五指毛桃水提液制備泡騰片工藝優(yōu)化

楊 琳，江蓉倩，張杭穎，李樹玉，武馬璐，張君誠

（三明學院資源與化工學院，藥用植物開發(fā)利用福建省高校工程研究中心，福建三明 365000）

五指毛桃（FicushirtaVahl）為桑科（Moraceae）榕屬（Ficus）的粗葉榕，別名五指牛奶、土黃芪等，廣泛分布于廣西、廣東、福建等地[1]。五指毛桃的主要活性成分包括糖類、苯丙素類、酚類、香豆素類及黃酮類等，在治療支氣管炎、癌癥、脾虛浮腫、慢性胃炎等方面療效顯著[2-6]。2016 年，五指毛桃進入國家衛(wèi)健委公布的新食品原料、普通食品名單匯總，作為普通食品管理，成為藥食同源植物[7]。目前關于五指毛桃的加工品主要有復方五指毛桃顆粒等[8-9]，但普通片劑不便于老年人或吞咽功能低的患者使用。

泡騰片是一種遇水發(fā)生崩解，崩解劑反應釋放二氧化碳促使有效成分快速溶出[10-11]，且具有服用和攜帶方便、生物利用率高、口感好等特點的片劑，特別適用于兒童、老人以及吞咽固體制劑困難的患者[12]。近年來，研究者關注泡騰片的營養(yǎng)與保健功能，優(yōu)化制備了枸杞葉、牡丹花蕊、沙棘等藥食同源植物添加泡騰片[12-14]。目前尚無五指毛桃泡騰片制備相關的文獻報道。

本實驗采用水提取的方法，提取藥食兼用植物五指毛桃的活性成分，并鑒定物質的種類和主要活性成分的含量，并通過正交實驗優(yōu)化五指毛桃泡騰片配方，檢測其體外活性，為五指毛桃的功能性開發(fā)和利用提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五指毛桃 福建三明市莘口鎮(zhèn)高山村；檸檬酸、碳酸氫鈉、PEG-6000、甘露醇、聚乙烯吡咯烷酮 均為食品級，天津渤化永利化工股份有限公司；維生素C 福景天津化學試劑有限公司；葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚 均為分析純，西隴科學股份有限公司；DPPH 試劑 分析純，上海麥克林生化科技股份有限公司。

JA1203N 電子天平 上海精密科學儀器有限公司；Vanquish 液相色譜儀、Orbitrap Exploris 120 質譜儀 賽默飛（Thermo）世爾科技公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風干燥箱 上海申賢恒溫設備廠；GZKJ-10 真空冷凍干燥機 上海罐才機械科技有限公司；200T 高速多功能粉碎機 永康市鉑歐五金制品有限公司；Allegra 64R 高速冷凍臺式離心機 美國貝克曼庫爾特股份有限公司；SDP-O 小型手動壓片機 泰州惠民模具藥機有限公司；UV mini-1280 紫外分光光度計 島津儀器有限公司；KQ2200 DB 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PSH-pH 計 武漢中測宏圖測量儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五指毛桃材料預處理 取長勢一致的五指毛桃根洗凈，切成大小均勻的根段，放入電熱恒溫鼓風干燥箱80 ℃干燥至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg 為止，即為干燥結束。干燥后的五指毛桃用高速萬能粉碎機粉碎，過60 目篩獲得干粉備用。

1.2.2 五指毛桃水提液制備及檢測

1.2.2.1 五指毛桃水提液制備 利用超聲波輔助提取，用電子天平精確稱取預處理后的五指毛桃根粉末樣品1 g，按料液比1:30（g/mL）加入去離子水混合，用數(shù)控超聲波清洗器在80 ℃，320 W 的超聲功率下提取50 min，提取后冷卻至室溫，獲得五指毛桃水提液。

1.2.2.2 五指毛桃水提液干燥 將五指毛桃水提液用高速冷凍臺式離心機離心10 min（4000 r/min），取清液，并1:1 加入無水乙醇，-4 ℃冷藏24 h，重復離心10 min（4000 r/min），取沉淀物，于烘干箱中80 ℃烘干至恒重，得水提液干燥粉末[15]。

1.2.2.3 五指毛桃水提液物質種類測定 稱量0.1 g五指毛桃水提液干燥粉，加入-20 ℃預冷的含2-氯-L-苯丙氨酸（4 ppm）的甲醇600 μL，渦旋振蕩30 s，室溫超聲15 min，離心10 min 后，取上清液濾膜過濾，用于HPLC-MS/MS 檢測物質種類[16]。測定使用C18（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）色譜柱，流動相A 為0.1%甲酸溶液，流動相B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液，柱溫40 ℃，流速0.40 mL/min，進樣量2 μL。質譜條件中，離子化電壓在5500～-4500 V 之間，溫度在550～450 ℃之間。

1.2.2.4 五指毛桃活性成分含量測定 分別以葡萄糖、蘆丁、沒食子酸、補骨脂素為標準品，采用硫酸-苯酚法、亞硝酸鈉-硝酸鋁法、Folin-ciocalteu 法、高效液相色譜，測定五指毛桃水提液中活性成分多糖、黃酮、多酚和補骨脂素的含量[17-20]。

1.2.3 五指毛桃泡騰片制備工藝 采用酸堿分開濕法制粒法，將五指毛桃水提液干燥粉末平均分成兩等份，一份加入檸檬酸，噴灑9.5% PVP-乙醇溶液，制得酸粒；一份加入碳酸氫鈉，噴灑9.5% PVP-乙醇溶液，制得堿粒。將酸粒和堿粒分別置于干燥箱中50 ℃干燥60 min，加入填充劑，用研砵研磨成超微細粉，加入潤滑劑PEG-6000 后混合5 min，用小型手動壓片機壓片，50 ℃下干燥60 min，-4 ℃冰箱冷卻后密封[21-22]，其流程如圖1 所示。

圖1 五指毛桃泡騰片制備工藝流程圖Fig.1 Flow chart of the preparation process of Ficus hirta Vahl effervescent tablet

1.2.4 泡騰片制備的單因素實驗

1.2.4.1 五指毛桃水提液干燥粉末添加量的確定選取五指毛桃水提液干燥粉末添加量為0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 g，即水提液干燥粉末加入量占五指毛桃泡騰片總質量的10%、15%、20%、25%、30%。固定崩解劑添加量為40%，酸堿比例為1.5:1，其余為甘露醇，添加至0.300g。通過測定泡騰片的崩解時間、產(chǎn)氣量以及pH，從而確定泡騰片中水提液干燥粉末的添加量。

1.2.4.2 檸檬酸和碳酸氫鈉崩解劑添加量的確定崩解劑的質量一般為泡騰片總質量的40%～50%，在酸堿比例確定的基礎上，選擇崩解劑添加量為30%～50%考察最優(yōu)處理條件[23]。選取崩解劑添加量為0.150、0.175、0.200、0.225、0.250 g，即崩解劑加入量占五指毛桃泡騰片總質量的30%、35%、40%、45%、50%。固定五指毛桃添加量為0.100 g，酸堿比例為1.5:1，其余為甘露醇。通過測定泡騰片的崩解時間、產(chǎn)氣量以及pH，從而確定泡騰片中崩解劑的添加量。

1.2.4.3 崩解劑比例的確定 選取崩解劑檸檬酸和碳酸氫鈉比例為2.5:1、2:1、1.5:1、1:1.5、1:2。固定五指毛桃水提液干燥粉末添加量為0.100 g，崩解劑添加量為40%，其余為甘露醇。通過測定泡騰片的崩解時間、產(chǎn)氣量以及pH，從而確定泡騰片中崩解劑的比例。

1.2.4.4 潤滑劑、填充劑和黏合劑的選擇及添加量確定 有研究表明，當PEG-6000 含量為5%時，發(fā)泡效果最好，故本試驗選擇PEG-6000 的添加量為5%[24]。甘露醇能溶于水，是優(yōu)良的填充劑，可以使泡騰片外觀光潔，有清涼感味道，本試驗選擇甘露醇較為合適。PVP 聚乙烯吡咯烷酮化學特性表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，具有良好的溶解能力，本試驗選擇聚乙烯吡咯烷酮較為合適。

1.2.5 泡騰片制備的正交試驗 在單因素實驗的基礎上，進行L9（34）正交試驗設計，選擇五指毛桃水提液干燥粉末添加量、崩解劑添加量、酸堿比例為主要因素（表1），感官評價為評價指標，確定泡騰片最佳配方。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 泡騰片質量評價

1.2.6.1 產(chǎn)氣量測定 采用質量損失法[25]，將泡騰片溶解于裝有20 ℃的50 mL 去離子水的試管中，待溶液中無氣泡產(chǎn)生即為崩解完畢，稱量溶解前后試管以及泡騰片的質量，減少量即為產(chǎn)氣量，平行測定3 次以上，取平均值。

1.2.6.2 pH 測定 取一片泡騰片，放入50 mL 燒杯，待崩解完全，氣泡不再冒出后，用pH 計測定其pH，平行測定3 次以上，取平均值。

1.2.6.3 崩解時限檢查 參考2020 版《中國藥典》[26]中崩解時限檢查法（通則0921）檢查：拿一片泡騰片，放入50 mL 燒杯中，立刻有大量氣泡冒出，片劑周圍的氣體停止逸出時，片劑應充分溶解在水中，沒有任何聚集的顆粒殘留，除另有規(guī)定外，同時對6 片泡騰片進行檢驗，每片都應該在3 min 之內(nèi)進行崩解，如有1 片沒有徹底崩解，應該再取6 片再進行一次檢驗，所有檢驗都要達到標準，結果取平均值。

1.2.6.4 感官評價 隨機選取50 名志愿者組成感官評價小組，參照感官評價指標[27]，對五指毛桃泡騰片進行感官評價，100 分為滿分，評分結果為平均值。

1.2.6.5 抗氧化活性測定 配制濃度為10.0 mg/mL的VC儲備液，濃度為10.0 mg/mL 的泡騰片待測液，和濃度為0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液。以VC作陽性對照，移取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 泡騰片待測液于試管中，用去離子水稀釋到2.0 mL，加入等體積DPPH 乙醇溶液，輕微搖勻，室溫黑暗下保持30 min，用紫外-分光光度計在517 nm 處波長下測定吸光值Ai；無水乙醇代替DPPH 溶液，測定吸光值Aj；無水乙醇代替待測液，測定其吸光值A0。自由基的清除率CLS 如下公式計算，計算自由基清除率和IC50[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗都進行至少3 次生物學重復和3 次技術重復，采用Excel 和Origin 8.0 軟件作圖，采用SPSS軟件進行正交試驗方差分析，P<0.05 表示具有顯著性差異。實驗結果為平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 五指毛桃水提液物質種類及含量

2.1.1 五指毛桃水提液物質種類分布 采用HPLCMS/MS 方法，共檢測到物質433 種，其中檢測到的羧酸及其衍生物種類最多，有103 種（占檢測到物質種類的23.79%），脂肪酰基和苯及其取代衍生物分居二、三位，分別有45（占檢測到物質種類的10.39%）和36 種（占檢測到物質種類的8.31%）。檢測到五指毛桃活性成分糖類及其衍生物共23 種（8 種糖和15 種糖類衍生物），黃酮9 種（5 種黃酮類和4 種異黃酮），酚類16 種（3 種酚醚類和13 種酚類），香豆素5 種，苯丙酸9 種（圖2，表2）。其他物質中包括肉桂酸及其衍生物、生物堿、脂質和類脂分子、有機氮化合物等。在對4 個產(chǎn)地的五指毛桃指紋圖譜檢測中，得到16 個“共有峰”，鑒定除包括酸、醚、酯、香豆素、黃酮、甾醇等10 種物質[28]。對五指毛桃根和果實提取液檢測也得到434 種代謝物，但物質種類存在差異，主要包括127 種黃酮、59 種酚酸類、34 種氨基酸及其衍生物等，這可能與提取五指毛桃使用的溶劑（本實驗使用水，參考文獻使用甲醇）不同有關[29]。

表2 五指毛桃部分活性成分組分分析Table 2 Analysis of partial active ingredient components of Ficus hirta Vahl

圖2 五指毛桃水提液物質種類分布圖Fig.2 Types of substances in the water extract of Ficus hirta Vahl

2.1.2 五指毛桃水提物中活性物質含量 葡萄糖、蘆丁、沒食子酸和補骨脂素標準曲線回歸方程分別為：y=12.287x+0.0454（R2=0.9986）、y=7.748x-0.006（R2=0.9995）、y=86.628x+0.439（R2=0.9986）和y=41.877x+0.545（R2=0.9999），都呈現(xiàn)良好的線性關系。通過硫酸-苯酚法測得五指毛桃水提液中多糖含量為6.71%±0.63%。亞硝酸鈉-硝酸鋁法測得五指毛桃水提液中黃酮含量為0.22%±0.03%；Folinciocalteu 法測得五指毛桃待測液中多酚含量為1.65%±0.02%。高效液相色譜法檢測五指毛桃水提液中補骨脂素含量為0.51‰±0.063‰。其中，多糖和多酚的含量高于其他研究結果1.30%和1.50%左右，說明水為溶質適合五指毛桃多糖和多酚的提取，能有效提高提取的得率[15,30]。而五指毛桃黃酮和補骨脂素的含量低于乙醇或甲醇提取結果，說明黃酮和補骨脂素適合用有機溶劑提取[1,30]。另外，五指毛桃的來源的差異也是五指毛桃多糖含量不同的重要原因，Zhang 等[31]的研究表明，品種的差異性，即使是同一物種，也會因為遺傳因素，地理環(huán)境的不同在營養(yǎng)成分上存在較大差異。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 五指毛桃水提液干粉添加量對泡騰片品質的影響 五指毛桃添加量對泡騰片崩解時間、產(chǎn)氣量、pH 具有影響，隨著五指毛桃水提液干粉的增加，崩解時間逐漸延長，產(chǎn)氣量平穩(wěn)，水提液干粉添加量為10%和25%時，其pH 在3.5～4.5 之間，能適應人們的口味需求[32]。由于五指毛桃水提液干粉具有粘性，隨著水提液干粉添加量的增加，不溶性固體顆粒也會變多。綜上所述，添加量選取15%、20%、25%三個水平進行正交試驗設計（圖3）。

圖3 五指毛桃添加量對泡騰片品質的影響Fig.3 Effects of the amount of Ficus hirta Vahl added on the quality of effervescent tablets

2.2.2 崩解劑添加量對泡騰片品質的影響 隨著崩解劑的增加，產(chǎn)氣量不斷上升，pH 不斷下降，其崩解時間呈先下降后上升的趨勢，添加量為40%，崩解時間最短。增加崩解劑的添加量可以增加產(chǎn)氣量和崩解速率，減少崩解時間，但是在崩解劑量為40%以后，其崩解時間又開始增加，王文寶等[24]在研究猴頭菇泡騰片時也有出現(xiàn)這種情況。所以綜上所述，崩解劑的添加量選取40%、45%、50%三個水平進行正交試驗設計（圖4）。

圖4 崩解劑添加量對泡騰片品質的影響Fig.4 Effects of disintegration addition amount on the quality of effervescent tablets

2.2.3 崩解劑酸堿比例對泡騰片品質的影響 崩解劑的酸堿比例對五指毛桃泡騰片品質影響極顯著（P<0.01）。隨著檸檬酸比例的減少，崩解時間呈現(xiàn)先降后升變化趨勢，產(chǎn)氣量呈先升后降變化趨勢，其pH 不斷地上升，在酸堿比為1:1.5 時快接近中性。綜上所述，崩解劑酸堿比例選2:1、1.5:1、1:1.5 三個水平進行正交試驗設計（圖5）。

圖5 崩解劑酸堿比例對泡騰片品質的影響Fig.5 Effects of the acid-base ratio of the disintegrant on the quality of effervescent tablets

2.3 五指毛桃泡騰片正交試驗結果分析

根據(jù)單因素實驗結果，選取五指毛桃水提液干粉添加量、崩解劑添加量、甜味劑添加量進行正交試驗，根據(jù)正交試驗結果（表3），方差分析結果（表4）確定五指毛桃泡騰片的最佳工藝配比。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal experiment L9 (34)

表4 正交試驗方差分析Table 4 Analysis of variance by orthogonal test

由極差分析結果可知，影響泡騰片品質最優(yōu)因素是五指毛桃水提液干粉添加量，其次是崩解劑添加量，最后是酸堿比；結合表3 的方差分析結果可以看出，三個因素當中，五指毛桃水提液干粉的添加量對泡騰片的品質影響極顯著（P<0.01），崩解劑添加量和酸堿比例對于泡騰片的品質影響顯著（P<0.05）。五指毛桃泡騰片的最優(yōu)配方組合為A3B3C3，即五指毛桃水提液干粉添加量為25%、崩解劑添加量為50%、酸堿比為1:1.5。經(jīng)驗證五指毛桃添加量為25%、崩解劑添加量為50%、酸堿比例為1:1.5、甘露醇添加量為20%、PEG-6000 添加量為5%。由此制得泡騰片外形呈棕黃色、酸甜可口、光滑完整、放入水中，瞬間崩解產(chǎn)生大量氣泡，且溶液無明顯雜質和沉淀物，具有良好的生產(chǎn)可行性。崩解劑添加量為50%，泡騰片的崩解效果最好，發(fā)泡量最多，這一結果與蟲蛹、藍莓等泡騰片崩解劑添加量的結果相一致，但是崩解劑中酸堿比例有所差異[33-34]。有研究表明，酸堿比例稍大于酸比例時，崩解效果最好[12]。

2.4 五指毛桃泡騰片的質量評價

按照2020 年《中國藥典》的要求評定泡騰片的質量，此實驗制得的泡騰片呈棕黃色，且外觀光滑，片面可有散在的著色小點（圖6）。平均片重為0.500±0.006 g，取6 片泡騰片分別加入20 ℃的水50 mL，均能在5 min 內(nèi)崩解，產(chǎn)氣量為0.080±0.040 g，用pH 計測定其pH 為4.190±0.380，符合人們的口味需求。

圖6 五指毛桃泡騰片的外觀及崩解圖Fig.6 Appearance and disintegration of the Ficus hirta Vahl effervescent tablet

2.5 五指毛桃泡騰片的抗氧化活性分析

VC的DPPH 自由基清除率均保持在92%以上，且隨著VC濃度從0.5 mg/mL 增加到3 mg/mL，清除率逐漸接近100%。五指毛桃泡騰片對DPPH自由基有清除作用，且隨著濃度的增加，對DPPH 自由基的清除率呈上升的趨勢，說明其抗氧化能力逐漸加強，但相比于同濃度的VC，其清除率較低。五指毛桃水提液干粉濃度在2.5 mg/mL 時，DPPH 自由基清除率達到66.77%。五指毛桃多糖對DPPH 自由基清除活性的IC50為1.65 mg/mL（圖7）。在枸杞葉黃酮泡騰片抗氧化活性研究結果顯示，枸杞葉黃酮泡騰片IC50為0.77 mg/mL。DPPH 自由基的清除作用隨著枸杞葉黃酮泡騰片質量濃度增加而逐漸增強[13]。羅布麻總黃酮泡騰片DPPH 自由基清除率隨樣品質量濃度的加大而加大，IC50為0.0107 mg/mL[22]。以上研究結果與本實驗研究結果對比發(fā)現(xiàn)趨勢相近。

圖7 五指毛桃泡騰片和VC 對DPPH 自由基的清除能力的影響Fig.7 Effects of Ficus hirta Vahl effervescent tablets and VC on DPPH free radical scavenging ability

3 結論

五指毛桃水提液共檢測到433 種物質，包括羧酸及其衍生物（103 種）、脂肪酰基（45 種）、苯及其取代衍生物（36 種），檢測到活性成分多糖、黃酮、多酚和補骨脂素的含量分別為6.71%、0.22%、1.65%和0.51‰。五指毛桃泡騰片最佳制備工藝條件為五指毛桃用量25%、崩解劑添加量為50%，酸堿配比為1:1.5，甘露醇添加量為20%，PEG-6000 添加量為5%。在此工藝條件下制得五指毛桃泡騰片具有良好的抗氧化活性。

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