貴州苗族、水族紅酸湯滋味與香氣差異分析

平洪睿，王亞萍，陳佳妮，王金華

（貴陽學院食品科學與工程學院，貴州貴陽 550005）

貴州人民飲食嗜酸，其中以黔東南地區的苗族紅酸湯和黔南地區的水族紅酸湯深受各地人民青睞。貴州酸食歷史悠久，一方面是因為“地勢低洼，水土濕弱，霧露聚集甚多”的地理環境形成的飲食習慣，另一方面是歷史上貴州長期鹽運困難，勞動人民嚴重缺鹽，形成了“以酸代鹽”的飲食文化[1]。苗族紅酸湯是以新鮮紅辣椒和西紅柿為主要原料，經搗碎后放入發酵壇中，加入白酒、米糟、食鹽、蔥蒜等裝壇發酵而成[2]。水族紅酸湯是以新鮮紅辣椒為原料，去蒂后加入適量的姜、蒜共同粉碎，再加以一定量的白酒、食鹽、米糟混勻，裝壇發酵而成。發酵后的紅酸湯成品色澤鮮紅、鮮香酸爽、酸辣醇厚、回味酸甜，含有有機酸、番茄紅素、辣椒堿等多種功能性物質，具有抗氧化、防癌、增強免疫力等功效[3-4]。

目前，由于苗族紅酸湯的成功商業化，引發廣大學者的興趣，針對苗族紅酸湯開展了深入的研究，研究內容集中在菌群鑒定[5]、工藝優化[6]、營養成分[7]以及揮發性風味物質分析[8]等方面。宮路路等[9]通過高通量測序發現，苗族紅酸湯的主優勢菌為乳桿菌和芽孢桿菌等；張東亞[6]對紅酸湯的發酵工藝進行優化，確定了紅酸湯的最佳發酵配方；潘季紅等[10]的研究顯示，有機酸、氨基酸等物質對苗族紅酸湯呈特征風味具有重要影響作用。LIU 等[11]分析了紅酸湯的揮發性香氣物質，共鑒定出42 種揮發性香氣物質。LI 等[12]發現苗族紅酸湯中含有7 種有機酸、76 種揮發性物質和15 種氨基酸等風味物質。WANG等[13]研究發現不同發酵工藝，紅酸湯的風味不同。水族紅酸湯是貴州三都縣的民族傳統食品，以辣椒為主要原料，具有營養豐富、鮮酸純正、口味地道、微辣不燥、開胃消食、南北皆宜的特點，是貴州獨特的酸食文化組成之一，具有極大的商業開發價值。但目前關于水族紅酸湯研究較少，因此，本文選用具有典型苗族酸湯特征的凱里縣釀三月食品有限公司生產的紅酸湯和具有典型水族酸湯特征的三都縣紅酸湯作為研究對象，采用國標法、氨基酸分析儀、HSSPME-GC-MS 技術等對樣品的理化指標、游離氨基酸和揮發性物質進行測定，結合最小偏二乘法和相關性分析建立紅酸湯的風味差異和各參數間聯系，為貴州不同地域具有代表性的紅酸湯品質評估奠定基礎，為水族酸湯的商業化開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苗族紅酸湯 凱里縣釀三月食品有限公司；水族紅酸湯 三都縣本地農戶傳統發酵，兩種紅酸湯均生產于2021 年7 月，發酵時間均為21 d；鹽酸、硫酸銅、亞甲藍、酒石酸鈉、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、石油醚、硫酸鉀、硫酸、對硝基苯酚、乙酸鈉、乙酸、37 %甲醇、乙酰丙酮、亞鐵氰化鉀、硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等均為分析純，天津市密歐化學試劑有限公司。LE204E/02 型電子天平 精度0.0001 g，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；HN-8 數顯恒溫水浴鍋上海力辰幫儀器科技有限公司；101-2AB 電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀有限公司；PHS-3CpH 計 上海儀電科學儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計 島津企業管理有限公司；TGL-16A 高速冷凍離心機 湖南平凡科技有限公司；ZXY-48 電熱恒溫振蕩器、；L-8900 型氨基酸分析儀常州金壇良友儀器有限公司；HP6890/5975C GC/MS 氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅酸湯理化成分測定 總酸含量的測定參照GB 12456-2021《食品中總酸的測定》；pH 的測定參照GB 5009.237-2016《食品國家安全標準 食品pH值的測定》；水分含量的測定參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》；還原糖含量的測定參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定；脂肪含量的測定參照GB 5009.6-2016《食品中脂肪的測定》；蛋白質含量的測定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》；亞硝酸鹽含量的測定參照國標GB 5009.33-2016《食品中亞硝酸鹽與亞硝酸的測定》。

1.2.2 紅酸湯中氨基酸含量測定 參考潘季紅等[10]的方法，準確稱取1 g 紅酸湯樣品，用50 mL 0.01 mol/L 的鹽酸超聲浸提30 min，搖勻后過濾；準確吸取濾液2 mL，加入2 mL 8%的磺基水楊酸，靜置15 min 后離心15 min（10000 r/min，10 ℃），取上清液過0.45 μm 濾膜后進氨基酸分析儀分析。

1.2.3 味道強度值 采用味道強度值（TAV）對游離氨基酸對整體滋味的貢獻進行評價[14]。計算公式：

式中：C為游離氨基酸的含量（mg/100 g），T為游離氨基酸的的味道閾值（mg/100 g）。

1.2.4 紅酸湯中揮發性成分測定

1.2.4.1 揮發性風味物質萃取 準確稱取紅酸湯樣品2.0 g，置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex 纖維頭的手動進樣器，在70 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min 時間后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口（溫度250 ℃）中，熱解析進樣。

1.2.4.2 色譜條件 色譜柱：HP-5MS（60 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細管柱，初始溫度40 ℃（保留2 min），以3.5 ℃/min 升溫至208 ℃，再以10 ℃/min升溫至308 ℃（保留3 min），運行時間：63 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He（99.999%）；柱前壓15.98 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比5:1，溶劑延遲時間：3 min。

1.2.4.3 質譜條件 離子源為EI 源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓2259 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。

1.2.4.4 定性定量分析 對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist17 和Wiley275標準質譜圖，確定了揮發性化學成分，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數。

1.2.5 相對氣味活度值 采用 ROAV 法[15]，對樣品總體風味貢獻最大的組分 ROAVst=100，其余組分按公式（2）計算：

式中：Ci和 Ti為各揮發物質的相對含量和感覺閾值；Cst和 Tst分別為樣品總體風味貢獻最大組分的相對含量和感覺閾值。0≤ROAV≤100，ROAV值越大表明該組分對樣品總體風味貢獻程度越大；以ROAV≥1 的物質確定為樣品關鍵風味物質。

1.2.6 紅酸湯感官評定 分別從產品的色澤、滋味、香氣、質地等幾個方面對紅酸湯進行感官評定[16]，各項以百分制評分，每項在綜合評分中所占權重分別為：色澤20%，質地20%，滋味30%，香氣30%。感官評價標準見表1。評價人員選擇食品專業的學生，經一周培訓后，篩選10 人組成評價小組（5 男5 女）。評價人員先根據評價標準對酸湯的色澤、質地進行評分，再將酸湯模擬食用情景，以1:15 的質量比進行稀釋，煮沸、冷卻后對其滋味和香氣進行評分。

表1 紅酸湯的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standard of red sour soup

1.3 數據處理

通過Excel 對基本成分和氨基酸數據進行處理，表中均采用均值±標準差表示，從數據庫中找到GC/MS 檢測到的揮發性物質對應中文名稱，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對質量分數。通過利用Origin 2018 軟件繪制熱圖；SPSS 軟件進行數據分析，采用T檢驗進行顯著性分析，P<0.05 表示差異顯著；SIMCA 14.1 軟件用于建立正交偏最小二乘法監督模型（OPLS-DA）。

2 結果與分析

2.1 兩種紅酸湯理化指標分析結果

總酸、pH、還原糖、脂肪、蛋白質等物質會影響紅酸湯的最終呈味[17]。苗族和水族紅酸湯樣品理化指標分析結果見表2。水族紅酸湯中總酸、還原糖、脂肪及蛋白質含量均高于苗族紅酸湯，且差異顯著（P<0.05）。其中總酸是影響紅酸湯酸鮮味的關鍵因素，也是反映紅酸湯品質的重要指標[18]，水族紅酸湯的總酸含量（12.29 g/100 g）較苗族紅酸湯（7.2 g/100 g）高。還原糖、脂肪和蛋白質在發酵中微生物分解成小分子物質，為非揮發性和揮發性風味物質提供前體物質。

2.2 兩種紅酸湯游離氨基酸分析結果

游離氨基酸是評價發酵品滋味特征的重要呈味物質，其主要呈現出甜味、苦味、鮮味等滋味特征，不僅能夠為滋味物質的形成提供物質基礎，還可以與香氣物質相互作用產生獨特的風味特性[19-20]。由表3 可知，從兩種紅酸湯中共檢測出19 種游離氨基酸，其中包含7 種必需氨基酸，所含游離氨基酸可歸為4 類：甜味、苦味、鮮味和無味等[21]。在兩種紅酸湯中甜味氨基酸總量占比最高（占比55%～60%），其次是苦味氨基酸（占比32%～37%），鮮味氨基酸占比最少；表3 中數據顯示，水族紅酸湯中總游離氨基酸含量、必需氨基酸含量、各呈味總氨基酸含量均是苗族紅酸湯的2 倍。在水族紅酸湯中未檢測到β-丙氨酸。

表3 苗族和水族紅酸湯中氨基酸測定結果及TAV 值Table 3 Results of amino acid determination and TAV value in Miao and Shui red sour soup

游離氨基酸對食品滋味的貢獻與氨基酸含量和TAV 值有關，TAV>1，化合物對整體滋味有貢獻，且TAV 值越大，貢獻越大[22]。從表3 可知，兩種紅酸湯中丙氨酸和谷氨酸TAV 值>1，說明這兩種氨基酸是紅酸湯的主要呈味物質，其中苗族紅酸湯中丙氨酸的TAV 值高于水族紅酸湯，但谷氨酸的TAV 值<1，表明苗族紅酸湯在甜味方面較強，而水族紅酸湯在鮮味方面較強。此外當丙氨酸與鳥氨酸、絲氨酸、谷氨酸等氨基酸共存時，食品中的鮮味還會增強[23]。雖然苦味氨基酸在游離氨基酸中種類最多，但其TAV值均<1，因此這也就是紅酸湯中具有強烈的酸鮮感和回甜味，而未感受到苦味的原因。該實驗結果與潘季紅等[10]對貴州紅酸湯中主要呈味氨基酸分析結果一致。

2.3 兩種紅酸湯中揮發性物質的測定結果

兩種紅酸湯樣品揮發性成分的定量和定性分析結果見圖1 和表4。兩種紅酸湯中共檢測出101 種揮發性物質，共有揮發性物質63 種，其中醇類物質12 種、酯類物質29 種、酸類物質3 種、醛酮類物質3 種、烷烴類物質10 種、酚類物質3 種，醇類、酯類和酸類物質在紅酸湯中占比最高。水族紅酸湯主要以酯類、醇類、烷烴類為主，苗族紅酸湯的揮發性物質以酯類、醇類、酸類為主，且苗族紅酸湯中的酸類物質遠高于水族紅酸湯，主要是山梨酸含量差異較大。

圖1 苗族和水族紅酸湯離子流圖和揮發性物質含量柱狀圖Fig.1 Hmong and Shui red sour soup ion current diagram and volatile substance content histogram

表4 苗族和水族紅酸湯中揮發性物質分析結果Table 4 Analysis results of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

醇類物質主要是酵母菌作用產生的代謝物，在發酵初期淀粉糖轉化為醇類物質，為有機酸與酯類物質生成提供前體物質，促進風味的形成[24]。苗族紅酸湯與水族紅酸湯共有醇類物質12 種，占總香氣成分（22%～24%）。其中乙醇的含量最高（18%～21%），其次為1-丙醇、苯乙醇以及芳樟醇，這些物質是紅酸湯在發酵過程中逐漸形成的高級醇，賦予紅酸湯獨特的香味。如乙醇提供紅酸湯酒香和果香味，也能促進其與其他揮發性風味物質溶解，1-丙醇具有水果、新鮮草木的風味[25]，苯乙醇呈類似玫瑰花香和茉莉花香，使紅酸湯的風味更佳柔和、醇香[26]。

酯類物質在發酵中主要通過酸類和醇類物質發生酯化反應生成[27]，是紅酸湯中揮發性風味物質最多的種類，占總香氣成分的27.5%～35%，其多具有果香氣味，高揮發性和低閾值的特點[28]，對紅酸湯整體風味貢獻較大。十六烷酸乙酯、亞油酸乙酯、乙酸乙酯、己酸乙酯等是紅酸湯的主要酯類物質，而水族紅酸湯中酯類物質種類和含量均高于苗族紅酸湯，其中具有獨特的果香味的乙酸乙酯、己酸乙酯[29]等物質含量差異最為顯著。

酸類物質能夠賦予紅酸湯獨特酸鮮味，在發酵中辣椒堿與乳酸菌、醋酸菌發酵等作用下產生的有機酸進行中和，促使發酵后紅酸湯整體風味更佳柔和，提高紅酸湯的感官品質[30]。由表4 和圖1 可知，苗族紅酸湯的酸類物質含量（28.09%）占比遠高于水族紅酸湯（1.92%），主要是苗族紅酸湯中山梨酸含量（23.21%）遠高于水族紅酸湯（0.124%），結合2.1 理化指標分析發現，水族紅酸湯總酸含量高于苗族紅酸湯。通過觀察兩種紅酸湯的配料表發現，苗族紅酸湯中添加有山梨酸鉀，而水族紅酸湯中未添加，這可能是苗族紅酸湯中山梨酸含量高的原因。

含硫化合物、烷烴類物質主要存在水族紅酸湯中，苗族紅酸湯未檢測出含硫化和物。發酵品中含硫化和物主要來源于蛋白質在微生物的作用下降解產生含硫氨基酸（蛋氨酸），含硫氨基酸繼續進行Strecker 降解產生含硫化合物[31]。結合理化指標與游離氨基酸分析，水族紅酸湯中蛋白質與氨基酸含量明顯高于苗族紅酸湯，因此水族紅酸湯中含硫化物可能主要來源于微生物利用蛋氨酸通過Strecker 降解產生以二烯丙基二硫化物、二-2-丙烯基三硫化物為主的含硫化物。苗族紅酸湯中醛酮類物質含量（13.6%）顯著高于水族紅酸湯（1.06%），其主要以5-環己基-2-戊酮含量最高。酚類物質在兩種紅酸湯中含量較少。

2.3.1 兩種紅酸湯揮發性物質的差異性分析 正交偏最小二乘法監督模型（Orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）可進一步對數據進行可視化分析，進一步挖掘數據之間相關性，同時可以量化特征風味物質造成樣品之間差異的程度[32]。如圖2（a）～圖2（b）所示，本次分析中的自變量擬合指數（R2x）為0.846，因變量擬合指數（R2y）為0.931，模型預測指數（Q2）為0.889，說明模型不存在過擬合，模型驗證有效，該結果可用于兩地紅酸湯香氣特征物質的鑒別。利用OPLS-DA 的重要性變量投影（VIP）篩選出關鍵差異物，VIP 值越大，變量的差異越明顯。由圖2（c）所示，共篩選出十六酸丙酯、4-乙基-2 甲氧基苯酚、5-環己基-2 戊酮、山梨酸等32 個VIP 值>1 的關鍵揮發性香氣物質，其中酯類、醇類物質對紅酸湯香味貢獻最大。5-環己基-2-戊酮、山梨酸是苗族紅酸湯的主要呈味揮發性物質。己酸乙酯、乙酸乙酯等是水族紅酸湯的主要呈味揮發性物質，主要呈水果香味，在發酵中主要通過酸類和醇類物質發生酯化反應生成[28]。乙酸乙酯合成還與其前提合成物質乙酸相關[33]。

圖2 苗族、水族紅酸湯揮發性物質差異性分析Fig.2 Difference analysis of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

2.3.2 兩種紅酸湯關鍵揮發性物質ROAV 分析 揮發性物質對紅酸湯風味影響取決于各揮發性物質相對含量及閾值大小。故從紅酸湯中32 個VIP 值>1的關鍵揮發性差異物質結合其呈味閾值，進行ROAV 值計算，確定苗族和水族紅酸湯的特征風味差異。結果如表5 所示，苗族紅酸湯中有乙醇、苯甲醇、水楊酸甲酯、已酸乙酯、丙酸乙酯、丙酸、醋酸等15 種揮發性物質ROAV 值≥1，其中以呈酸味、油脂香、酒香和果香味的丙酸、醋酸、水楊酸甲酯、乙醇和丙酸乙酯的ROAV 值較高；水族紅酸湯中乙醇、香葉醇、己酸乙酯、乙酸乙酯、水楊酸甲酯、4-乙基苯酚等11 種揮發性物質ROAV 值≥1，其中呈果香味己酸乙酯、乙酸乙酯，呈脂香和酒香味水楊酸甲酯、4-乙基苯酚的ROAV 值較高。通過ROAV 值發現苗族紅酸湯中酸味較水族紅酸湯明顯，水族紅酸湯果香味特征較苗族紅酸湯明顯，兩種紅酸湯中脂香均由水楊酸甲酯提供，不同的是兩種紅酸湯主要呈酒香的揮發性物質不同，苗族紅酸湯主要由乙醇提供，而水族紅酸湯主要由4-乙基苯酚提供。

表5 苗族和水族紅酸湯中揮發性物質相對氣味活度值Table 5 Relative odor activity values of volatile substances in Miao and Shui red sour soup

2.3.3 兩種紅酸湯感官評價結果分析 對苗族和水族紅酸湯感官評分結果做雷達圖見圖3。由圖3 可知，水族紅酸湯在色澤、口感、質地、香氣上均高于苗族紅酸湯，并且水族紅酸湯的綜合評分為92.5 分，苗族紅酸湯的綜合評分為88.0 分。結合上文對兩種紅酸湯的理化成分、游離氨基酸和揮發性物質分析，水族紅酸湯中總酸、游離氨基酸和揮發性物質等物質含量較苗族紅酸湯高，因此賦予了水族紅酸湯更好的風味。

圖3 苗族和水族紅酸湯感官評分雷達圖Fig.3 Radar chart of sensory score of Miao and Shui red sour soup

3 結論

苗族和水族紅酸湯的理化成分、游離氨基酸和揮發性物質均存在一定差異，水族紅酸湯中總酸、還原糖、粗脂肪和蛋白質等均高于苗族紅酸湯；兩種紅酸湯中檢測出19 種游離氨基酸，水族紅酸湯的呈酸味、甜味、苦味和總游離氨基酸含量均是苗族紅酸湯的2 倍，其中丙氨酸、谷氨酸的TAV 值>1，是紅酸湯的主要呈味物質；兩種紅酸湯中共篩選出101 種揮發性物質，苗族紅酸湯的揮發性物質以酯類、醇類、酸類為主，水族紅酸湯主要以酯類、醇類、烷烴類為主。利用OPLS-DA 的重要性變量投影（VIP）共篩選出十六酸丙酯、4-乙基-2 甲氧基苯酚、5-環己基-2 戊酮、山梨酸等32 個關鍵差異物。通過ROAV 值發現苗族紅酸湯丙酸、醋酸、水楊酸甲酯、乙醇和丙酸乙酯的ROAV 值較高；水族紅酸湯中已酸乙酯、乙酸乙酯，呈脂香和酒香味水楊酸甲酯、4-乙基苯酚的ROAV 值較高。可見苗族紅酸湯中酸味較水族紅酸湯明顯，水族紅酸湯果香味特征較苗族紅酸湯明顯；感官評價顯示水族紅酸湯的感官評分高于苗族酸湯。綜上所述，水族紅酸湯作為貴州紅酸湯的一種，其品質和風味較優，具有很高的市場開發價值。本研究僅對苗族紅酸湯和水族紅酸湯的基本成分、氨基酸和揮發性風味物質進行了簡要對比，接下來本項目組將從兩種紅酸湯發酵過程中微生物變化對其發酵過程風味的影響以及作用機理展開研究，為貴州紅酸湯市場發展提供新的思路。

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