兩種常用適配體的納米金比色法快速檢測牛奶中黃曲霉毒素M1 的評價研究

蘇 柳，賀偉華,+，張 干，陳愛亮，章鋼剛，賴曉翠，鄧省亮,*

（1.江西省科學院微生物研究所，江西南昌 330096；2.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）是哺乳類動物食入被黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）污染的糧食或飼料后，經體內循環代謝產生的羥基化衍生物，具有強致癌性及強突變性，主要存在于牛奶及乳制品中[1-2]。世界各國均規定了乳制品中AFM1的限量標準，中美兩國均規定乳制品中AFM1最大允許含量為0.5 μg/kg[3]；歐盟規定生乳中AFM1最大限量為0.05 μg/kg，嬰兒配方食品中，AFM1最大限量為0.025 μg/kg[4]。因此，建立快速靈敏檢測AFM1方法對保障乳制品安全具有重要意義。目前檢測AFM1的方法可分為3 大類：第1 類是儀器檢測法如高效液相色譜法[5]、液相色譜-質譜法[6]等，儀器檢測法雖靈敏度高、穩定性強，但儀器成本昂貴，樣品前處理復雜，不適合現場快速檢測；第2 類是免疫分析檢測法如酶聯免疫吸附法[7]，該類免疫分析法雖操作簡便、快速、成本低，但抗體制備周期長，酶活性不穩定，易導致假陽性、假陰性結果；第3 類是基于適配體開發的檢測法，具有簡單、快速、低成本的優勢，適用于現場檢測和快速篩查。

適配體（Aptamer）是一段從隨機序列中篩選獲得具高親和力、強特異性的單鏈寡核苷酸，可以是DNA 或RNA[8]。適配體利用分子間作用力形成穩定二級結構和形成螺旋、發卡、莖環等特殊三維構象[9-10]，能特異識別蛋白質[11]、金屬離子[12]、生物小分子[13-14]、蛋白質[15]等靶標。相比抗體而言，適配體易制備、成本低、周期短、穩定性好，作為一種新型識別元件，被廣泛應用于比色檢測中[16-17]。Setlem等[18]利用磁分離輔助適配體結合DNA 酶構建比色生物傳感器檢測AFB1，檢測限低至22.6 ng/mL。Qiao 等[19]通過優化17β-雌二醇的適配體，構建了相應的適配體傳感器檢測17β-雌二醇，檢出限為0.02 μg/mL。因此，基于適配體識別的檢測法，具有簡單、快速、靈敏、低成本的優勢，在食品安全領域有著巨大的應用前景。

納米金（Gold nanoparticles，AuNPs）具有獨特的物理化學性質如良好的導電性、催化性、高消光系數及可改變的表面等離子體共振吸收等，同時制備簡單，便于吸附生物分子，是比色傳感器中信號傳導的理想材料[20]。張倩雯等[21]開發了一種基于適配體與納米金的比色傳感策略用于檢測牛奶中沙門氏菌，檢出限可達124 CFU/mL。在高濃度鹽溶液條件下，AuNPs 易聚集，導致溶液顏色發生變化，由紅色變為藍色。同時，AuNPs 表面帶負電荷，適配體可吸附在AuNPs 表面從而防止高濃度鹽溶液引起AuNPs 聚集，使溶液保持紅色。當存在靶標AFM1時，適配體與AFM1特異性結合形成特殊三維結構，導致適配體與AuNPs 分離，AuNPs 失去了適配體保護而喪失了抗鹽誘導的能力，當加入高濃度鹽溶液時，AuNPs溶液的穩定性被破壞，AuNPs 發生聚集，溶液由紅色變藍色[22]。基于適配體的AuNPs 比色法檢測AFM1的原理如圖1 所示。

目前文獻報道中常用的AFM1適配體是21（A21）和72（A72）個堿基長度的適配體[23-27]。序列的堿基組成及長度均影響適配體與靶標的親和性。為評價分析不同適配體在實際檢測中的性能，本研究利用適配體對納米金顆粒的吸附與解吸作用[28]，建立基于A21 和A72 適配體的納米金比色傳感體系，實現可視化定量檢測AFM1，并比較兩種適配體傳感器的檢測性能和選擇性，為AFM1適配體在乳制品中的應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉毒素M1（AFM1）、黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）標準品 純度≥99.1%，青島普瑞邦生物工程有限公司；二水合檸檬酸三鈉、氯金酸 分析純，美國Sigma 公司；氯化鈉、甲醇、三羥甲基氨基甲烷 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；脫脂牛奶 本地超市；AFM1適配體序列A21[29]：5’-AC TGCTAGAGATTTTCCACAT-3’、A72[30-31]：5’-ATC CGTCACACCTGCTCTGACGCTGGGGTCGACCC GGAGAAATGCATTCCCCTGTGGTGTTGGCTCC CGTAT -3’ 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

Varioskan LUX 多功能酶標儀 美國Thermo scientific 公司；Milli-Q 超純水系統 美國Millipore 公司；高速臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；電子分析天平 賽多利斯科學儀器有限公司；可調式混勻儀、恒溫金屬浴 大龍興創實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金的制備與表征 采用檸檬酸鈉還原法[32]制備AuNPs 溶液，100 mL 1%氯金酸溶液邊攪拌邊加熱至沸騰后，迅速向溶液中加入2.3 mL 10 mg/mL 檸檬酸三鈉，持續攪拌煮沸15 min，停止加熱，讓溶液緩慢冷卻至室溫，AuNPs 溶液為酒紅色，將制得的AuNPs 溶液于4 ℃避光保存。利用透射電子顯微鏡對合成的AuNPs 尺寸及形貌進行表征，采用酶標儀測定400～800 nm 范圍內的吸收光譜。

1.2.2 檢測條件的優化

1.2.2.1 AFM1適配體濃度優化 向100 μL AuNPs溶液中加入10 μL 濃度為0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100 nmol/L 的AFM1適配體溶液，混勻后于37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，最后加入20 μL 350 mmol/L NaCl 溶液，混勻后室溫孵育5 min，觀察溶液顏色變化，測定520、725 nm 處的吸光值，計算A725/A520值。

1.2.2.2 NaCl 濃度優化 向100 μL AuNPs 溶液中加入20 μL 濃度為0、150、200、250、300、350、400、450 mmol/L 的NaCl 溶液，混勻后室溫孵育5 min，觀察溶液顏色變化，測定520、725 nm 處的吸光值及400～800 nm 范圍內的吸收光譜。

1.2.2.3 反應溫度優化 向100 μL AuNPs 溶液中加入10 μL 濃度為300 nmol/L 的AFM1適配體溶液，混勻后于4、25、37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，再加入不同濃度的AFM1標準品4、25、37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，最后加入20 μL 350 mmol/L NaCl 溶液，混勻后4、25、37 ℃孵育5 min，觀察溶液顏色變化，測定520、725 nm 處的吸光值，計算A725/A520值。

1.2.2.4 pH 優化 將10 μL 濃度為300 nmol/L 的AFM1適配體溶液分別加入至pH 為5、7、10 的100 μL AuNPs 溶液中，混勻后于37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，再加入不同濃度的AFM1標準品37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，最后加入20 μL 350 mmol/L NaCl 溶液，混勻后37 ℃孵育5 min，觀察溶液顏色變化，測定520、725 nm 處的吸光值，計算A725/A520值。

1.2.3 基于適配體的AuNPs 比色法檢測AFM1AFM1適配體首次使用時先5000 r/min 離心2 min，將其溶于超純水，配制為100 μmol/L 的儲備液，再稀釋成300 nmol/L 的AFM1適配體溶液，-20 ℃保存備用。向100 μL AuNPs 溶液中加入10 μL 300 nmol/L AFM1適配體，混合均勻，37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，再加入不同濃度的AFM1標準品（0、50、100、200、400、600 和800 μg/L），37 ℃恒溫金屬浴中孵育5 min，最后加入20 μL 350 mmol/L NaCl 溶液，混勻后室溫孵育5 min，觀察溶液顏色的變化，測定520、725 nm 處的吸光值和400～800 nm范圍內的吸收光譜，以AFM1標準物質作為橫坐標，A725/A520的比值為縱坐標繪制標準曲線，求線性方程。將待測樣品測定的吸光值代入線性方程，以計算樣品中AFM1的含量。

1.2.4 特異性檢測 為分析基于適配體與AuNPs 傳感體系的特異性，分別配制400 μg/L 的AFB1、OTA、ZEN、DON 溶液，并以緩沖液作為陰性對照，按照AFM1定量檢測的步驟（見1.2.3）進行，觀察溶液顏色變化及測定520、725 nm 處的吸光值。

1.2.5 加標回收檢測 取市售牛奶（色譜類法已檢測為陰性）8000 r/min 離心 5 min，棄沉淀，取上清液保存備用。向上清液加入不同濃度的AFM1標準品，獲得200、400、600 μg/L 的陽性樣本。分別取上述樣本各2 mL，加入甲醇2 mL，渦旋混勻4 min，超聲2 min，8000 r/min 離心10 min。取上清液，用0.22 μm過濾膜過濾，得到萃取液。取2 mL 萃取液進行氮吹，溶液濃縮至約0.5 mL 時，用10%甲醇水溶液復溶至1 mL，再按實驗方法（見1.2.3）檢測，每個樣品濃度重復檢測3 次，根據標準曲線計算樣本中AFM1濃度、加標回收率和相對標準偏差。加標回收率的計算公式如下：

式中：P 表示加標回收率；m0表示所加標準物質的質量；m1表示試樣中的被測物質質量；m2表示加標試樣中的被測物質質量。

1.2.6 實際樣品檢測 從本地超市購買多種品牌牛奶，于8000 r/min 離心 5 min，棄沉淀，取上清液保存備用。取上述樣本各2 mL，加入甲醇2 mL，渦旋混勻4 min，超聲2 min，8000 r/min 離心10 min。取上清液，用0.22 μm 過濾膜過濾，得到萃取液。取2 mL萃取液進行氮吹，溶液濃縮至約0.5 mL 時，用10%甲醇溶液復溶至1 mL，再按實驗方法（見1.2.3）檢測，每個樣品重復檢測3 次，根據標準曲線計算樣本中AFM1濃度。采用國標（GB 5009.24-2016）的方法對樣品進行檢測，并對檢測結果進行比較。

1.3 數據處理

實驗數據以“平均值±標準偏差”方式表示，使用Microsoft Excel 2020 及Origin 2016 軟件進行分析及繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 納米金的制備與表征

利用透射電鏡和紫外-可見分光光度計對檸檬酸鈉還原氯金酸法制備的AuNPs 進行表征，如圖2 所示。透射電鏡表征結果顯示本實驗制備的AuNPs形貌為球型，粒徑均一，分散性好（圖2A～圖2C），分散的AuNPs 在520 nm 處呈現最大特征吸收峰（圖2D）。

圖2 AuNPs 的透射電鏡圖（A～C）與AuNPs 的紫外吸收光譜圖（D）Fig.2 Transmission electron microscopy (A～C) and UV absorption spectroscopy (D) of AuNPs

2.2 AFM1 的檢測可行性分析

為了驗證本實驗原理的可行性，利用多功能酶標儀測定了不同條件下AuNPs 溶液的吸收光譜，如圖3 所示。AuNPs 在520 nm 處有最大吸收峰（圖3，曲線b），AuNPs 表面帶負電荷，顆粒間存在靜電排斥作用，在溶液中可穩定分散，溶液呈現紅色。加入350 mmol/L NaCl 后，AuNPs 發生聚集，520 nm 處的吸收峰值顯著降低，溶液變成藍色（圖3，曲線c）。當體系中分別添加300 nmol/L 的A21 和A72 適配體時，單鏈核苷酸鏈適配體暴露出堿基，通過核堿基與AuNPs 相互作用而吸附于表面，阻礙AuNPs 在NaCl 溶液中聚集，使其呈現分散狀態，520 nm 處的吸收峰值處于較高水平，溶液呈現紅色，表明適配體可以保護AuNPs，避免AuNPs 聚集（圖3，曲線d 和e）。當體系中加入400 μg/L AFM1時，適配體與AFM1發生特異性的結合，適配體從無規則的卷曲結構轉變為剛性結構，對AuNPs 的保護作用減弱，導致AuNPs 在NaCl 溶液中聚集，520 nm 處的吸收峰值降低，AuNPs 溶液紅色變為藍色（圖3，曲線f 和g）。溶液的吸收值、顏色變化程度與AFM1濃度均呈比例關系，可據此進行定性或定量檢測。

圖3 不同條件下的 AuNPs 溶液吸收光譜圖Fig.3 Absorption spectra of AuNPs solution under different experimental conditions

2.3 適配體濃度的優化

與裸AuNPs 相比，A21、A72 適配體修飾的AuNPs 粒徑分別從27.78 nm 增加到29.78、30.48 nm（圖4A），Zeta 電位分別從-27.6 mv 變化至-33.05、-34.9 mv（圖4B）。粒徑增大及Zeta 電位降低均表明適配體已成功修飾至AuNPs 表面。

圖4 適配體修飾AuNPs 的表征及A21、A72 適配體濃度優化實驗結果Fig.4 Characterization of AuNPs modified by aptamers and experimental results of A21,A72 aptamers concentration optimization

適配體吸附于AuNPs 表面，保護AuNPs 在高濃度NaCl 溶液中免于聚集。當適配體濃度為100 nmol/L 時，AuNPs 溶液顏色變藍色，低濃度適配體不足以完全覆蓋AuNPs 表面，不能使AuNPs 完全保持分散狀態，未能避免AuNPs 的聚集。隨著適配體濃度增加，適配體對 AuNPs 的保護作用增強，當適配體為300 nmol/L 時，520 nm 處的吸光值明顯增大，A725/A520比值明顯降低（圖4C），說明300 nmol/L的適配體對AuNPs 鹽誘導保護效果很好。當濃度大于300 nmol/L 時，A725/A520比值漸趨平穩，說明適配體吸附AuNPs 已飽和，過量適配體會影響溶液的顏色變化及降低檢測靈敏度。因此，選擇300 nmol/L 為適配體最佳工作濃度。

2.4 氯化鈉濃度的優化

NaCl 濃度是影響AuNPs 分散性及體系檢測靈敏度的關鍵因素。NaCl 中的Na+會通過電荷屏蔽聚集AuNPs，但陽離子和陰離子也可通過各種機制影響AuNPs 的穩定性[33]。隨著NaCl 濃度增加，AuNPs在520 nm 處的吸收峰值逐漸降低，A725/A520比值逐漸升高，溶液顏色發生梯度變化，表明AuNPs 表面電荷發生變化，導致AuNPs 聚集。當NaCl 濃度低于300 mmol/L 時，AuNPs 溶液保持紅色或轉變為紫色。當NaCl 濃度為350 mmol/L 時，520 nm 處的吸光值顯著（P<0.05）下降，A725/A520比值也明顯升高，AuNPs 溶液為藍色（圖5A 和圖5B）。AFM1在50～800 μg/L 的濃度范圍內與A725/A520比值呈良好線性關系，R2分別為0.9774（圖5C 和圖5D）和0.9744（圖5E 和圖5F）。當濃度繼續增大，520 nm 處的吸光值漸趨平緩，A725/A520比值也逐漸平緩，顏色仍為藍色。因此，NaCl 溶液的最適工作濃度為350 mmol/L。

圖5 不同濃度的NaCl 對AuNPs 及檢測AFM1 靈敏度的影響Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl on AuNPs and the sensitivity of AFM1 detection

2.5 反應溫度的優化

反應溫度會影響適配體與AFM1的特異性識別[34]及適配體與AuNPs 的結合[35]，考察反應溫度（4、25、37 ℃）對體系檢測AFM1的影響至關重要。如圖6 所示，基于A21 和A72 適配體的AuNPs 體系的顏色隨著AFM1濃度增加，由紅逐漸轉藍。同時，A725/A520值響應幅度增加，4 ℃時響應幅度低，25 ℃較高，37 ℃最高。37 ℃時，A21 和A72 適配體在50～800 μg/L AFM1濃度范圍內均呈現良好的線性關系，R2分別為0.9948（圖6A 和圖6B）和0.9892（圖6C 和圖6D）。溫度的升高有利于適配體吸附于AuNPs 的表面，更多適配體與靶標物特異性識別。因此，選擇37 ℃作為體系的反應溫度。

圖6 不同反應溫度對AuNPs 及檢測AFM1 靈敏度的影響Fig.6 Effects of different reaction temperature on AuNPs and sensitivity of AFM1 detection

2.6 pH 的優化

pH 對AFM1比色檢測的影響較大，如圖7 所示，在pH 為5 時，基于A21 和A72 適配體的AuNPs體系的顏色隨著AFM1濃度增加，由紅逐漸轉藍，溶液顏色呈現梯度變化，同時A725/A520值響應幅度增加。A21 和A72 適配體-AuNPs 體系的A725/A520值在50～800 μg/L AFM1濃度范圍內呈現良好的線性關系，R2分別為0.951（圖7A 和圖7B）和0.976（圖7C和圖7D）。當pH 為7 或10 時，溶液一直保持紅色，并未轉藍。低pH 溶液中適配體比高pH 溶液中適配體能更有效地吸附在AuNPs 表面[36]，體系響應效果更好，與本實驗的結果一致。因此，選用pH 為5 作為后續實驗的最佳pH。

圖7 不同pH 對AuNPs 及檢測AFM1 靈敏度的影響Fig.7 Effects of different pH on AuNPs and sensitivity of AFM1 detection

2.7 定量檢測AFM1

在最優實驗條件下，建立了基于適配體的AuNPs比色傳感法定量檢測AFM1。隨著AFM1濃度逐漸升高，更多適配體被競爭下來，對AuNPs 的保護變弱，溶液穩定性被破壞，AuNPs 發生聚集，A520值逐漸下降。如圖8A 所示，在AFM1濃度為10～800 μg/L時，基于適配體A21 的AuNPs 比色法檢測AFM1的A725/A520比值與AFM1濃度呈線性關系，線性回歸方程為y=0.0004x+0.3079（R2=0.9977）。基于適配體A72 的AuNPs 比色法檢測AFM1的線性回歸方程為y=0.0007x+0.3851（R2=0.9901）。基于適配體A21 和A72 的AuNPs 比色法檢測AFM1檢測限分別為25.26 和5.77 μg/L。適配體A72 檢測效果優于A21。首先，與適配體的長度有關，較長的適配體更能有效的保護AuNPs，以避免聚集[37]。其次，與適配體的二級結構相關，A72 適配體的構型比A21 更有利于與靶標結合，因此，基于A72 適配體的體系響應效果更佳。

圖8 基于適配體的AuNPs 比色傳感法定量檢測 AFM1 結果Fig.8 Quantitative detection of AFM1 by AuNPs and aptamer colorimetric sensing

2.8 方法的特異性

采用400 μg/L 的AFB1、OTA、ZEN、DON 毒素進行了對比實驗，結果如圖8B 所示。AFM1的A725/A520比值明顯增加，AFB1的A725/A520比值略增，OTA、ZEN 和DON 三種物質的A725/A520比值變化較小，僅對AFM1的結構類似物AFB1具有一定交叉反應，其他真菌毒素不影響本方法定量AFM1，說明A21 和A72 適配體在該檢測方法中具有良好的選擇性和特異性。

2.9 牛奶樣品中AFM1 的加標回收測定

為驗證適配體-AuNPs 比色傳感體系在實際樣品中的準確性和可靠性，采用預處理的脫脂牛奶進行AFM1加標回收實驗。結果如表1 所示，基于A21 和A72 適配體檢測AFM1的加標回收率分別為95.7%～103.6%、94.3%～98.2%，相對標準偏差分別為5.12%～8.71%、4.55%～8.20%。上述結果表明，基于A21 和A72 適配體的AuNPs 比色傳感法的準確度相當，結果可靠。由此可判斷該方法可用于實際樣品中AFM1的測定。

表1 牛奶樣品中AFM1 的加標回收實驗結果（n=3）Table 1 Experimental results of AFM1 recovery in milk samples (n=3)

2.10 真實樣品的檢測

采用本方法對購自本地超市的20 種牛奶樣品分別進行檢測，所有樣品均未檢出AFM1，與國標法（GB 5009.24-2016）檢測結果一致。

3 結論

大部分檢測的靶標分子均存在堿基組成或序列長度不同的多種適配體，因此，建立及評價不同適配體的檢測性能很有必要。本研究利用適配體在AuNPs 表面的吸附及解吸作用，分別建立了基于A21 和A72 適配體與AuNPs 的比色傳感體系定量檢測牛奶中AFM1，評價了AFM1兩種常用適配體的檢測性能。通過優化適配體濃度、NaCl 濃度、反應溫度和pH 后，基于適配體A21 和A72 的AuNPs比色法檢測AFM1檢測限分別為25.26 μg/L 和5.77 μg/L，且選擇性良好。在相同的檢測范圍內，適配體A72 檢測效果優于適配體A21，這可能與適配體長度、二級結構及親和性相關[38]。本研究構建的適配體-AuNPs 比色法操作簡單、快速有效、裸眼可視、特異性強，可為乳制品中AFM1的污染提供快速靈敏準確的檢測方法，也為建立和比較其他靶標相同而適配體序列不同的適配體傳感方法提供參考。但是該方法也存在靈敏度、穩定性有待進一步提高的問題，一方面可通過建立高親和力適配體篩選方法和工程改造技術體系或引入信號放大技術來進一步提高方法的靈敏度。另一方面可通過改變AuNPs尺寸、進行表面修飾改性或調整空間結構來進一步提高方法的穩定性。通過上述策略，實現基于適配體的生物傳感技術在復雜基質食品中的應用。

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