基于低場核磁共振的預(yù)包裝即食牛肉保質(zhì)期預(yù)測模型研究

董海勝，劉恒言，徐 楠，何凱鋒，于燕波，蘭海云，杜秉健，臧 鵬,*

（1.中國航天員科研訓(xùn)練中心，航天營養(yǎng)與食品工程重點實驗室，北京 100094；2.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南洛陽 471000；3.深圳市綠航星際太空科技研究院，廣東深圳 518000）

氫元素是有機生物體的主要組成之一，是蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、維生素及水等膳食營養(yǎng)素的構(gòu)成成分，在食品體系中廣泛存在。低場核磁共振（Low Field-Nuclear Magnetic Resonance，LF-NMR）可通過對含氫元素物質(zhì)的監(jiān)測，實現(xiàn)在無損條件下觀察樣品中含氫元素的分布和變化規(guī)律，各類食品無損檢測中得到廣泛應(yīng)用[1]。目前，低場核磁共振在肉品科學(xué)研究中的應(yīng)用主要集中在肉和肉制品中水分含量和保水性[2]，肌原纖維蛋白凝膠性和變性，脂肪和質(zhì)構(gòu)特性[3]測定等方面。

預(yù)包裝肉制品由于采用了高溫滅菌工藝，達(dá)到了商業(yè)無菌的要求，在密封完好的狀態(tài)下，通常不會因微生物導(dǎo)致保質(zhì)期或食用品質(zhì)受到影響。預(yù)包裝肉制品的貨架期主要受體系中水分遷移、脂肪氧化等影響。Straadt 等[4]用LF-NMR，并輔助以共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM），研究了鮮肉和煮制肉中的水分分布情況。利用NMR 弛豫圖像（T22）測定外部纖維水分含量，發(fā)現(xiàn)鮮肉的持水性有所增加，這與重量分析法和CLSM 圖像得到的結(jié)果一致，這表明隨著肌原纖維數(shù)量顯著增加，能夠容納更多的水分。肉制品在加工和貯藏過程中水分分布和遷移情況也可以利用LF-NMR 進(jìn)行評定[5-7]，研究表明微生物發(fā)酵對肉制品水分分布和保水性變化有重要影響[8]，腌制和蒸煮過程會導(dǎo)致肌原纖維蛋白的變性[9]，可以通過測定弛豫時間，側(cè)面反映肌原纖維蛋白的變性情況。低場核磁共振是一種新型的脂肪含量測定方法[10]，利用LF-NMR 技術(shù)，不僅可以測定脂肪含量，還可以對水分進(jìn)行同時測定。在低頻磁場中，脂肪中的氫原子發(fā)出特殊質(zhì)子信號，這種信號的強度與氫原子的含量有關(guān)，而氫原子的含量與脂肪含量成比例，因此可以利用LF-NMR 檢測該信號進(jìn)而對脂肪含量進(jìn)行分析測定[11-13]。由于LF-MNR 測定過程中不需要使用任何化學(xué)試劑，且操作簡單，不侵入影響被測物品的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)[14]。很多研究表明，利用低場核磁共振技術(shù)可以描述多種食品體系中的脂肪含量和狀態(tài)變化情況[15-19]。

本研究采用預(yù)包裝即食牛肉為研究對象，通過常溫及加速貯存實驗，采集貯存期間樣本的低場核磁譜信息，并同期測定樣品水分、脂肪含量、過氧化值及酸價等指標(biāo)，確定影響其感官品質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)，以此作為保質(zhì)期指示指標(biāo)，建立基于低場核磁譜的保質(zhì)期預(yù)測模型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

航天即食牛肉罐頭 實驗室自研產(chǎn)品（取牛腱子肉，切塊整形，冰水浸泡去血水，煮沸焯水，加八角、桂皮、花椒、小茴香、陳皮、草果與水制備獲得的鹵汁，鹵煮45 min，分裝成40 g/袋，包裝材料為三層耐高溫復(fù)合蒸煮袋（SPET/PA/CPP））；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；磷酸鹽沖液、無菌生理鹽水、冰乙酸、異辛烷、碘化鉀、硫代硫酸鈉、石油醚、碳酸氫鈉、重鉻酸鉀、乙醚、異丙醇、氫氧化鈉、酚酞指示劑 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；試劑采用超純水配制。

MesoMR23-060 核磁共振成像分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；DHP-9162 恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；JC-JZ-08 無菌均質(zhì)器 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；ZDJ-4B 自動電位滴定儀、UPM-N15L 超純水機、PHSJ-4A pH 計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ATY124 分析天平 島津企業(yè)管理（中國）有限公司；DFY-200C 高速粉碎機山東澤榮機械設(shè)備有限公司；SHB-IIIA 真空泵 林茂科技（北京）有限公司；DZF-6020 真空干燥箱 上海儀天科學(xué)儀器有限公司；J-3 菌落計數(shù)器 江蘇天翎儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 即食牛肉的貯存與加速 由范德霍夫規(guī)則[20]方程式K（T+10）/K（T）≈γ（2～4）可知，化學(xué)反應(yīng)速率受溫度影響，且溫度每升高10 ℃，反應(yīng)速率提高2～4 倍。將即食牛肉于常溫下25 ℃±2 ℃貯存，并35 ℃±2 ℃、45℃±2 ℃溫度下（以下記25、35、45 ℃）進(jìn)行加速試驗判斷貨架期終點。

1.2.2 儲藏特性指標(biāo)檢測 菌落總數(shù)：檢測方法為GB 4789.2-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》[21]，貯存第0、180、360 d 各1 次；

感官評價指標(biāo)：參考GB/T 38493-2020《感官分析 食品貨架期評估（測評和確定）》，采用九點喜好度評分法進(jìn)行適應(yīng)性改進(jìn)，貯存第0、60、120、180、210、240、270、286、300、316、330、346、360 d 各一次；

含水量：檢測方法為GB 5009.3-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》第二法的減壓干燥法[22]，貯存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450d 檢測；

含油量：檢測方法為GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[23]，貯存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450 d 檢測；

酸價和過氧化值：檢測方法分別為GB 5009.229-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價的測定》[24]和GB 5009.227-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中過氧化值的測定》[25]。貯存第0、60、120、180、210、240、270、300、330、360、390、420、450 d 檢測。

1.2.3 NMR 特征參數(shù)測定 用于航天即食牛肉檢測的儀器參數(shù)設(shè)定如下：90°脈沖時間P90（μs）=22，180°脈沖時間P180（μs）=42，采樣點數(shù)TD=180024，采樣頻率SW（kHz）=200，重復(fù)掃描次數(shù)NS=8，重復(fù)掃描等待時間TW（ms）=1500，回波個數(shù)NECH=4000；每組4 個平行樣，每隔7～10 d 進(jìn)行一次測試，每個樣品重復(fù)測定3 次。使用紐邁核磁共振分析軟件及CPMG 序列采集樣品T2信號及信號量A2[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗各檢測指標(biāo)取兩次重復(fù)檢測的平均值。采用Excel 2019、SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析及顯著性檢驗，數(shù)據(jù)處理采用偏最小二乘法、主成分分析法等數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 儲藏特性指標(biāo)檢測結(jié)果

隨著貯存天數(shù)的增加預(yù)包裝即食牛肉微生物變化結(jié)果見表1，可知貯存期內(nèi)微生物指標(biāo)無明顯變化。

表1 航天即食牛肉微生物檢測結(jié)果Table 1 Results of microbiological detection of instant beef

感官品質(zhì)的變化見表2，外觀變化見圖1。由于45 ℃加速儲存樣本在第240 d 已質(zhì)地硬，色澤深，不可接受，故未在圖1 中展示。

圖1 預(yù)包裝即食牛肉25 ℃和35 ℃貯存270 d 后色澤變化Fig.1 Color changes of pre-packaged instant beef after storage at 25 ℃ and 35 ℃ for 270 d

表2 航天即食牛肉感官評價結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of instant beef

從圖2 的結(jié)果可見，含水量隨著貯存時間的延長成逐漸降低趨勢，尤其是在45、35 ℃貯存試驗中后期降低幅度較大，導(dǎo)致了感官接受性差。含水量的下降主要是因為高溫加速試驗帶來的包裝材料透濕性的增大造成；另外含油量在高溫加速試驗組有升高，主要是由于含水量的降低帶來的含油量相對增加，常溫貯存含油量變化不明顯；過氧化值試驗期間呈波動上升趨勢；酸價在高溫加速試驗組隨著貯存時間延長呈波動上升趨勢，常溫貯存組變化不明顯。從以上結(jié)果可判定感官接受性是航天即食牛肉貯存期間的強指示性指標(biāo)，酸價具有一定的指示性，但牛肉產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中未對酸價進(jìn)行規(guī)定，因此無判定標(biāo)準(zhǔn)。本試驗依據(jù)感官接受性判定35 ℃貯存下航天即食牛肉的貯存壽命為360 d，45 ℃貯存壽命為210 d，依據(jù)ALST 方程[26]推算出25 ℃貯存下航天即食牛肉的貨架期為540 d。

圖2 預(yù)包裝即食牛肉理化指標(biāo)檢測結(jié)果Fig.2 Test results of physical and chemical indicators of prepackaged instant beef

2.2 NMR 特征參數(shù)測定結(jié)果

利用核磁共振CPMG 序列采集樣品的T2 衰減曲線，詳見圖3，縱坐標(biāo)代表 核磁信號幅度，與樣本中含氫量成正比。橫坐標(biāo)為樣本衰減時間，樣本中整體水分流動性越強，衰減越快。弛豫時間T2 的大小代表水分流動性的強弱，水分結(jié)合得越緊密弛豫時間越短[27]。各種弛豫時間對應(yīng)的峰面積占總面積的比例表示各種水的相對含量，包括T21（0.01～2 ms）、T22（2～15 ms）、T23（15～300 ms）。其中T21表示與蛋白質(zhì)分子表面極性基團(tuán)緊密結(jié)合的水分子層，即結(jié)合水，其對應(yīng)的峰積分面積為A21；T22表示不易流動水，其對應(yīng)的峰積分面積為A22；T23表示自由水，其對應(yīng)的峰積分面積為A23。

圖3 預(yù)包裝即食牛肉CPMG 序列Fig.3 CPMG sequence of pre-packaged instant beef

預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下T21、T22、T23、核磁信號強度、A21%、A22%、A23%變化分別見圖4～圖10。結(jié)果表明，T21（圖4）無明顯變化（貯存第230 d 時檢測數(shù)據(jù)異常增高，可能為數(shù)據(jù)異常點），提示預(yù)包裝即食牛肉中結(jié)合水未發(fā)生變化；T22（圖5）、T23（圖6）的下降表明了產(chǎn)品的流動性在變差，且T22在35 ℃貯存下降低幅度明顯大于25 ℃貯存下，提示加速實驗組不可流動水發(fā)生了較大的變化；核磁信號強度（圖7）隨著貯存溫度升高而降低，提示加速實驗樣品總水損失高于常溫貯存樣品，而且隨著時間的延長損失加劇，這與圖2 含水量變化是相一致的；A21%（圖8）、A22%（圖9）在35 ℃貯存下升高幅度明顯大于25 ℃貯存下，提示隨著溫度的升高，由于自由水的損失量增大，造成了結(jié)合水、不可流動水所占比例越來越高。A23%（圖10）在35 ℃貯存下降低幅度明顯大于25 ℃貯存下，提示隨著溫度的升高，自由水的損失加劇。

圖4 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下T21 隨時間變化Fig.4 T21 changes with time of pre-packaged instant beef under storage at 25 and 35 ℃

圖5 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下T22 隨時間變化Fig.5 Changes of T22 with time for pre-packaged instant beef under 25 and 35 ℃ storage

圖6 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下T23 隨時間變化Fig.6 T23 changes with time for pre-packaged instant beef under 25 and 35 ℃ storage

圖7 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下T2 總信號強度隨時間變化Fig.7 Total signal intensity of T2 varies with time of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃

圖8 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下A21 所占比例隨時間變化Fig.8 Changes in the proportion of A21 of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

圖9 預(yù)包裝即食牛肉25、35 ℃貯存下A22 所占比例隨時間變化Fig.9 Changes in the proportion of A22 of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

圖10 航天即食牛肉25、35 ℃貯存下A23 所占比例隨時間變化Fig.10 Changes in the proportion of A23of pre-packaged instant beef stored at 25 and 35 ℃ over time

以上結(jié)果可見橫向弛豫時間很好地反映了航天即食牛肉在貯存過程中各種水的變化，間接反映了品質(zhì)變化。以橫向馳豫時間的總信號量即T21、T22、T23各部分所代表的不同狀態(tài)水的含量和貯存試驗過程中理化分析所測的樣品的實際含水量進(jìn)行相關(guān)分析，見圖11～圖12。

圖11 航天即食牛肉25 ℃貯存下總信號量和含水量相關(guān)性Fig.11 Correlation between total signal content and moisture content of aerospace instant beef stored at 25 ℃

圖12 預(yù)包裝即食牛肉35 ℃貯存下總信號量和含水量相關(guān)性Fig.12 Correlation between total signal content and moisture content of pre-packaged instant beef stored at 35 ℃

從圖11～圖12 可見含水量與總信號量A 具有顯著相關(guān)性（P<0.05），25 ℃下的相關(guān)系數(shù)R為0.8266，主要是因為含水量變化范圍太窄（38.5～41.0 g/100 g），35 ℃下的相關(guān)系數(shù)R高達(dá)0.9851，含水量變化范圍（19.2～40.5 g/100 g）。

2.3 航天即食牛肉保質(zhì)期預(yù)測模型的建立與驗證

對采集的336 條常溫貯存牛肉的CPMG 序列數(shù)據(jù)文件進(jìn)行譜圖處理，用OPUS 軟件[28]，采用PLS 建立校正集樣品貯存時間數(shù)學(xué)模型，通過模型優(yōu)化，確定選取圖譜范圍720.87～629.97 ms，540.9～0.6 ms，作為分析譜區(qū)，譜圖預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)。模型采用內(nèi)部交叉驗證，建模集相關(guān)系數(shù)（r）為0.94，校正標(biāo)準(zhǔn)差（RMSECV）為35，相對分析誤差（RPD）為3.1，自動優(yōu)化后SECV 隨Rank 變化的趨勢圖見圖13。

圖13 自動優(yōu)化后RMSECV 隨Rank 變化趨勢Fig.13 RMSECV changes with Rank after automatic optimization

預(yù)包裝即食牛肉感官品質(zhì)變化主要受產(chǎn)品的水分含量變化以及酸價和過氧化值變化影響。水分含量的變化會導(dǎo)致預(yù)包裝即食牛肉的口感變硬。酸價和過氧化值的變化會導(dǎo)致預(yù)包裝即食牛肉風(fēng)味發(fā)生劣變，并產(chǎn)生氫過氧化物。最終導(dǎo)致油脂中醛，酮、酸等小分子物質(zhì)逐漸積累，表現(xiàn)出強烈的不良風(fēng)味及一定生理毒性[29]。水分含量變化以及酸價和過氧化值的升高最終會導(dǎo)致預(yù)包裝即食牛肉感官接受性降低，是影響產(chǎn)品的保質(zhì)期的主要因素。因此，采用感官接受性作為預(yù)包裝即食牛肉保質(zhì)期的預(yù)測和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，對10 個分別貯存一定時間但未參與建模的樣本分別進(jìn)行距貨架期終點的時間預(yù)測，預(yù)測結(jié)果詳見表3，建模集的預(yù)測值與實測值之間的擬合圖見圖14。預(yù)測結(jié)果與實測值的相關(guān)性達(dá)0.99，預(yù)測結(jié)果的誤差范圍為0.7%～9.9%，RMSEP 為13.6。

圖14 牛肉距貨架期終點時間預(yù)測模型Fig.14 Prediction model of beef to end of shelf life

表3 牛肉常溫貯存距貨架期終點的時間預(yù)測結(jié)果Table 3 Prediction results of time from the end of the shelf life of beef stored at room temperature

3 結(jié)論

從航天即食牛肉25、35 ℃貯存下T21、T22、T23和A21%、A22%、A23%和A 總量的變化可見橫向弛豫時間很好的反映了航天即食牛肉在貯存過程中各種水的變化，建立了航天即食牛肉含水量和A 總量相關(guān)關(guān)系，在含水量變化范圍19.2%～40.5%內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r高達(dá)98.4；采用PLS 建立校正集樣品貯存時間數(shù)學(xué)模型，通過模型優(yōu)化，確定選取720.87～629.97 ms，540.9～0.6 ms，作為分析譜區(qū)，譜圖預(yù)處理方法為一階導(dǎo)數(shù)。模型采用內(nèi)部交叉驗證，建模集相關(guān)系數(shù)（r）為0.9405，校正標(biāo)準(zhǔn)差（RMSECV）為34.5，相對分析誤差（RPD）為3.1，對10 個分別貯存一定時間但未參與建模的樣本分別進(jìn)行距離貨架期終點的預(yù)測，預(yù)測結(jié)果與實測值的相關(guān)性達(dá)0.99，預(yù)測結(jié)果的誤差范圍為0.7%～9.9%，RMSEP 為13.6，預(yù)測模型的精確度滿足貨架期預(yù)測的精度要求。研究建立的方法模型對同類型高溫復(fù)合蒸煮袋包裝的肉制品保質(zhì)期預(yù)測具有一定的參考意義，對其他類型包裝材料或食品的保質(zhì)期預(yù)測仍需進(jìn)一步進(jìn)行針對性的分析建模。

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