特色臘肉源細菌發酵劑對發酵牛肉品質的影響

張秋會，孟高歌，王 晗，曹淑萍，崔文明，祝超智,*，趙改名,*，李付強

（1.河南農業大學食品科學技術學院，河南鄭州 450002；2.滎陽市市場監管綜合行政執法大隊，河南滎陽 450100；3.漣源綜合試驗站，湖南婁底 417000）

臘肉是中國傳統的腌制品[1]，以四川、湖南、云南最廣為人知[2]。但市面上的腌臘肉制品多為手工作坊制作生產，無法通過科學的方式對產品中的微生物生長進行有效調控，會導致產品質量參差、貨架期不穩定，甚至部分有害菌的生長，引起產品質量與安全問題[3]。而我國各地臘肉都具有其獨特的風味、色澤，這都與其發酵微生物息息相關[4]，為肉制品發酵劑的開發及應用提供了無限的可能性。因此，尋找能夠滿足國人對風味要求的發酵肉制品微生物發酵劑，成為肉制品的重要發展方向之一[5-6]。

發酵劑是指活的或休眠狀態的微生物制劑，是用于提高發酵效率的精選微生物制劑[7]。在促進肉制品發酵的同時，還起到抑菌防腐、保證質量的作用，且能產生良好的代謝活性，從而改善發酵肉制品的感官品質[8-10]。在發酵肉制品中，大量的微生物作為發酵劑被用來確保生產安全和高質量的商品[11]，包括乳酸菌[12-13]、酵母菌[14-15]、霉菌[16]、葡萄球菌等。這些微生物的存在對于腌臘肉制品風味、質地、口感以及貯藏時間等均會產生直接影響[17]。相關研究表明，不同種類的菌株具有不同的發酵性能，賦予腌制品不同的品質特性。如，葡萄球菌屬于微球菌屬，在發酵肉制品的成熟過程中通過釋放脂肪酶和蛋白酶，改善產品色澤，增強肉制品風味[18]，并且在產品成熟過程中，具有縮短成熟時間、加快發色以及控制病原菌和腐敗菌生長等作用[19]。Chen 等[5]使用從地方發酵豬肉中分離出來的木糖葡萄球菌與乳酸菌復配發酵，改善香腸的感官特性以及風味特性。Li 等[20]從貴州發酵肉制品中分離出凝固酶陰性葡萄球菌作為發酵劑，可以抑制不良菌生長，改善產品質量以及營養特性。Kanjan 等[21]從發酵魚中分離出葡萄球菌具有足夠的安全性以及功能特性，可以用于開發發酵劑。

本研究基于前期研究結果，將具有較高耐鹽性、耐亞硝鹽性、耐酸性的農家自制臘肉源腸膜明串珠菌和馬葡萄球菌，創新應用于發酵牛肉中，以未接種菌株發酵牛肉為空白組，農家購買的自制臘肉為對照組，對比分析產品的水分含量、水分活度、pH、蛋白質含量、質構、色澤、N-亞硝胺類物質及感官評價等指標差異性，探尋各菌種對發酵肉制品品質及安全特性的影響，探討臘肉源細菌對發酵牛肉產品品質的影響，為發酵肉制品發酵劑開發及其規模化加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉（牛腩）購于河南伊賽公司；四川臘肉、湖南臘肉、信陽臘肉 均為農家自制，放置于-20 ℃冰箱保存，待測；鹽酸萘乙二胺、亞鐵氰化鉀、冰乙酸、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、氫氧化鈉、95%乙醇（以上均為分析純）、NAs 混合標準溶液 購自Sigma 公司。

BYXX-50 型煙熏爐 中國愛博公司；AIRTECH-SW-CJ-2FD 超凈工作臺、BINDER 可編程低溫培養箱、HI99163 便攜pH 計 德國Hanna 公司；AL104 電子天平 梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；AQUALAB 水分活度儀、DMART System5 美國CEM 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵牛肉制作基礎配方 本實驗共設置24 個處理組，其中牛肉均切成30×20×2 cm 的塊狀，發酵牛肉加工的基礎配方為（以1 kg 原料肉計）：花椒0.1 g、食鹽50 g、亞硝酸鈉0.1 g、八角0.05 g、高度酒10 g、白砂糖20 g、小茴香粉2 g、姜粉0.5 g、大蒜粉2 g、白胡椒粉0.5 g。

1.2.2 工藝流程及操作要點 發酵牛肉的工藝參考高偉[22]的方法，并加以修改：牛腩→修整（切條大小均一）→初腌→復腌→發酵→風干→包裝。

操作要點：原料修整：將牛肉切成大小切成30×20×2 cm 的塊狀，大小要均一。初腌：將食鹽5%和花椒0.01%，八角0.005%混勻，放入鍋內炒制；將牛肉條放入無菌盆里，將炒制好的鹽5%撒在牛肉條上，揉搓均勻，蓋上蓋子，腌制1 d（4 ℃）。復腌：加入高度白酒1%、白砂糖2%、小茴香粉0.2%、姜粉0.05%、大蒜粉0.2%、白胡椒粉0.05%、亞硝酸鈉0.01%，每隔半天翻倒一次，使其腌透（4 ℃）。發酵：將腌制好的肉放入新的無菌盆里，接種所目標細菌發酵劑，接種量為106CFU/g（發酵劑制備：在無菌條件下挑取單菌落接種于含50 mL TSB 液體培養基的250 mL 搖瓶中，28 ℃、200 r/min、培養48 h，將制得液體種子培養物（即菌液）離心（4500 r/min）去除培養基，并用生理鹽水對菌體進行洗滌，直至洗滌清澈，取離心管菌體沉淀，備用）。風干：30 ℃發酵48 h 后將發酵好的肉放入煙熏爐中，40 ℃烘干48 h，55 ℃烘干12 h。

1.2.3 指標測定方法

1.2.3.1 pH 產品pH 測定采用《GB 5009.237-2016食品安全國家標準 食品pH 值測定》。

1.2.3.2 水分含量 產品水分活度使用AQUALAB水分活度儀進行測量，將產品粉碎后，把產品均勻平鋪至測量紙上，放入水分含量儀進行測定。

1.2.3.3 水分活度 使用AQUALAB 水分活度儀進行測量，將產品粉碎后，取部分樣品置于樣品池中，使樣品均勻平鋪于樣品池中，水分活度儀進行校準后，放入待測樣品進行測量。

1.2.3.4 蛋白質含量 參照國標《GB 5009.5-2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法測定。

1.2.3.5 亞硝酸鹽含量 參照國標《GB 5009.33-2016 食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法測定。

1.2.3.6 顏色的測定 產品色澤測定選用CR-300 色差儀進行測量，將產品切成大小厚度均勻的圓片，儀器使用標準比色板校準后進行測定。

1.2.3.7 質構特性測定 將發酵牛肉切成1 cm×1 cm×1 cm 大小的方塊，使用P50 探頭進行測定，TPA 參數為：初始力5 N，壓縮比50%，測試速度：60 mm/min。測定項目：硬度（N）、內聚性（Ratio）、彈性（mm）、咀嚼性（mJ）。

1.2.3.8 N-亞硝胺類物質含量 參考國標《GB 5009.26-2016 食品安全國家標準食品中N-亞硝胺類化合物的測定》，利用分散固相萃取（d SPE）-GCMS/MS 方法進行，具體方法如下：

GC 條件：進樣量為10 μL；色譜柱為DB-WAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；升溫程序：初始40 ℃，保持3 min，首先以10 ℃/min從40 ℃升至110 ℃，隨后以15 ℃/min 從110 ℃升至200 ℃，最后以40 ℃/min 從200 ℃升至240 ℃。載氣為高純度氦氣（99.999%），流速為25 mL/min；質譜連接線路溫度為250 ℃。MS/MS 條件：掃描模式為多反應檢測掃描（MRM）；離子源為EI 源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃。

N-亞硝胺類物質主要有硝基二甲胺（NNitrosodimethylamine，NDMA）、N-亞硝基甲乙胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-亞硝基二乙胺（N-nitrosodiethylaminen，NDEA）、N-亞硝基吡咯烷（N-Nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基二丙胺（N-Nitrosodi-n-propylanime，NDPA）、N-亞硝基哌啶（N-Nitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基二丁胺（NNitrosodibutylamine，NDBA）含量相對較高，存在安全風險[23]。亞硝胺具有較強的致癌性[24]，其中常見的有如N-二甲基亞硝胺（NDMA）和N-二乙基亞硝胺（NDEA）[25]。各NAs 的保留時間、定量及定性指標如表1 所示。

表1 八種N-亞硝胺的保留時間、定量和定性離子Table 1 Parameters of eight VNAs and two internal standards determined by GC-MS

1.2.4 感官評價 邀請食品專業20 名學生，組成評定小組，在參與感官評價之前，先講述本次感官評價標準及評價要點，從發酵牛肉的滋味、色澤、風味、咀嚼性和總體可接受度進行評估。在感官評價過程中要求，每品嘗一個樣品，進行漱口，以免樣品之間進行干擾，評定小組成員在評定過程中禁止交流。評定參考標準《DB31 2004-2012》，具體如下，見表2所示。

表2 發酵牛肉感官評分標準Table 2 Sensory scoring standard of fermented beef

1.3 數據處理

所有實驗組均做3 組平行，實驗結果用平均數±標準差表示。采用SPSS 22 統計軟件進行統計學分析，數據間的分析采用單因素方差分析，顯著性水平均設定為P<0.05。使用Origin 2018 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵牛肉產品指標

2.1.1 水分活度和水分含量 水分活度是肉制品的安全指標之一，低水分活度會抑制微生物生長，有效抑制肉制品的腐敗變質，從而延長貨架期[26]。由圖1可知，菌株發酵組的發酵牛肉水分含量顯著低于空白組（P<0.05），其中，腸膜明串珠菌組發酵的牛肉水分含量最低，為34.27%，其次是馬葡萄球菌組發酵的牛肉，含量為35.32%；與農家自制的臘肉對比，農家臘肉的水分含量明顯高于發酵牛肉。這表明與農家臘肉相比，經單一菌株發酵后的牛肉更易于貯藏。兩株菌株發酵組的發酵牛肉水分活度也存在顯著性差異，且都顯著低于其對照組牛肉的水分活度（P<0.05）。同樣發現，空白組牛肉的水分活度顯著低于臘肉（P<0.05），有研究證明，不同的加工工藝與加工參數，會影響香腸的水分含量[27]。這說明通過兩株菌株發酵能夠顯著降低產品的水分含量，延長產品貨架期，同時完善產品加工工藝以及產品加工環境，可以有效阻止細菌生長，延長產品的保質期。

圖1 發酵牛肉及農家臘肉的水分活度和水分含量Fig.1 Water activity and water content of fermented beef and farm cured meat

2.1.2 pH 由表3 可知，空白組與馬葡萄菌發酵組牛肉的pH 沒有顯著性差異且高于其他處理組，而與腸膜明串珠菌組發酵牛肉的pH 存在極顯著差異（P<0.01），由于菌株在發酵過程中，產生酸性物質，使牛肉的pH 下降，在前期試驗中發現，腸膜明串珠菌在產酸能力的測定中明顯高于馬葡萄球菌，故這種菌株發酵的牛肉pH 明顯偏低。同時對比農家自制臘肉，發現信陽臘肉的pH 最低，是由于腸膜明串珠菌來自于信陽臘肉中，產品在生產時受菌株影響，較低的pH 有利于提高產品的微生物安全性。

表3 不同發酵菌株處理組及農家臘肉的理化指標比較Table 3 Physical and chemical data of different fermentation strains and farm bacon

2.1.3 蛋白質含量 如表3 所示，添加發酵菌株發酵牛肉與對照組牛肉的蛋白質含量存在顯著差異（P<0.05）。發現菌株發酵組發酵牛肉的蛋白質含量低于其他實驗組，且兩組發酵組發酵牛肉的蛋白質含量不存在顯著性差異。這是因為在發酵過程中，菌株會產生蛋白酶，使蛋白質降解產生氨基酸等小分子物質[19]。在發酵過程中腸膜明串珠菌和馬葡萄球菌會產生蛋白酶，從而催化蛋白質分解成小分子的多肽和游離氨基酸。與農家自制臘肉相比，經過單一菌株發酵的牛肉蛋白質含量顯著降低（P<0.05），這說明微生物發酵劑具有較強降解蛋白質的能力。而空白組蛋白質含量高的原因可能是在自然發酵時有益菌需要與雜菌進行競爭，數目較少，活性較低。

2.1.4 亞硝酸鹽的含量 隨著人們對健康生活的追求，現在越來越排斥亞硝酸鹽含量過高的肉制品，因為其可能形成能夠致癌的亞硝胺，對人體造成損害，甚至死亡。但目前也有研究認為硝酸鹽的攝入對人體健康會產生有益影響[28]。如表3 所示，與實驗組相比，農家臘肉中亞硝酸鹽的含量低，這是因為其在制作過程中，沒有額外添加亞硝酸鹽，其亞硝酸鹽主要來自于生產過程中所產生的，其中信陽臘肉中亞硝酸鹽含量最低，這與腸膜明串珠菌的存在有著極大的關聯。對比發酵組，發現腸膜明串珠菌發酵組牛肉的亞硝酸鹽含量顯著低于未發酵組牛肉（P<0.05）。這可能是因為腸膜明串珠菌經過發酵，產生乳酸，降解了亞硝酸鹽，從而降低了產品中亞硝酸鹽含量；馬葡萄球菌發酵組牛肉亞硝酸鹽含量也不同程度的低于未發酵組牛肉，說明發酵劑的添加可以有效的降低產品中亞硝酸鹽的殘余[29]。

2.1.5 質構特性 肉制品的質構影響產品在食用時的口感。由表4 所示，不同發酵組牛肉的質構數據存在顯著性差異。對比空白未發酵組產品，腸膜明串珠菌發酵組產品的硬度顯著提升（P<0.05），馬葡萄球菌發酵組硬度略微下降；單一菌株發酵組產品的內聚力與咀嚼性均顯著下降（P<0.05）；彈性數據與未發酵組沒有明顯差異。這可能是在發酵過程中產酸降低了產品的pH，使蛋白質變性，導致產品的保水性降低，從而使結構更加緊密、咀嚼性降低。從數據顯示，較空白組以及自制臘肉，馬葡萄菌發酵組發酵牛肉品質得到一定的改善，硬度降低，內聚力適中，具有適度的咀嚼性與更高的彈性，能夠更好的滿足消費者對產品口感的需求。

表4 不同發酵菌株對牛肉質構影響及農家臘肉的質構Table 4 Effects of different fermentation strains on the texture of beef and farm cured meat

2.1.6 色澤 肉制品顏色是消費者對肉色質量的第一印象，也是消費者對肉品質量進行評價的主要依據，對消費者購買欲影響很大。不同組的臘肉的L*值（亮度），a*值（紅度），b*值（黃度）值如表5 所示。未發酵組牛肉的亮度值顯著高于菌株發酵組牛肉亮度值（P<0.05），這可能是因為腸膜明串珠菌和馬葡萄球菌在發酵過程中引起發酵肉的水分含量與水分活度減小，從而導致發酵肉變得干燥，因而導致發酵肉亮度降低、色澤消失；而四川臘肉和湖南臘肉的紅綠值（a*）顯著低于其他組，四川臘肉的黃藍值（b*）顯著高于其他組（P<0.05），可能是因為所使用原料、發酵以及干燥方式的不同造成的。與自然發酵的臘肉相比，兩株菌株發酵組發酵牛肉的色澤顯著接近空白組牛肉，說明腸膜明串珠菌和馬葡萄球菌作為發酵劑用于發酵肉制品，可以使產品擁有更接近鮮牛肉的色澤。

表5 不同發酵菌株對牛肉色澤影響及農家臘肉的色澤Table 5 Effects of different fermentation strains on the color of beef and the color of farm cured meat

2.1.7 N-亞硝胺含量 不同的發酵牛肉制品的N-亞硝胺化合物含量如表6 所示，可以看出，所有樣品中均未發現NDMA、NMEA、NPYR、NMOR、NDPA、NPIP、NDBA，只檢測出NDEA。如表6 所示，菌株發酵牛肉中NDEA 含量顯著低于未發酵牛肉中NDEA含量（P<0.05），其中腸膜明串珠菌發酵牛肉中NDEA含量最少，為34.45 μg/kg；對比表6 發現，農家自制臘肉中，亞硝酸鹽含量明顯低于發酵組的亞硝酸鹽含量，但是亞硝胺含量明顯高于發酵牛肉，這可能是因為在發酵過程中，發酵菌株發酵可以直接抑制亞硝胺的生成，并抑制亞硝酸鹽分解，生成前體物質，從而提高產品的安全性。湖南臘肉和信陽臘肉中的NDEA 的含量明顯高于實驗制作的發酵牛肉，歸因于傳統的熱煙加工過程中進行的熱處理（60～80 ℃），以及在腌制和干制過程中操作不當，從而使NDEA 含量高。規范化操作和良好的生產環境會影響產品的品質。

表6 不同發酵牛肉的N-亞硝胺化合物含量Table 6 Content of N-nitrosamine compounds in different fermented beef

2.2 感官評價

由表7 可知，單菌株發酵牛肉肉色、口感和氣味有著顯著性差異（P<0.05）。其中，馬葡萄球菌的總體可接受性最高，而且和四川臘肉、湖南臘肉總體可接受性沒有顯著差異性。有研究報道，葡萄球菌具有出色的脂肪分解和蛋白水解能力，有助于發酵食品的香氣化合物產生和感官質量改善[30-31]，這可能是因為該菌分解蛋白質成小分子氨基酸，使其產生獨特的風味。所有處理組產品的口感與表4 質構特性分析結果相符，腸膜明串珠菌發酵組在口感上，明顯小于其他發酵組，這可能是因為乳酸菌發酵過程中產酸，使產品的口感下降。對于各處理組產品的滋味和組織狀態，菌株發酵組和未發酵組的差異性不明顯。因此，兩種臘肉源細菌發酵產品在感官品質總體接受度上和傳統臘肉制品差異性不大，兩種細菌均可以作為發酵劑應用到發酵肉制品生產中。

表7 不同發酵牛肉的感官評價Table 7 Sensory evaluation of different fermented beef

3 結論

通過對比研究兩種臘肉源細菌發酵牛肉產品和傳統臘肉產品品質的差異性，發現兩株菌株單菌株發酵產品亞硝胺含量，顯著低于傳統臘肉制品；彈性顯著高于傳統產品；腸膜明串珠菌發酵產品咀嚼性和四川臘肉沒有顯著差異性；馬葡萄球菌發酵產品的硬度顯著低于其他處理,而且馬葡萄球菌發酵產品的整體接受性最高，和四川臘肉及湖南臘肉沒有顯著差異性。因此，兩株細菌都可以作為發酵劑應用于肉制品加工，未來可以考慮將兩種菌株進行復配發酵，綜合改善產品品質，提高產品安全性。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).