豆醬源枯草芽孢桿菌S1-2 產細菌素分離鑒定及其穩定性研究

張淘崴，烏日娜,3，紀帥奇，婁夢雪，馬 穎，武俊瑞,3,*

（1.沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省食品發酵技術工程研究中心，遼寧沈陽 110161；3.沈陽市微生物發酵技術創新重點實驗室，遼寧沈陽 110866）

芽孢桿菌（Bacillus）因其培養條件簡單、生長周期短等特性，在食品、醫藥、農業、林業、畜牧業等行業應用廣泛[1]。芽孢桿菌作為益生菌不僅能夠分泌蛋白酶等常用酶，還可以分泌脂肽、細菌素等抑菌物質，在酸奶、豆醬、納豆等傳統發酵食品的制作中有悠久的應用歷史[2-3]。早在上個世紀，研究者就發現了芽孢桿菌能分泌多種抗菌活性物質[4]，包括脂肽類、細菌素以及其他小分子物質，能抑制細菌、真菌，甚至病毒[5]。

細菌素是優秀的天然防腐劑，抑菌譜較窄但對近緣致病菌有針對性，易于分解不致生態環境污染[6]。近年來，已有大量關于芽孢桿菌細菌素的報道。芽孢桿菌屬能產生多類細菌素，包括subtilin、mersacidin、subtilosin A 等[7]。細菌素subtilosin A的合成基因簇已有較詳細的研究，紀帥奇等[8]通過全基因組測序結合生信分析挖掘出一株枯草芽孢桿菌的細菌素subtilosin A 的完整合成基因簇。此外，subtilosin A 已確認為套索肽，但其三級結構尚未確定，Ishida 等[9]使用拉曼光譜法初步探究了subtilosin A 中AlbEF 復合物的環化機制。由此可見，目前芽孢桿菌細菌素研究已有一定深度，但在細菌素結構與穩定性等方面有缺失，芽孢桿菌細菌素的穩定性研究能夠為芽孢桿菌細菌素的結構研究提供有力支持。

豆類發酵食品的發酵過程需要芽孢桿菌的參與來分解豆類蛋白，是芽孢桿菌的資源庫[10-13]。本研究從東北地區傳統發酵豆醬樣品中篩選并鑒定出一株抑菌活性較強的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）S1-2 為試驗菌株，設計試驗對細菌素進行純化鑒定、穩定性質以及抑菌機制方面的研究分析，旨在挖掘和探索枯草芽孢桿菌S1-2 及其細菌素在食品生物防腐中的應用潛力和價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆醬樣品采自遼中地區農家自然發酵的豆醬，發酵天數為49 d；枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）S1-2、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC 25923、大腸桿菌（Escherichiacoli）ATCC 25922、單增李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 19115、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）ATCC14028 均為沈陽農業大學食品學院微生物菌種庫提供；LB 培養基 北京奧博星生物技術有限公司；乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉、乙腈、三氟乙酸 上海麥克林生化科技有限公司；蛋白酶K（40 U/mg）、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）北京索萊寶科技有限公司。

YT-PCR 儀 山東云唐智能科技有限責任公司；Eon 酶標儀 美國Biotek 公司；Dionex P680 半制備反相高效液相色譜 美國Dionex 公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；Regeulus 8100 冷場發射掃描電子顯微鏡 日本日立高科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆醬中芽孢桿菌的分離篩選和鑒定 參考Arbulu 等[14]的方法，取豆醬樣品于試管，經85 ℃水浴加熱20 min 后稀釋，涂布于LB 固體培養基培養后挑取單菌落培養，同時進行革蘭氏染色與孔雀石綠染色試驗，選取細長桿狀菌體采用瓊脂打孔法，打孔直徑為5 mm，以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌作為指示菌進行抑菌試驗，觀察抑菌圈并測定抑菌圈直徑。參考劉曉萌等[15]的方法，對比抑菌效果后選取較好的菌株活化并提取DNA，用引物對27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'）/1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）和42F（5'-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3'）/1066R（5'-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGC T-3'）分別對16S rDNA 與持家基因gyrA進行PCR擴增，PCR 反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃1 min，72 ℃ 2 min，30 個循環；72 ℃延伸10 min。送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序。在NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/）中選擇同源性較高的19 株模式菌株的序列通過MEGA 11.0 軟件構建系統發育樹。

1.2.2 芽孢桿菌細菌素的分離純化 離心菌液得到上清液，采用乙酸乙酯萃取法初步分離得到粗樣[16]，再通過抑菌試驗驗證抑菌活性，通過考馬斯亮藍法驗證蛋白質含量[17]，于4 ℃保存備用。選用葡聚糖凝膠Sephadex-G50 進行純化，在280 nm 處測定有抑菌效果的峰通過HPLC 純化。采用Tricine-SDSPAGE 來鑒定細菌素的分子量，將目的條帶委托上海厚基生物科技公司通過LC-MS/MS 進行鑒定。

1.2.3 芽孢桿菌S1-2 細菌素的抑菌活性 按照張煒等[18]的方法測定細菌素對指示菌的最小抑菌濃度（MIC）。將金黃色葡萄球菌指示菌按照2%接種量接種于液體LB 培養基中，加入細菌素，使濃度達到10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.313 和0.156 mg/mL，設置空白對照，培養24 h 觀察指示菌生長狀況。加入細菌素使濃度達到0.8×MIC，設置乙酸乙酯對照組和與空白對照組，在24 h 內每2 h 檢測600 nm 處的吸光值，繪制生長曲線[19]。

1.2.4 芽孢桿菌S1-2 細菌素對熱、酸、堿、蛋白酶的穩定性研究 取經HPLC 純化后的樣品凍干溶解于磷酸鹽（PBS）緩沖液，分裝于1.5 mL 離心管中，每管加入1 mL，進行溫度、pH、蛋白酶的單因素實驗測試細菌素穩定性；溫度單因素實驗設置為將細菌素分別置于20、40、60、80、100、120 ℃條件下處理20 min；pH 單因素實驗設置為將細菌素樣品使用NaOH 或HCl 將pH 調整至1～10 的整數混勻靜置1 h 后調至7.0，之后使用無菌水定容；蛋白酶單因素實驗設置為使用20 mg/mL 的蛋白酶K 酶液、胰蛋白酶液、胃蛋白酶液與樣品1:20 混合并置于37 ℃處理2 h 后，置于70 ℃處理10 min 使酶滅活。三組單因素均以金黃色葡萄球菌作為指示菌，采用瓊脂打孔法進行抑菌活性測定，測量抑菌圈直徑。

1.3 數據處理

試驗均設置空白對照與三組平行實驗。實驗數據通過Excel 2021 整理，結果用平均值±標準偏差表示，采用SPSS 17.0 軟件對數據進行顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著，利用Graphpad Prism 9.0 進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌S1-2 的分離篩選和鑒定

芽孢桿菌在豆醬中含量豐富[20-21]。根據革蘭氏染色與菌落形態觀察，本次試驗共篩選分離出6 株菌株疑似芽孢桿菌，分別命名為SP、S1、S1-2、S1-3、S2、S2-3 并進行了抑菌試驗比對它們的抑菌效果，抑菌直徑結果如表1 所示。

表1 芽孢桿菌對指示菌的抑菌圈直徑（mm）Table 1 Diameter of the antibacterial zone of Bacillus against indicator bacteria (mm)

由表1 可以看出，6 株菌均有一定的抑菌效果，且對革蘭氏陽性菌的抑菌效果遠高于革蘭氏陰性菌，其中菌株S1-2 抑菌效果較為突出，菌株S2-3 則表現較差。因此選取菌株S1-2 進行PCR 初步鑒定后送樣進行16S rDNA 測序。測序結果顯示菌株S1-2 與枯草芽孢桿菌同源性為100%，與其他一些芽孢桿菌的同源性也達到了99%以上。為進一步驗證種屬鑒定結果的準確性，又對持家基因gyrA進行測序與比對[22]，測序結果仍顯示菌株S1-2 與枯草芽孢桿菌同源性為100%，確定菌株S1-2 為枯草芽孢桿菌。最終基于16S rDNA 與gyrA序列在NCBI 數據庫選擇在種屬水平上最接近的20 株模式菌（圖1）。

圖1 基于16S rDNA（A）、gyrA（B）構建的枯草芽孢桿菌S1-2 系統發育樹Fig.1 Phylogenetic trees of Bacillus subtilis S1-2 based on 16S rDNA (A) and gyrA (B)

2.2 細菌素的鑒定

2.2.1 抑菌活性試驗 使用瓊脂打孔法，對純化后的細菌素進行抑菌的廣譜性研究，實驗結果如圖2所示。

圖2 細菌素對供試金黃色葡萄球菌（a）、大腸桿菌（b）、單增李斯特氏菌（c）和沙門氏菌（d）抑菌圖片Fig.2 Bacteriocin against Staphylococcus aureus (a),Escherichia coli (b),Listeria monocytogenes (c)and Salmonella (d)

經測量，細菌素對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌抑菌圈直徑結果分別為：14.06±0.48、8.61±0.10、19.97±0.54、9.23±0.08 mm。抑菌試驗結果表明，枯草芽孢桿菌S1-2 產生的細菌素對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌效果不明顯，對金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的抑菌效果明顯，乙酸乙酯對四種致病菌均無抑制作用，排除了乙酸乙酯未除盡對細菌素抑菌活性造成影響的可能。由此可初步推斷，該細菌素可對革蘭氏陽性菌有突出的抗菌能力，對革蘭氏陰性菌的抑菌效果不明顯，有待進一步研究。此外，本次試驗抑菌圈直徑遠大于菌種初篩時的抑菌試驗結果，表明抑菌物質濃度顯著提高，即得到了純化。

2.2.2 SDS-PAGE 結果分析 由于一般的SDSPAGE 在低分子區內條帶容易彌散且分辨率低[23]，而細菌素的分子量不確定且I 類細菌素分子量通常小于5 kDa，本試驗采用了Tricine-SDS-PAGE，電泳結果如圖3 所示。

圖3 HPLC 純化后的Tricine-SDS-PAGE 結果Fig.3 Results of Tricine-SDS-PAGE after purification by HPLC

電泳結果顯示，經過HPLC 純化后的蛋白樣品，在4.1 kDa 下方有一條明顯條帶，由此可知，該條帶的分子量小于4.1 kDa。這也說明在經過兩步純化后，細菌素的純度提升，從而可以更精準的定位細菌素分子量的大小。

2.2.3 LC-MS/MS 結果分析 將經Tricine-SDSPAGE 驗證，純化濃縮后的蛋白在4.1 kDa 以下單一條帶切下，進行LC-MS/MS 鑒定。質譜測試原始文件用軟件MaxQuant1.5.5.1 檢索枯草芽孢桿菌的數據庫，得到蛋白質鑒定結果如表2 所示。

表2 LC-MS/MS 的部分蛋白鑒定結果Table 2 Partial protein identification results of LC-MS/MS

根據LC-MS/MS 鑒定結果，將鑒定出的蛋白依據Score 值、序列的覆蓋率、相對分子質量進行綜合分析，推測該抗菌物質為Ⅱa 類細菌素subtilosin A。文獻指出，subtilosin A 的分子量約為3 kDa[24]，這也印證了Tricine-SDS-PAGE 的結果。

2.3 細菌素的抑菌活性

2.3.1 細菌素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度最小抑菌濃度試驗結果如表3 所示，細菌素濃度為0.625 mg/mL 時溶液介于渾濁與澄清，因此細菌素對金黃色葡萄球菌的最小抑制濃度為0.625 mg/mL。

表3 細菌素對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table 3 Minimum inhibitory concentrations of bacteriocin against Staphylococcus aureus

2.3.2 金黃色葡萄球菌生長抑制曲線分析 菌液在600 nm 處的吸光度（OD600 nm）可以用來表征并比較菌液中細菌數目變化，從而間接反映細菌素對菌體影響情況[25]。結果如圖4 所示。

圖4 金黃色葡萄球菌生長抑制曲線Fig.4 Growth inhibition curves of Staphylococcus aureus

由圖4 可以看出，乙酸乙酯處理組金黃色葡萄球菌生長曲線與無菌水處理組相比無明顯變化，表明萃取溶劑對金黃色葡萄球菌生長無影響，這也與抑菌試驗中乙酸乙酯對病原指示菌無抑菌效果相對應。而加入細菌素的試驗組與對照組相比，從4 h 開始，不同時間段菌液OD600 nm 明顯降低，表明細菌素對金黃色葡萄球菌菌體的生長有較好的抑制作用。

2.4 細菌素穩定性的研究

2.4.1 溫度對細菌素抑菌活性的影響 以20 ℃作為溫度處理組空白對照，結果如圖5 所示。

圖5 溫度對細菌素抑菌活性的影響Fig.5 Effects of temperature on antibacterial activity of bacteriocin

由圖5 可以看出，細菌素對熱不敏感。在20～60 ℃溫度范圍內，抑菌直徑基本保持不變，表明細菌素的抑菌活性受溫度影響較小，溫度穩定性較好；當溫度上升至80 ℃時，抑菌活性出現下降趨勢，與對照組相比，抑菌活性下降了15%；在處理100 ℃與120 ℃時，雖然抑菌直徑大小明顯下降，但也會大致維持在15 mm 左右的水平，抑菌活性仍然存在。

2.4.2 pH 對細菌素抑菌活性的影響 以pH 為7.0的細菌素處理組作為空白對照，觀察細菌素經過不同pH 處理后對金黃色葡萄球菌的抑制效果，結果如圖6 所示。

圖6 pH 對細菌素抑菌活性的影響Fig.6 Effects of pH on antibacterial activity of bacterioncin

由圖6 可以看出，細菌素對酸性和堿性都具有良好的穩定性。與對照組（pH7.0）相比，pH 在6.0～8.0 范圍內，抑菌活性基本無變化；當pH 小于4.0時，抑菌直徑明顯下降；當pH 為1.0 時，抑菌直徑下降至pH 為7.0 的49.13%，但仍表現出一定的抗菌能力；特別地，細菌素對于堿的耐性要優于酸。總之，細菌素pH 耐受范圍較寬，具有良好的酸堿穩定性。因此，在實際應用中，環境酸堿性的改變對細菌素的活性影響較小。

2.4.3 蛋白酶對細菌素抑菌活性的影響 細菌素經蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶處理后的抑菌效果如圖7 所示。

圖7 蛋白酶對細菌素抑菌活性的影響Fig.7 Effects of proteases on antibacterial activity of bacterioncin

經蛋白酶K 處理后的抑菌直徑與對照組相比，活性明顯下降，說明細菌素會被蛋白酶K 分解。而胃蛋白酶處理后，抑菌直徑下降至53.02%；胰蛋白酶處理后活性下降至78.45%。這表明該抑菌物質可被蛋白酶K 分解，且被人產生的胃蛋白酶及胰蛋白酶分解，由于脂肽基本不受蛋白酶影響[26]，排除了該抑菌物質為脂肽的可能性，印證了該抑菌物質是細菌素。試驗結果可以推測，該細菌素可以應用于食品防腐劑領域，因為其可被消化系統產生的酶分解，不會對人體自身的腸道菌群造成負擔，從而不會危害人體健康。

3 討論與結論

芽孢桿菌在代謝過程中會分泌一種或多種抑菌活性物質，細菌素作為其次級代謝產物之一，具有抑菌范圍廣、理化性質穩定、安全性優良等優點，成為抗生素類抑菌制劑的理想替代品，因此，芽孢桿菌成為食品及醫學行業的重要研究對象[27]。

有機溶劑萃取法是硫酸銨沉淀法的有效替代，該粗提方法的粗提液蛋白質含量合適，抑菌效果明顯，且乙酸乙酯可以通過蒸餾完全去除，對后續的純化過程影響極小。本研究曾使用硫酸銨沉淀法作為粗提方法，粗提物卻未表現出抑菌活性，可能為硫酸銨濃度不當，或有機溶劑萃取法回收率更高從而能更好的提取此菌株的抑菌物質，有待進一步驗證[28-30]。后續的純化過程依據了細菌素的分子量選用了葡聚糖凝膠Sephadex-G50 進行分離純化，以280 nm 處測定的吸光度分批檢驗出具有抑菌效果的峰值[30]，并通過HPLC 進一步純化，經Tricine-SDS-PAGE 試驗與LC-MS/MS 鑒定表明最終得到的細菌素為subtilosin A。

subtilosin A 對常見食源性革蘭氏陽性致病菌有明顯的抑制效果，對常見食源性革蘭氏陰性致病菌效果不明顯。大量文獻表明subtilosin A 的抑菌機制為結合與攻擊細菌的細胞膜[31]，但據Algburi 等[32]的觀點，subtilosin A 還有通過抑制細菌群體感應阻止生物膜形成等其他抑菌機理，具體抑菌機制與相關通路仍需通過其他手段進一步探明。

食品加工和貯藏過程中，溫度和pH 會因工藝條件、時間和環境等因素而發生變化[33-34]，食品中使用的細菌素對熱、酸、堿等條件的穩定性至關重要。環狀細菌素因其高pH 和熱穩定性而聞名[35]，subtilosin A 作為套索肽具有環狀結構，有與環狀細菌素相似的特性：在20～60 ℃溫度范圍內的抑菌效果基本不受影響，在100～120 ℃下抑菌能力雖然下降但仍表現出良好活性，對高溫有耐受性，有望應用在乳制品等需要高溫處理的食品；該細菌素最適pH 處于6.0～8.0 偏中性的范圍，耐酸堿條件范圍較寬，具有良好的酸堿穩定性，且根據Nalisa 等[24]的研究，即使是長時間的酸處理也無法使subtilosin A 失活；與Epparti等[36]的試驗結果一致，酶處理穩定性試驗表明，該細菌素可被蛋白酶K 分解，也可以被消化系統產生的胰蛋白酶與胃蛋白酶分解，不會對人體自身的腸道菌群造成負擔，有應用于食品防腐劑領域的潛力。

本試驗對傳統發酵食品豆醬的菌種篩選中表現出突出抑菌活性的菌株S1-2 進行了進一步研究。根據16S rDNA 與持家基因gyrA測序結果確認該菌株為枯草芽孢桿菌，后續的試驗鑒定該菌株能夠產生細菌素subtilosin A 并測定了該細菌素的抑菌活性與穩定性，證明了枯草芽孢桿菌S1-2 與其所產細菌素的應用潛力。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).