適口的酸度水平，同時感官評分最高為74.52 分。而添加青蘋果的板棗發酵酒的酸度為3.51 g/L，酸度太低，水味較重，感官評分也比較低為65.13 分，添加橘子的板棗發酵酒的酸度為7.32 g/L，酸度太高，入口不適，感官評分為68.21 分。綜上所述，選擇山楂作為板棗發酵酒的輔料添加。

表3 輔料對棗酒酸度和感官評分的影響Table 3 Effects of ingredients on acidity and sensory score of jujube wine

2.2 板棗酒發酵工藝優化單因素實驗

2.2.1 浸提溫度對板棗酒發酵的影響 由圖1 可知，隨著浸提溫度的上升，DPPH 自由基清除率呈現先上升后下降的趨勢，浸提溫度為75 ℃時，DPPH 自由基清除率出現顯著下降；由圖2 可知，隨著浸提溫度的上升，總黃酮含量出現先上升后下降的趨勢，當浸提溫度為50 ℃時，DPPH 自由基清除率最高，總黃酮含量最高。這是由于溫度升高可以加速分子間的運動，提高擴散系數，從而降低了溶劑的粘度，最終加速總黃酮的溶出[15]；溫度升高的同時也加速了細胞壁的軟化和破壞，增加了細胞膜的通透性，導致總黃酮的溶出增加[16]。但是在高溫下，黃酮受熱不穩定而分解，或者由于黃酮類物質在高溫條件下易被氧化，部分黃酮類物質結構發生改變，從而使黃酮得率下將[17]，黃酮類化合物具有共軛雙鍵結構，其在高溫下容易失去活性，對O2-·的清除能力降低，導致DPPH自由基清除率下降，抗氧化活性降低[17]。因此最終選擇浸提溫度為50 ℃為最佳萃取條件。

圖1 浸提溫度對板棗酒DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 Effects of extraction temperature on DPPH free radical scavenging rate of jujube wine

圖2 浸提溫度對板棗酒總黃酮的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on total flavonoids of jujube wine

2.2.2 物料比對板棗酒發酵的影響 板棗與山楂的比例會對板棗酒的酒精度和酸度有一定影響，山楂果總糖含量是96.45 g/kg，總酸含量是35.13 g/kg，而板棗的總糖含量是223.65 g/kg，因此隨著山楂添加比例的增加，板棗發酵酒的酒精度就會升高。由圖3可知，隨著山楂添加比例的減少，酒精度由4.7%vol提升到10.2%vol，而過低的酒精度會造成酒體香氣不足，口感寡淡[18]。由圖4 可知，隨著山楂添加量的減少，棗酒總酸也在不斷減少，但是過高的酸度也會降低棗酒的口感[19]，因此采用感官評價為指標探究山楂添加量對棗酒的影響，由表4 可知當板棗與山楂的比在3:1 的時候感官評分最高，此時棗酒的酒體達到更好的平衡。

圖3 物料比（板棗:山楂）對板棗酒酒精度的影響Fig.3 Effects of material ratio (red date:hawthorn) on alcohol of jujube wine

圖4 物料比（板棗:山楂）對板棗酒總酸的影響Fig.4 Effects of material ratio (red date:hawthorn) on total acid of jujube wine

表4 山楂添加量對感官評分的影響Table 4 Effects of hawthorn addition on sensory score

2.2.3 發酵溫度對板棗酒發酵的影響 發酵溫度對板棗酒的發酵時間有一定影響，適當提高發酵溫度可以減少發酵時間，且溫度對酒體感官評價影響較小。由圖5 可知，隨著發酵溫度的增加，發酵時間由11 d縮短到5 d，且發酵溫度達到30 ℃時發酵結束時間最短，隨著溫度的繼續增高，發酵過程中的失重總量減少，得到的酒體酒精度降低，酒體香氣不足。這是由于當發酵溫度較低時，釀酒酵母活性同時降低，其生長繁殖速度較慢，進而使發酵周期延長；隨著溫度的升高，微生物生長繁殖速度加快，但是過高的發酵溫度會使發酵反應劇烈，酵母衰老速度加快，酒體的風味揮發加快，且高溫條件下可能使腐敗微生物加快發育，最終導致板棗酒品質下降，發酵不充分，果酒香味不足，酒精度降低[20]。由圖6 可知發酵溫度為30 ℃時DPPH 自由基清除率最高，這是由于溫度是影響微生物生長發育的重要環境因素，在溫度升高的過程中，微生物的細胞體內會逐漸產生大量的活性氧自由基，為了抵抗高溫脅迫微生物會啟動自己體內的抗氧化系統來消耗自由基；但是過高的溫度會抑制抗氧化酶的分泌[21-22]，因此棗酒的DPPH 自由基清除率在30 ℃時達到最高。綜上所述選擇發酵溫度為30 ℃。

圖5 發酵溫度對板棗酒發酵時間的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on fermentation time of jujube wine

圖6 發酵溫度對板棗酒DPPH 自由基清除率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on DPPH radical scavenging rate of jujube wine

2.3 棗酒發酵工藝優化試驗

2.3.1 神經網絡模擬與遺傳算法優化發酵工藝 通過單因素實驗，選擇物料比、發酵溫度、浸提溫度為自變量，感官評價為響應值，優化棗酒發酵條件。試驗結果見表1 和表5 所示。

表5 Box-Behnkn 優化發酵工藝試驗結果Table 5 Experimental results of Box-Behnkn optimized fermentation

采用Box-Behnkn 試驗來研究不同發酵條件與棗酒感官評價之間的相互作用，共17 組試驗如表5 所示。Box-Behnkn 試驗的前12 組數據作為訓練組，后5 組數據作為測試組，隱藏層采用“3-11-1”的拓撲結構進行神經網絡訓練[23]，進行1000 次實驗，訓練過程進行101 次后預測值與實際輸出結果之間的均方誤差（MSE）小于10-3。此時樣本點集中分布在y=x 直線附近，R=0.99686，說明訓練值與預測值接近，且具有較好的線性關系，神經網絡訓練結果良好，可用于預測。將訓練好的神經網絡模型導入遺傳算法，得到一個更優的板棗發酵的工藝參數：板棗添加量:山楂添加量為2.96:1，發酵溫度29.07 ℃，浸提溫度45.34 ℃，該發酵條件下獲得的棗酒感官評價為82.52 分。為驗證預測結果的可靠性，需進行發酵實驗來驗證。

2.3.2 發酵驗證 為了驗證神經網絡模擬與遺傳算法優化棗酒發酵工藝的可行性，采用最佳發酵條件進行棗酒發酵的驗證實驗，結合實際生產情況以板棗與山楂的比例為2.96:1，發酵溫度29 ℃，浸提溫度45 ℃為發酵條件進行3 次平行實驗，得到實驗結果如表6 所示，實際測得的山楂板棗酒的感官平均評分為81.66，實驗符合值為98.95%。符合DB65/T 2977-2009 果酒生產標準體系總則。

表6 發酵驗證實驗理化指標Table 6 Physical and chemical indexes of fermentation validation experiment

2.4 體外消化實驗

在模擬人體消化系統中，分析了板棗棗漿和板棗酒中酚類化合物含量、抗氧化活性在消化過程中的變化。多酚對果酒的質量有顯著影響，因為這些物質會影響果酒的感官特征，如顏色、澀味和抗氧化性能[24]。由圖7A 可知，板棗棗漿經發酵后得到的板棗酒可產生更多的酚類物質，且在胃消化過程中板棗酒的多酚含量始終高于板棗棗漿，這可能是由于在浸提過程中板棗果皮和果實上的多酚類物質被釋放到酒體中[24]，同時在發酵的過程中，酵母菌會產生有機酸等副產物，這些物質會降低酒體的pH，從而防止酚類化合物的氧化，增加多酚類物質的釋放[14]。在模擬胃消化的過程中，板棗棗漿和板棗發酵酒的多酚含量都有所增加，分別增加了17.62%和16.19%，這可能是由于在胃消化過程中高分子多酚向解聚轉變，以產生大量的酚酸[25]。且由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用，一些蛋白質會被分解釋放出與多酚類物質結合的多肽和氨基酸。這些多肽和氨基酸可以與多酚類物質結合，形成新的復合物[26]，這些多酚衍生物將活性官能團釋放到與福林-Ciocalteu 試劑配合物中，使總酚值明顯增加。DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率都是用來評估化合物抗氧化能力的指標，清除率越高，物質的抗氧化能力越強。由圖7B～圖7C 可知，在胃消化過程中板棗棗漿和板棗發酵酒的抗氧化能力都有所增加，板棗棗漿的DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分別增加了31.15%和17.47%，板棗發酵酒的DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分別增加了22.15%和13.09%。這是由于物質的抗氧化能力與其酚類物質含量有較高相關性[27]，因此在消化過程中隨著酚類物質含量的提高，酒體的抗氧化活性也隨之升高。同時在模擬胃消化過程中胃酸有利于多酚物質的釋放，從而更好地發揮其抗氧化能力[28]。

圖7 胃消化對板棗酒多酚含量（A）、DPPH 自由基清除率（B）、ABTS＋自由基清除率（C）的影響Fig.7 Effects of gastric digestion on polyphenol content (A),DPPH free radical clearance rate (B),and ABTS+ free radical clearance rate (C) of jujube wine

由圖8 可知，在腸消化過程中板棗棗漿的多酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分別增加了35.42%、35.91%和111.45%，板棗發酵酒的酚含量，DPPH 自由基清除率和ABTS＋自由基清除率分別增加了42.06%、22.31%和85.80%。這是由于在腸發酵過程中pH 改善了多酚在小腸中的降解[29]。其次，在小腸中酚類的氧化和聚合產生新的酚類副產物。最后，由于胰酶和膽汁作用，使蛋白質與多酚之間的共價鍵斷裂，釋放出更多的自由酚類物質[30]。由圖8C 可知，在腸消化過程中板棗棗漿和板棗發酵酒的ABTS＋自由基清除率都有顯著提升，分別增加了111.45%和85.80%。這可能是由于多酚類化合物ABTS＋自由基清除率呈pH 依賴性，隨著pH 的增高，自由基清除能力變強，這與多酚化合物芳香環酚性羥基在弱堿性pH 環境下去質子化有關[31]。

圖8 腸消化對板棗酒多酚含量（A）、DPPH 自由基清除率（B）、ABTS＋自由基清除率（C）的影響Fig.8 Effects of intestines digestion on polyphenol content (A),DPPH free radical clearance rate (B),and ABTS+ free radical clearance rate (C) of jujube wine

3 結論

本實驗對板棗酒的發酵工藝進行了研究，以板棗為原料，添加山楂輔料進行板棗酒的發酵。在單因素實驗的基礎上，通過神經網絡模擬與遺傳算法并結合實際生產條件最終確定了最佳工藝條件：板棗與山楂的比例為2.96:1（w/w），發酵溫度29 ℃，浸提溫度45 ℃。在此條件下，得到的棗酒酒精度為9.52%vol，總酸為4.89 g/L，總黃酮1023 mg/L，總酚1056 mg/L，稀釋50 倍條件下DPPH 自由基清除率為55%，酒液澄清，色澤棕黃，香氣協調誘人。進行體外消化研究分析發現板棗棗漿和板棗酒經過消化后總酚含量和抗氧化活性均有所提高。結果表明經體外消化后板棗棗漿和板棗酒在酶和膽汁的作用下總多酚、總黃酮得到充分釋放、整體抗氧化能力得到提高。本研究結果為棗酒發酵工藝提供了數據積累，對板棗資源的綜合利用有一定的積極意義，有利于棗酒產品的進一步研發。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).