一株產(chǎn)L-蘋果酸黑曲霉菌株的誘變篩選及發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

劉書彤，石冰冰，譚奕陽(yáng)，厲成偉，魏彩霞，王德培,3，薛鮮麗,3,*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.山東日照金禾博源生化有限公司，山東日照 276800；3.工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-蘋果酸，又名L-羥基琥珀酸，分子式C4H6O5，為白色結(jié)晶或結(jié)晶性粉末，易溶于水和乙醇[1]，被廣泛運(yùn)用于合成材料、化妝品、飼料添加劑、食品調(diào)節(jié)劑以及藥物合成等領(lǐng)域[2]。尤其是近年來(lái)，L-蘋果酸的需求量不斷上升，在全球的年需求量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了20 萬(wàn)噸。利用微生物代謝發(fā)酵法生產(chǎn)L-蘋果酸已經(jīng)成為極其高效的生產(chǎn)方法之一，但是目前仍然存在著菌株選擇性少、雜酸水平高等問(wèn)題有待解決[3-4]。其中曲霉屬是已知的最好的產(chǎn)L-蘋果酸的菌株[5]，Battat 等[6]使用黃曲霉菌株Aspergillus flavusKyowa A-114（ATCC 13697）在16 L 的發(fā)酵罐中連續(xù)發(fā)酵192 h 最終產(chǎn)量高達(dá)113 g/L，產(chǎn)率為0.59 g/L/h，但黃曲霉在發(fā)酵過(guò)程中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素，不適合應(yīng)用于食品發(fā)酵領(lǐng)域。除此之外，West等[7]在米曲霉AspergillusoryzaeNRRL 3488 中對(duì)菌株進(jìn)行改造并優(yōu)化發(fā)酵后，發(fā)酵164 h，生產(chǎn)蘋果酸154 g/L，產(chǎn)率為0.94 g/L/h，這是目前已報(bào)道的發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸速率最高的菌株。

黑曲霉（Aspergillusniger）被美國(guó)FDA 認(rèn)定為GRAS（Generally Recognized as Safe）菌株[8]，且作為工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸、沒(méi)食子酸等有機(jī)酸及淀粉酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等蛋白酶的優(yōu)良菌株，其發(fā)酵的產(chǎn)品可以被廣泛運(yùn)用于有機(jī)肥料、有機(jī)飼料以及食品添加劑等。我國(guó)是全球檸檬酸生產(chǎn)最大國(guó)，2021 年全球產(chǎn)量240 萬(wàn)噸，我國(guó)為168 萬(wàn)噸占全球70%，其生產(chǎn)檸檬酸的關(guān)鍵在于具有高效分泌檸檬酸能力的黑曲霉菌株。張鴻飛等[9]以玉米清化液為原料，利用黑曲霉發(fā)酵60 h 生產(chǎn)檸檬酸，其產(chǎn)量可達(dá)18.33 g/100 mL，具有產(chǎn)酸水平高、產(chǎn)酸速度快、成本低等優(yōu)勢(shì)，其極高的碳轉(zhuǎn)化率以及低pH 耐受性使其成為非常有潛力的有機(jī)酸生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。目前，黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的研究還不成熟，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，因此，對(duì)黑曲霉菌株進(jìn)行誘變篩選，并建立利用黑曲霉菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的發(fā)酵體系，對(duì)L-蘋果酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要現(xiàn)實(shí)意義[10-11]。

本研究通過(guò)對(duì)野生型黑曲霉菌株進(jìn)行誘變，篩選產(chǎn)L-蘋果酸黑曲霉菌株，以菌球生長(zhǎng)速度、L-蘋果酸產(chǎn)量、殘?zhí)橇康葹橹笜?biāo)探究不同培養(yǎng)條件對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)及L-蘋果酸生產(chǎn)的影響，最終確定黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的最佳培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉菌株 由本實(shí)驗(yàn)室保藏的野生型菌株；黑曲霉菌株CGMCC NO.40550 本研究通過(guò)紫外誘變所得，由中國(guó)微生物菌種保藏中心保藏；無(wú)水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨 天津市北方天醫(yī)試劑公司；硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、五水合硫酸銅、硫酸錳、七水合硫酸鋅、氯化鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、甘油（以上試劑均為分析純）北京市索來(lái)寶科技有限公司。

LRH-250A 生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；WXL-A30002 電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LDZX-50FB 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；CX23 型光學(xué)顯微鏡OLYMPUS 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 PDA 培養(yǎng)基（1 L）：土豆汁、葡萄糖2%、瓊脂粉2%。

初始種子培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖80 g，10×微量元素100 mL，500 mL 三角瓶裝液量 30 mL，115 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖180 g，10×微量元素100 mL，CaCO38%，500 mL 三角瓶裝液量50 mL，115 ℃滅菌20 min。

1.2.2 紫外誘變及正突變體的篩選方法 以黑曲霉菌株CGMCC NO.10142 為出發(fā)菌株，斜面生長(zhǎng)6 d的新鮮孢子，無(wú)菌ddH2O 清洗并通過(guò)Miracloth 過(guò)濾收集，經(jīng)小玻璃珠打散，獲得孢子懸液，于30 ℃、180 r/min 下分別孵育2 h 進(jìn)行吸水膨脹，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋到濃度為1×107個(gè)/mL。取100 μL孵育后孢子懸液于誘變小皿中進(jìn)行紫外照射10 min，稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基平板，進(jìn)行正突變體的篩選[12-13]。

正突變體的篩選通過(guò)平板透明圈法，在PDA 培養(yǎng)基中加入CaCO3，黑曲霉分泌的蘋果酸與平板中CaCO3反應(yīng)從而分解CaCO3形成透明圈[14-16]。同時(shí)通過(guò)添加放線菌酮的平板進(jìn)行菌株形態(tài)差異篩選，放線菌酮作為一種蛋白合成抑制劑，對(duì)霉菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生一定抑制作用，可以有效提高菌落之間的形態(tài)差異[17-18]。取紫外誘變篩選到的正突變體在PDA 斜面上生長(zhǎng)6 天的新鮮孢子，用無(wú)菌ddH2O 清洗，并通過(guò)Miracloth 過(guò)濾收集，經(jīng)小玻璃珠打散，獲得孢子懸液，稀釋到濃度為1×108個(gè)/mL，取100 μL 孢懸液于含有10 μg/mL 放線菌酮的PDA+CaCO3初篩培養(yǎng)基中誘變培養(yǎng)24 h，使用基于菌落形態(tài)的篩選策略，最終篩選出了一株L-蘋果酸產(chǎn)量最高的菌株。

1.2.3 種子培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.2.3.1 轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉菌球形態(tài)的影響 正突變體菌株斜面生長(zhǎng)6 d 的新鮮孢子，無(wú)菌ddH2O 清洗并通過(guò)Miracloth 過(guò)濾收集，經(jīng)小玻璃珠打散，獲得孢子懸液，接種到種子培養(yǎng)基中。種子培養(yǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)速分別設(shè)置300、250、220、180 r/min，種子接種量為1×106個(gè)/mL，培養(yǎng)溫度37 ℃，種子培養(yǎng)基30 mL，分別培養(yǎng)至48 h 和72 h，菌球形態(tài)在40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行。

1.2.3.2 種子培養(yǎng)基pH 選擇 以初始種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，微量元素以及糖濃度相同的情況下，探究初始pH 對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)及發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響。調(diào)整種子培養(yǎng)基pH 分別為3.0、3.7、5.0、6.0，接種量為1×106個(gè)/mL，250 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)24 h。接著補(bǔ)加60 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基，220 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)48、72、96 h。每組做三個(gè)平行試驗(yàn)，以最終菌絲球形態(tài)、菌球數(shù)及L-蘋果酸產(chǎn)量為參考值，確定種子培養(yǎng)基的最終pH。

1.2.3.3 種子培養(yǎng)基碳源濃度選擇 調(diào)整初始種子培養(yǎng)基的糖濃度，探究初始糖濃度對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響。在種子培養(yǎng)基中分別添加60、80、100、120 g/L 的葡萄糖，考察不同碳氮比對(duì)L-蘋果酸產(chǎn)量的影響。每組做三個(gè)平行，以最終菌絲球形態(tài)、菌球數(shù)及L-蘋果酸產(chǎn)量為參考值，確定種子培養(yǎng)基的最終葡萄糖濃度。

1.2.3.4 種子培養(yǎng)基氮源種類選擇 調(diào)整初始種子培養(yǎng)基的氮源，探究初始氮源種類對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響。為了保證氮含量相同，在種子培養(yǎng)基中分別添加硫酸銨4.59 g/L、氯化銨3.7 g/L、黃豆餅粉2.97 g/L、酵母浸粉9.9 g/L、蛋白胨6.9 g/L作為有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源，分別加入種子培養(yǎng)基中。每組做三個(gè)平行試驗(yàn)，以最終菌絲球形態(tài)、菌球數(shù)及L-蘋果酸產(chǎn)量為參考值，確定種子培養(yǎng)基的最佳氮源。

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基成分選擇

1.2.4.1 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源濃度選擇 優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基220 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)24 h 后，向培養(yǎng)基中補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基體積比為2:1。其中葡萄糖含量分別為140、160、180 g/L，220 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)72 h，考察發(fā)酵培養(yǎng)基中不同糖濃度對(duì)L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，每組做三個(gè)平行，測(cè)定最后的L-蘋果酸產(chǎn)量、菌球數(shù)及殘?zhí)橇浚_定發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳糖濃度。

1.2.4.2 發(fā)酵培養(yǎng)基金屬離子種類選擇 對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中金屬元素 Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+對(duì)L-蘋果酸合成影響進(jìn)行試驗(yàn)。菌株在優(yōu)化后的種子培養(yǎng)基，220 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)基中補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基。將MgSO4、CuSO4、ZnSO4、MnSO4、Fe2（SO4）3、FeSO4分別以0.05 g/L 添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖床培養(yǎng)72 h。每組做三個(gè)平行，測(cè)定最后的L-蘋果酸產(chǎn)量、菌球數(shù)及殘?zhí)橇浚_定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適金屬離子。

1.2.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)基金屬離子濃度選擇 將最適金屬離子以0.004、0.006、0.010、0.012 g/L 添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，220 r/min，37 ℃，搖床培養(yǎng)72 h，考察金屬離子濃度對(duì)L-蘋果酸產(chǎn)量的影響。每組做三個(gè)平行，測(cè)定最后的L-蘋果酸產(chǎn)量、菌球數(shù)及殘?zhí)橇浚_定發(fā)酵培養(yǎng)基的最適金屬離子濃度。

1.2.5 測(cè)定指標(biāo)

1.2.5.1 菌球數(shù)的測(cè)定 發(fā)酵過(guò)程中生物量以菌球數(shù)多少計(jì)算。將發(fā)酵液均勻后稀釋100 倍，吸取菌球制片，用顯微鏡進(jìn)行鏡檢觀察；將發(fā)酵液混勻后，稀釋100 倍，渦旋混勻，使菌球均勻懸浮后取0.1 mL至載玻片上進(jìn)行菌球計(jì)數(shù)，每組計(jì)數(shù)3 次作為平行。

1.2.5.2 還原糖的測(cè)定 還原糖濃度選擇DNS 法進(jìn)行測(cè)定[19]。取2 mL 發(fā)酵液置于8000 r/min 離心15 min，取上清液稀釋120 倍后，向比色管中分別加入發(fā)酵液、蒸餾水和DNS 試劑，配制成反應(yīng)液，煮沸5 min 后，加蒸餾水定容至25 mL。用分光光度計(jì)測(cè)試540 nm 下的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算葡萄糖濃度。

1.2.6 L-蘋果酸濃度測(cè)定

1.2.6.1 發(fā)酵液的處理 取發(fā)酵液2 mL，8000 r/min離心15 min，取0.1 mL 上清與1.9 mL 的10 mmol/L硫酸溶液進(jìn)行混合，渦旋混勻；離心過(guò)的發(fā)酵液棄上清，補(bǔ)加10 mmol/L 硫酸到2 mL 重懸，混勻后靜置15 min，重復(fù)2～3 次后用10 mmol/L 硫酸溶液將其稀釋20 倍。用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾至液相小瓶，進(jìn)行HPLC（High Performance Liquid Chromatography）分析。

1.2.6.2 L-蘋果酸HPLC 的定量分析 選用HPLC的方法對(duì)L-蘋果酸定量分析。樣品用10 mmol/L 硫酸溶液進(jìn)行酸化處理，用0.22 μm 的濾膜過(guò)濾至液相小瓶，進(jìn)行HPLC 分析[20]。

檢測(cè)條件：色譜儀型號(hào)Waterse2695，檢測(cè)器Waters2996；進(jìn)樣量10 μL；流速0.6 mL/min；流動(dòng)相5 mmol/L 硫酸溶液。

1.2.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用HPLC 建立L-蘋果酸、富馬酸、琥珀酸不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別配制0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1 g/L 的L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，2.5、5、10、12.5、25、50、75 mg/L 的富馬酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC 分析，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6.4 L-蘋果酸濃度計(jì)算 發(fā)酵液酸化并進(jìn)行HPLC 分析后，記錄L-蘋果酸的峰面積為y，代入標(biāo)曲中計(jì)算得出L-蘋果酸濃度x。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線y=814.31x+20.755，R2=0.9974：

式（1）中：L-蘋果酸終濃度以g/L 計(jì)。

1.2.6.5 L-蘋果酸發(fā)酵強(qiáng)度及糖酸轉(zhuǎn)化率分析 以發(fā)酵產(chǎn)物的L-蘋果酸生產(chǎn)速率來(lái)衡量發(fā)酵強(qiáng)度，計(jì)算公式為：

式（2）中：L-蘋果酸終濃度以g/L 計(jì)，發(fā)酵時(shí)間以h 計(jì)。

Xi 等[21]認(rèn)為當(dāng)葡萄糖完全通過(guò)乙醛酸循環(huán)途徑代謝生產(chǎn)L-蘋果酸時(shí)，1 mol 葡萄糖轉(zhuǎn)化為1 mol L-蘋果酸，反應(yīng)式如下：

此時(shí)糖酸轉(zhuǎn)化率即被利用的葡萄糖的物質(zhì)的量與發(fā)酵產(chǎn)生的L-蘋果酸的物質(zhì)的量之比，是衡量發(fā)酵效率的重要指標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均有三個(gè)平行，顯示的所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均代表從三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)中獲得的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三個(gè)獨(dú)立的重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析，使用ANOVA 進(jìn)行方差分析，使用LSD 進(jìn)行差異性檢驗(yàn),數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著[22]。依據(jù)相應(yīng)的計(jì)算公式，利用Origin 2021 繪制圖片，并進(jìn)行相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的誘變及篩選結(jié)果

紫外誘變后篩選到的正突變體經(jīng)過(guò)傳代，孢子懸液點(diǎn)種到加有10 μg/mL 放線菌酮初篩平板上，進(jìn)行產(chǎn)酸透明圈分析。如圖1a 所示，以出發(fā)菌株作為對(duì)照菌株，對(duì)照菌株無(wú)透明圈形成，所得到的正突變體菌株能形成明顯的透明圈，即為黑曲霉菌株CGMCC NO.40550。待菌株在平板上生長(zhǎng)至第4 d，取平板上形成的產(chǎn)酸透明圈1 cm2，溶解于10 mmol/L H2SO4中酸化進(jìn)行過(guò)夜處理，后取上清過(guò)膜除菌，用于HPLC 產(chǎn)酸分析。結(jié)果如圖1b 所示，L-蘋果酸和富馬酸標(biāo)準(zhǔn)品分別在9.45 min 和14.26 min 出現(xiàn)峰，參照標(biāo)準(zhǔn)品HPLC 結(jié)果，對(duì)照菌株并無(wú)L-蘋果酸的峰，而正突變體菌株所形成的透明圈含有富馬酸的最大峰，其次是L-蘋果酸的峰以及其他有機(jī)酸較小的峰。為分析其L-蘋果酸的百分比含量，分別制備L-蘋果酸、琥珀酸和富馬酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1c），從結(jié)果中可以看出，其濃度跟峰面積呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，其中琥珀酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=583.09x+0.55819（R2=0.9983），L-蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=814.31x+20.755（R2=0.9974），富馬酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=100.31x+37.83（R2=0.9993）。由標(biāo)準(zhǔn)曲線分析可得，雖然富馬酸峰面積最大，但相應(yīng)的濃度很低。此標(biāo)準(zhǔn)曲線用于本研究中L-蘋果酸、琥珀酸和富馬酸的定量分析。

圖1 菌株的平板篩選及產(chǎn)酸透明圈HPLC 分析Fig.1 Plate screening and HPLC analysis of acid transparent ring of the strain

2.2 種子培養(yǎng)基成分優(yōu)化

2.2.1 種子培養(yǎng)基pH 條件優(yōu)化 種子培養(yǎng)基的不同pH 對(duì)黑曲霉L-蘋果酸發(fā)酵、菌絲球形態(tài)以及發(fā)酵殘?zhí)橇烤哂酗@著的影響，結(jié)果如圖2 所示。在pH為5.0、6.0 時(shí)發(fā)酵24 h，種子培養(yǎng)基中菌球形態(tài)明顯變大，與之相反，在pH 為3.0、3.7 時(shí)發(fā)酵24 h 發(fā)現(xiàn)，菌球體積較小，屬于正常形態(tài)（圖2a）；在種子培養(yǎng)基pH 為3.7 時(shí)發(fā)酵48～96 h 菌球數(shù)最多達(dá)到9.8×104個(gè)/mL，其次是pH3.0 時(shí)菌球數(shù)為9.2×104個(gè)/mL，而pH6.0 時(shí)其菌球數(shù)最少，發(fā)酵96 h，僅有6.8×104個(gè)/mL（圖2b）。種子培養(yǎng)基pH 為3.7 時(shí)，發(fā)酵48、72、96 h 時(shí)L-蘋果酸的產(chǎn)量均為最高，分別為2.52、4.35、5.28 g/L（圖2c），同時(shí)其葡萄糖利用率上升（圖2d），菌株將葡萄糖分解利用發(fā)酵產(chǎn)酸。發(fā)酵48 h 時(shí)pH3.0 與3.7、pH5.0 與6.0，二者之間的產(chǎn)酸水平相當(dāng)，但隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，它們之間的產(chǎn)酸水平形成顯著差異，發(fā)酵96 h 時(shí)pH3.0、pH5.0 和6.0 相應(yīng)的L-蘋果酸的產(chǎn)量依次為4.85、3.23 和3.15 g/L。結(jié)果可知，當(dāng)種子培養(yǎng)基的pH 過(guò)高時(shí)，菌球生長(zhǎng)會(huì)受到很大影響，pH 為6.0 時(shí)，種子培養(yǎng)基中菌絲球大而少，可見(jiàn)過(guò)高的pH 并不利于菌絲球的形成。同時(shí)，過(guò)大的菌絲球會(huì)對(duì)其L-蘋果酸的生產(chǎn)造成不利影響，降低L-蘋果酸的產(chǎn)量。最終確定種子發(fā)酵液初始pH 為3.7。

圖2 初始pH 對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.2 Effects of initial pH on bacterial growth,bacterial volume,L-malic acid production and glucose consumption at different time

2.2.2 種子培養(yǎng)基不同碳源濃度優(yōu)化 搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖3 所示，以葡萄糖為碳源，其濃度為60 g/L時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量最高，濃度為80 g/L 時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量最低，如圖3 所示，當(dāng)種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60 g/L 時(shí)，其L-蘋果酸產(chǎn)量最高為5.01 g/L，依次是糖濃度為80、100、120 g/L 時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量的1.67、1.36、1.07 倍，差異顯著（P<0.05）；其中，菌球數(shù)在葡萄糖濃度為60 g/L 時(shí)最多，達(dá)到9.6×104個(gè)/mL，分別是葡萄糖濃度為80、100、120 g/L 時(shí)菌球數(shù)的1.01、0.97、0.91 倍（圖3），差異顯著（P<0.05）。Hirsch等[23]和Meng 等[24]指出，高濃度的葡萄糖有利于菌絲極化生長(zhǎng)，碳源限制導(dǎo)致真菌提前老化，使得菌絲體生長(zhǎng)速度變快，加速了其老化，致使其生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。故確定種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60 g/L 時(shí)為最佳初始糖濃度。

圖3 初始碳源濃度對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)及生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.3 Effect of initial carbon source concentration on the germination of Aspergillus niger spores and the production of L-malic acid

2.2.3 種子培養(yǎng)基氮源種類優(yōu)化 種子培養(yǎng)基氮源種類優(yōu)化結(jié)果如圖4 所示，它們的菌球數(shù)在9.1×104～9.3×104個(gè)/mL 范圍內(nèi)，無(wú)顯著差異性（P>0.05）。以硫酸銨和酵母粉為氮源時(shí)，L-蘋果酸產(chǎn)量均高于其它氮源。5 種氮源對(duì)于L-蘋果酸產(chǎn)量的影響先后順序?yàn)榱蛩徜@>酵母粉>氯化銨>蛋白胨>黃豆餅粉，酵母粉次之，其菌體量較高，但其產(chǎn)酸水平差，L-蘋果酸產(chǎn)量為5.22 g/L，推測(cè)酵母粉更有利于菌體生長(zhǎng)，但不利于其次級(jí)代謝；當(dāng)利用黃豆餅粉作為氮源時(shí)，菌體量最低，L-蘋果酸產(chǎn)量最低，為3.01 g/L，推測(cè)黃豆餅粉不利于菌體生長(zhǎng)與L-蘋果酸生產(chǎn)，這可能與其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、被利用速度緩慢有關(guān)。添加硫酸銨時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量最高可達(dá)9.14 g/L，且殘?zhí)橇肯鄬?duì)較少。Ni 等[25]和Xu 等[26]認(rèn)為，硫酸銨作為無(wú)機(jī)氮源，可直接被分解利用，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，且考慮到無(wú)機(jī)氮源成分簡(jiǎn)單、利用率高等優(yōu)點(diǎn)，故確定種子培養(yǎng)基中氮源為硫酸銨時(shí)為最適氮源。

圖4 初始氮源種類對(duì)黑曲霉孢子萌發(fā)及生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.4 Effect of initial nitrogen source concentration on the germination of Aspergillus niger spores and the production of L-malic acid

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.3.1 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉菌球形態(tài)的影響 黑曲霉是否能形成正常菌球直接關(guān)系其發(fā)酵產(chǎn)酸的能力，因此本研究探索了不同搖床轉(zhuǎn)速對(duì)黑曲霉菌球形成的影響。分別在不同發(fā)酵階段取樣在40 倍顯微鏡下進(jìn)行鏡檢觀察，結(jié)果如圖1d 所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速高于250 r/min 時(shí)，無(wú)法形成規(guī)則的菌球，且菌絲較長(zhǎng)易發(fā)生斷裂。轉(zhuǎn)速在180～220 r/min 時(shí)，能形成正常的菌球，且轉(zhuǎn)速在220 r/min 時(shí)，則能形成實(shí)心菌球，菌球形態(tài)均勻、大小達(dá)到最佳狀態(tài)（圖5）。

圖5 不同發(fā)酵轉(zhuǎn)速對(duì)菌球的影響Fig.5 Effects of different fermentation speeds on bacterial balls

2.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基碳源濃度優(yōu)化 搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖6 所示，發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖濃度為140、160 和180 g/L 時(shí)，菌球數(shù)在9.85×104～10.1×104個(gè)/mL 范圍內(nèi)，無(wú)顯著差異性（P>0.05）。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為180 g/L 時(shí)，其L-蘋果酸產(chǎn)量最高，為12.35 g/L，分別是糖濃度為140、160 g/L 時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量的1.17、1.04 倍，差異顯著（P<0.05）；當(dāng)葡萄糖濃度為180 g/L 時(shí)殘?zhí)橇糠謩e是葡萄糖濃度為140、160 g/L 時(shí)L-蘋果酸產(chǎn)量的1.25、1.17 倍，差異顯著（P<0.05）。考慮到較高的殘?zhí)橇坑欣谘娱L(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間后菌體產(chǎn)酸利用，故確定發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為180 g/L 時(shí)為最佳糖濃度。在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵培養(yǎng)基中糖濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)并沒(méi)有較大的影響，提高糖濃度后菌體量并未大幅度改變，由此推測(cè)菌體主要在種子培養(yǎng)基中萌發(fā)和生長(zhǎng)代謝，補(bǔ)加發(fā)酵培養(yǎng)基后主要進(jìn)行產(chǎn)酸代謝。

圖6 發(fā)酵培養(yǎng)基糖濃度對(duì)黑曲霉生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.6 Effect of fermentation medium sugar concentration on the production of L-malic acid by Aspergillus niger

2.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)添加不同金屬離子種類優(yōu)化 發(fā)酵結(jié)果由圖7 所示，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+6 種金屬離子，對(duì)其L-蘋果酸產(chǎn)量與菌球數(shù)均有較大影響。比較HPLC 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，L-蘋果酸的產(chǎn)量差異較大（圖7a），添加Cu2+離子后，L-蘋果酸的產(chǎn)量提高到了13.42g/L，遠(yuǎn)高于Zn2+、Mn2+離子，分別提高了6.4、2.87 倍，差異顯著（P<0.05）；添加Mg2+、Fe2+、Fe3+離子后L-蘋果酸的產(chǎn)量略有降低，分別為10.02、9.51、8.38 g/L，差異顯著（P<0.05）。再對(duì)比其菌體量變化發(fā)現(xiàn)，添加Zn2+、Mn2+后菌體量變低，添加Cu2+離子后菌球數(shù)與L-蘋果酸產(chǎn)量均有提高（圖7b），推測(cè)適量Cu2+離子在該黑曲霉萌發(fā)與發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的代謝途徑中起到了激活某種酶的作用，加速了葡萄糖向L-蘋果酸的代謝，故而隨著其濃度的升高，L-蘋果酸產(chǎn)量升高、殘?zhí)橇肯陆怠?/p>

圖7 發(fā)酵培養(yǎng)基中金屬離子種類對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.7 Effect of metal ion types in fermentation medium on the production of L-malic acid by Aspergillus niger fermentation

2.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基添加金屬離子濃度的優(yōu)化試驗(yàn)搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖8 所示，數(shù)據(jù)表明，菌球數(shù)基本無(wú)差異，推測(cè)Cu2+離子濃度在0.004～0.012 g/L 范圍內(nèi)對(duì)菌球的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響；Cu2+離子濃度為0.012 g/L時(shí)L-蘋果酸的產(chǎn)酸量最高，為14.32 g/L，較濃度為0.004、0.006、0.010 g/L 時(shí)提高了1.55、1.47、1.2 倍，差異顯著（P<0.05）。同時(shí)葡萄糖被分解利用，隨著離子濃度升高，其殘?zhí)橇砍氏陆第厔?shì)。

圖8 發(fā)酵培養(yǎng)基中Cu2+離子濃度對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的影響Fig.8 Effect of Cu2+ ion concentration in fermentation medium on the production of L-malic acid by Aspergillus niger fermentation

2.4 優(yōu)化前后發(fā)酵條件和效果比較

對(duì)比未優(yōu)化時(shí)的發(fā)酵情況（表1），對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化后的菌株產(chǎn)酸水平大大提高，發(fā)酵72 h 后L-蘋果酸的產(chǎn)量較優(yōu)化前L-蘋果酸的產(chǎn)量提高了3.04倍，發(fā)酵96 h 后L-蘋果酸的產(chǎn)量較優(yōu)化前L-蘋果酸的產(chǎn)量提高了3.44 倍，差異極顯著（P<0.01）。在初步優(yōu)化種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基后，菌球?qū)ζ咸烟堑睦寐矢撸_(dá)到了13%，較優(yōu)化前提高了4.3 倍，同時(shí)其發(fā)酵強(qiáng)度也大大提高，較優(yōu)化前提高了3 倍左右，可見(jiàn)初步優(yōu)化培養(yǎng)基對(duì)該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸起到了很好的作用。

表1 培養(yǎng)基優(yōu)化前后發(fā)酵產(chǎn)酸及其參數(shù)分析Table 1 Acid production and parameter analysis of fermentation medium optimized and non-optimized

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，微生物發(fā)酵產(chǎn)生代謝物的研究越來(lái)越多，由于培養(yǎng)基的條件會(huì)影響微生物的生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物的積累，因此對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化成為了研究的熱點(diǎn)。在微生物的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，單因素實(shí)驗(yàn)可以最直接、有效地反應(yīng)各個(gè)因素對(duì)于菌株影響，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵條件的優(yōu)化和菌株的特性考察[27-28]。

黑曲霉種子培養(yǎng)基碳源濃度優(yōu)化時(shí)，隨著葡萄糖濃度的升高，其L-蘋果酸的產(chǎn)量反而下降。說(shuō)明在高濃度初糖條件下，種子培養(yǎng)會(huì)發(fā)生“葡萄糖效應(yīng)”[29]，可能產(chǎn)生大量乙酸，從而抑制菌體生長(zhǎng)，導(dǎo)致L-蘋果酸產(chǎn)量水平降低，故而在進(jìn)行種子培養(yǎng)時(shí)，不宜加入過(guò)高的葡萄糖，濃度為60 g/L 時(shí)較為適宜；該過(guò)程中，硫酸銨為無(wú)機(jī)氮源，菌體可直接將其分解為氨，更容易被利用，使其快速生長(zhǎng)，促使菌體提前進(jìn)入次級(jí)代謝，使L-蘋果酸產(chǎn)量達(dá)到更高水平。

在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，菌體進(jìn)入次級(jí)代謝，開始大量分解并利用葡萄糖，故而葡萄糖的添加量需要較高水平；同時(shí)金屬離子添加必不可少，分析得出，不同金屬離子對(duì)菌體的生長(zhǎng)萌發(fā)和發(fā)酵生產(chǎn)有不同的作用[30]，例如在發(fā)酵培養(yǎng)基中通過(guò)添加還原性的金屬如亞鐵離子可以提高產(chǎn)量，可能與其降低了氧化脅迫效應(yīng)相關(guān)；錳的含量對(duì)生物的種群數(shù)量以及產(chǎn)物的產(chǎn)量均有較大影響，主要是通過(guò)提高丙酮酸羧化酶、丙酮酸激酶、糖代謝過(guò)程中部分關(guān)鍵調(diào)控中的酶活性以及一些作用于核苷酸的酶的活性[31]；鎂離子的添加能夠激活、提高許多重要酶，如己糖磷酸化酶、檸檬酸脫氫酶、羧化酶的活性，從而影響基質(zhì)的氧化過(guò)程，還可以提高一些菌種對(duì)自身所產(chǎn)抗生素的耐受能力[32]。但由于Cu2+離子為重金屬離子，Schmitt 等[33]指出Cu2+過(guò)量添加處理會(huì)抑制黑曲霉的生長(zhǎng)和呼吸速率，但Cu2+過(guò)量添加處理會(huì)抑制黑曲霉的生長(zhǎng)和呼吸速率，其超過(guò)特定的閾值濃度可直接或間接地影響微生物的生長(zhǎng)、代謝和群落組成，故而目前尚未有研究指出其最適添加量。

通過(guò)分析總體產(chǎn)酸情況發(fā)現(xiàn)，主要副產(chǎn)物為富馬酸、琥珀酸，推測(cè)該菌株在該發(fā)酵條件下主要通過(guò)乙醛酸循環(huán)途徑進(jìn)行產(chǎn)酸，可通過(guò)在乙醛酸循環(huán)上對(duì)菌株進(jìn)行改造，加速代謝流向[34]，以達(dá)到更高的產(chǎn)酸水平。同時(shí)，后續(xù)可嘗試摸索最為合適的Cu2+的最適添加量。已報(bào)道的研究中，周潔等[10]利用米曲霉在30 L 發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸時(shí)，其96 h 的產(chǎn)酸量為65 g/L，將發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至132 h，產(chǎn)酸量可達(dá)到105 g/L；吳悅等[35]利用寄生曲霉進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)L-蘋果酸的時(shí)間延長(zhǎng)至192 h，其產(chǎn)量由23 g/L提高至55 g/L，因此可嘗試在后期補(bǔ)料并發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)至144～216 h，以提高L-蘋果酸的產(chǎn)量。

本研究對(duì)黑曲霉野生型菌株進(jìn)行紫外誘變和高濃度放線菌酮迭代篩選，得到菌株CGMCC NO.40550。確定種子培養(yǎng)基中最適葡萄糖濃度為60 g/L、最適氮源為（NH4）2SO44.95 g/L；發(fā)酵培養(yǎng)基成分最適葡萄糖和（NH4）2SO4濃度分別為180 和4.95 g/L，CuSO4·5H2O 為其生產(chǎn)L-蘋果酸最佳微量元素。總之，經(jīng)過(guò)多次單因素實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，顯著提高了目標(biāo)菌株的L-蘋果酸產(chǎn)量。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).