紫蘇葉體外抗氧化和降糖活性分析

趙彥巧，王少平，王 月，孫 冰，李建穎

（天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

紫蘇（Perillafrutescent（L.）Britt）主要分布在中國、韓國、印度和其他東南亞國家[1]，是中國衛生部首批列入的藥用和食用同源植物[2]，其紫蘇葉、紫蘇籽和紫蘇莖已寫入《中國藥典》[3]。紫蘇葉營養成分豐富，可為人體提供酚類、氨基酸、花色苷、維生素和礦物質[4]等營養成分，又有抗氧化[5]、抗炎殺菌[6]、抗過敏性[7]和止嘔[8]等功效。淀粉是由眾多α-葡萄糖殘基單元聚合而成的多糖，在分子水平上由兩種主要類型的α-葡聚糖組成，即直鏈淀粉和支鏈淀粉[9]。大米淀粉在人類飲食中廣泛存在，糊化后的淀粉可被人體內α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等消化酶水解成葡萄糖，從而使餐后血糖升高[10]，增加肥胖、II 型糖尿病和心血管疾病等慢性疾病的發病風險。

多酚類物質的結構和抗氧化能力在胃腸道消化期間會發生變化。師聰等[11]和Kashyap 等[12]發現體外模擬消化后水果中多酚類物質增加且抗氧化能力提高。李項輝[13]采用細胞實驗證實了紫蘇葉提取物可以抑制Caco-2 細胞上的麥芽糖酶和蔗糖酶，同時還阻礙葡萄糖在Caco-2 細胞中的轉運，以達到預防和治療糖尿病的目的。因此，評估紫蘇葉提取物在人體消化后的生物活性是非常重要的。此外，大米淀粉的消化吸收也是研究熱點，減少葡萄糖在人體內的吸收，抑制餐后血糖指數的升高，對肥胖、糖尿病等代謝類疾病的預防大有裨益。已有多項研究表明花色苷等酚類物質可以影響淀粉的多種特性[14]。阿魏酸和沒食子酸可以降低大米淀粉的峰值黏度、熱糊黏度和最終黏度，槲皮素可以提高大米淀粉的糊化溫度[15]。紫紅米糠花色苷提取物可以直接與α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶相互作用，有效抑制淀粉水解，控制血糖水平的升高[16]。然而目前國內外對紫蘇葉提取物的研究主要集中在提取方法、純化方法、穩定性以及抗氧化等方面，忽略了對人體消化后的生物活性研究及其減緩淀粉體外升糖方面的潛力。

體外模擬胃腸道消化是一種操作簡單、成本低廉的實用性替代方案，可以高度控制眾多變量[17]，廣泛應用于研究不同水果制品中花色苷和其他多酚的潛在生物利用度[18-19]。因此本實驗分別將不同比例的紫蘇葉、紫蘇葉粗提物、一次純化物（經大孔樹脂）、二次純化物（經葡聚糖凝膠層析）與大米淀粉混合，研究混合物經模擬胃腸消化前后活性物質含量、抗氧化活性以及還原糖釋放量的變化，以期為研究紫蘇葉提取物體內消化、抗氧化活性以及降糖活性提供一定的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干紫蘇葉（PerillaLeaves，PL）河北祁州中藥材種植園；大米淀粉、胰蛋白酶（消化酪蛋白能力1:250）、Trolox 純度>97.0%，源葉生物科技有限公司；無水乙醇 天津市風船化學試劑科技有限公司；胃蛋白酶（>3000 U/mg）羅恩試劑；淀粉葡萄糖苷酶（來源于黑曲霉液化型）、3,5-二硝基水楊酸 麥克林生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH 純度>97.0%）東京化成工業株式會社；2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS+純度>98.0%）上海易恩化學技術有限公司；其他試劑均為分析純。

AX224ZH 型電子天平、PHS-3C 型pH 計 奧豪斯儀器（常州）有限公司；DZ-2AⅡ型真空干燥箱天津市泰斯特儀器有限公司；RV10DIGITAL 型旋轉蒸發儀 德國IKA 儀器有限公司；AMM-6T 磁力攪拌器 天津奧特塞恩斯儀器有限公司；SY-601 型超級恒溫水浴 天津市歐諾儀器儀表有限公司；UV-2600 型紫外可見分光光度計 島津儀器有限公司；RVA-Tec Master 型快速粘度分析儀 Newport Scientific 儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的制備

1.2.1.1 紫蘇葉粗提物（PerillaLeaves Extraction Powder，PLE）的制備 按照王月[20]的方法，稱取一定量預處理（將干紫蘇葉放入烘箱烘干，取出粉碎，過60 目篩）的紫蘇葉，用40%酸化乙醇（pH2.0）超聲提取，液料比為16:1（mL/g），超聲功率為350 W，溫度為50 ℃，超聲提取37 min，離心取上清液，經減壓蒸餾后，真空干燥得到粗提物。

1.2.1.2 紫蘇葉一次純化物（PerillaLeaves Primary Purified Powder，PLPP）的制備 按照王月[20]的方法，使用AB-8 大孔樹脂對超聲輔助提取的紫蘇葉粗提物進行純化。吸附條件為上樣液pH2.0，上樣流速2 mL/min，上樣濃度4.0 mg/mL，解吸條件為洗脫乙醇濃度84%、洗脫流速1.5 mL/min、洗脫液pH2.5。將得到的樣品經減壓蒸餾后，真空干燥得到一次純化物。

1.2.1.3 紫蘇葉二次純化物（PerillaLeaves Second Purified Powder，PLSP）的制備 按照王月[20]的方法，使用Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠對AB-8 大孔樹脂初純化的提取物進一步分離純化。純化條件為樣品上樣濃度為20 mg/mL，洗脫液濃度為50%甲醇（pH2.0），洗脫流速為1.3 mL/min。將得到的樣品經減壓蒸餾后，真空干燥得到二次純化物。

1.2.1.4 體外消化樣品體系的制備 參考Xiao 等[21]的方法并稍作改動，分別將紫蘇葉及其提取物與大米淀粉按5%、10%、15%的比例混合，即將5%紫蘇葉（PL）、5%紫蘇葉得到的粗提物（PLE）、一次純化物（PLPP）、二次純化物（PLSP）與95%大米淀粉（R）混合均勻；將10%紫蘇葉（PL）、10%紫蘇葉得到的粗提物（PLE）、一次純化物（PLPP）、二次純化物（PLSP）與90%大米淀粉（R）混合均勻；將15%紫蘇葉（PL）、15%紫蘇葉得到的粗提物（PLE）、一次純化物（PLPP）、二次純化物（PLSP）與85%大米淀粉（R）混合均勻。

1.2.2 樣品糊化特性測定 按照美國谷物化學家協會的標準方法AACC-76-21[22]，以3 g 大米淀粉為對照組，取樣品3 g，超純水25 mL，利用快速粘度分析儀（RVA-TecMaster）測定樣品的糊化特性，同時獲得糊狀物樣品。測得峰值黏度（Peak）、谷值黏度（Trough）、衰減值（Breakdown）、終值黏度（Final Visc）、回生值（Setback）、峰值時間（Peak Time）、糊化溫度（Peak Temp），每組樣品平行測定3 次。

1.2.3 體外胃腸道消化模擬 模擬胃消化：稱量RVA 得到的糊狀物樣品2.5 g，加入30 mL 超純水，開啟磁力攪拌加熱。加入0.8 mL 1 mol/L 的鹽酸，待溫度達到37 ℃后，加入1 mL 10%胃蛋白酶溶液，37 ℃消化30 min。模擬腸消化：向模擬胃消化后的樣品溶液中加入2 mL 1 mol/L NaHCO3和5 mL 0.1 mol/L pH6 的馬來酸鈉緩沖液，取樣1 mL 作為消化0 min 時的初始值，記為t0。加入0.1 mL 10 萬U/mL 淀粉葡萄糖苷酶、5 mL 2.5%胰酶溶液和10 mL 超純水，37 ℃消化120 min，在20、60 和120 min 時分別取樣1 mL，記作t20、t60和t120。向t0、t20、t60和t120樣品中分別加入4 mL乙醇，5000 r/min 離心5 min，取上清液，過0.45 μm濾膜，4 ℃冷藏，備用。

1.2.4 體外模擬消化過程中葡萄糖釋放量的測定用3,5-二硝基水楊酸（DNS）測定葡萄糖當量（Glycaemic Glucose Equivalent,GGE），以評估體外120 min 胃腸消化過程中釋放的還原糖，繪制還原糖釋放量與時間的關系曲線，并積分計算曲線下面積（Area under the Curve,AUC）[23-24]。分別取50 μL上述冷藏備用的樣品（見1.2.3）、超純水、5 mg/mL和10 mg/mL 葡萄糖標準溶液于試管中，重復三次；依次向試管中加入0.25 mL 酶溶液A（1%轉化酶溶液:1%淀粉葡萄糖苷酶（10 萬U/mL）:0.1 mol/L 醋酸鈉緩沖液=1:1:100），室溫下消化20 min；向每一個試管中加入0.75 mL DNS 混合液（0.5 mg/mL 葡萄糖標準溶液:4 mol/L NaOH:DNS=1:1:5），用錫紙蓋住試管，沸水加熱15 min；加熱完成后放入冷水中冷卻，向每個試管中加入4 mL 超純水，于530 nm 測吸光度，以葡萄糖標準曲線作為還原糖定量的依據。

1.2.5 體外模擬消化前后總酚含量的測定

1.2.5.1 標準曲線繪制 分別配制濃度為0、12.5、25、50、75、100 和150 μg/mL 的沒食子酸標準溶液，分別在0.5 mL 各濃度標準溶液中加入2.5 mL 0.2 mol/L 的福林酚試劑和2.0 mL 7.5%碳酸鈉溶液，振蕩混勻，避光靜置120 min，于760 nm 下測吸光度。以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，作為總酚含量測定的定量依據。

1.2.5.2 樣品總酚含量測定 為了測定消化前樣品的總酚含量和抗氧化活性，稱取糊狀物3 g，37 ℃用30 mL 70%甲醇攪拌提取120 min。將所得提取物3000 g 離心20 min，取上清液，過0.45 μm 濾膜，4 ℃冷藏，備用。采用福林酚法測定體外模擬消化前后總酚含量，總酚含量表示為mg GAE/100 g DW。

1.2.6 體外模擬消化前后抗氧化能力的測定

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考石雪萍等[25]的方法并稍作改動。取紫蘇葉、粗提物、一次純化物和二次純化物經體外胃腸模擬消化前后的樣品0.5 mL+1 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液+1.5 mL 40%乙醇，搖勻，避光靜置30 min，在517 nm波長處測定吸光度A1；用無水乙醇代替樣品溶液和DPPH 乙醇溶液，基于同樣的方法，測定吸光度A0、A2，按式（1）計算DPPH 自由基清除率。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除能力的測定 參考章燁雯等[26]的方法配制ABTS 母液并稍作改動。在10 mL 容量瓶中分別加入245 μL（100 mmol/L）過硫酸鉀溶液和9.5 mL 7 mmol/L ABTS 溶液，用水補齊至刻度，混合均勻，用錫紙包裹避光靜置16 h。將ABTS 母液滴加到pH7.4 PBS 緩沖液中，使其A734nm=0.7±0.02，即得ABTS 工作液。分別取紫蘇葉、粗提物、一次純化物和二次純化物經體外胃腸模擬消化前后的樣品30 μL 與3 mL ABTS 工作液混勻，室溫避光反應6 min，在734 nm 波長處測定吸光度A1。以無水乙醇替換樣品溶液和ABTS 工作液，以同法操作測定吸光度A0、A2，按式（2）計算ABTS+自由基清除率。

1.3 數據處理

所有實驗均重復測定三次，結果用“平均值±標準差”表示，用SPSS 25 軟件對實驗數據進行統計學分析，采用ANOVA 和Duncan 多重比較方法，P<0.05 表示差異顯著。采用Origin 2019b 繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 紫蘇葉提取物對淀粉糊化特性的影響

不同樣品的RVA 指標見表1。添加不同含量的活性物質后RVA 樣品的糊化特性發生改變，當活性物質添加量為5%時，樣品具有較大的峰值黏度、谷值黏度和終值黏度；當活性物質的添加量增加至10%和15%時，RVA 樣品的峰值黏度、谷值黏度和最終黏度均明顯降低，而糊化溫度升高。其中添加15%一次純化物的RVA 樣品最終黏度最低，為1562.5 cP。這可能是隨著活性物質添加量的增大，樣品組淀粉的含量逐漸降低，同時纖維素和多酚等對淀粉的水合作用有一定的抑制作用[27]，從而降低了峰值黏度、谷值黏度和最終黏度[28]。此外，對照淀粉糊化后的回生值為1369.5 cP，隨著活性物質添加量從5%增加到15%，樣品的回生值顯著降低，添加15%一次純化物的樣品回生值最低，為482.0 cP。對照淀粉糊化后衰減值為964.5 cP，添加活性物質的樣品衰減值顯著增大，且添加15%一次純化物的樣品衰減值最大，達到了1722.5 cP。以上結果表明添加活性物質對淀粉的糊化性質有顯著影響，其峰值黏度、谷值黏度、最終黏度、糊化溫度以及回生值等均與活性物質添加量密切相關。

表1 體外消化樣品的RVA 指標Table 1 RVA indexes of digestion samples in vitro

2.2 體外模擬消化過程中的葡萄糖釋放量

采用DNS 法測定紫蘇葉提取物在體外消化過程中的還原糖釋放量，以評價其對淀粉體外升糖反應的抑制作用，結果如圖1 所示。在0～20 min 內，還原糖釋放量與消化時間的延長成正相關關系，在20～120 min 范圍內，則會降低甚至趨于平緩。其中添加15%一次純化物的樣品消化后還原糖釋放量最低，為43.13 mg/g，約為對照組（134.42 mg/g）的38%。圖2 為消化過程中的AUC 值，AUC 值越低，說明其血糖反應越低。與對照組相比，添加了提取物的樣品消化后還原糖釋放量明顯減少，從而降低了體外升糖反應。隨著活性物質添加量從5%增加到15%，消化過程中的AUC 值總體呈下降趨勢，其中添加15%一次純化物的樣品消化過程中AUC 值最低，為30.86 mg 葡萄糖/g，約為對照組（83.50 mg 葡萄糖/g）的37%。這可能是由于酚類物質和消化酶之間發生相互作用（例如氫鍵、疏水相互作用和離子相互作用），形成了“抑制劑-酶”或“抑制劑-淀粉-酶”的復合物[29-30]，從而抑制消化酶從淀粉中水解還原糖，降低淀粉降解率和還原糖釋放率。

圖1 模擬胃腸道消化過程中的還原糖釋放量Fig.1 Release of reducing sugar during simulated gastrointestinal digestion

圖2 模擬胃腸道消化過程中的AUC 值Fig.2 AUC values during simulated gastrointestinal digestion

2.3 體外模擬消化前后的總酚含量

以A（765 nm）為縱坐標，沒食子酸濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程為：Y=0.012X+0.0249（R2=0.9993）。根據標準曲線計算樣品的總酚含量。模擬胃腸道消化前后總酚含量變化如圖3 所示，紫蘇葉、粗提物、一次純化物和二次純化物經胃腸模擬消化后總酚含量均有顯著增加（P<0.05），消化后多酚含量最高的為添加15%一次純化物的樣品，達到了81.04 mg GAE/100 g DW，是消化前（37.05 mg GAE/100g DW）的2.19 倍。此外，多酚含量隨著RVA 樣品中活性成分的增加而增加，其中添加15%一次純化物的樣品消化后多酚含量為對照組（25.51 mg GAE/100 g DW）的3.18 倍。這可能是因為純化后的紫蘇葉提取物既去除了蛋白、多糖等多種雜質，又保留了大量多酚物質，胃蛋白酶的消化使結合酚類進一步釋放出來[31]。

圖3 模擬胃腸道消化前后總酚含量變化Fig.3 Changes of total phenol content before and after simulated gastrointestinal digestion

2.4 體外模擬消化前后的抗氧化能力

2.4.1 體外模擬消化前后對DPPH 自由基的清除能力 紫蘇葉提取物體外模擬消化前后對DPPH 自由基的清除能力如圖4 所示。經體外胃腸模擬消化后清除DPPH 自由基的能力顯著提高（P<0.05），均大于對照組，約為對照組的1.20～1.56 倍。將活性物的添加量從5%提高到15%，對DPPH 自由基的清除能力沒有明顯變化。其中添加10%一次純化物消化后對DPPH 自由基的清除能力最高，為38.69%，添加5%粗提物的樣品消化前后對DPPH 自由基的清除能力差距最大，消化后的清除率約為消化前的1.93 倍。李欣等[32]的研究發現高粱淀粉-多酚復合物在體外模擬消化后的DPPH 自由基清除率顯著高于消化前。此外，如圖3 和圖4 所示，在模擬消化過程中總酚含量與DPPH 自由基清除能力變化規律相似，圖5 Pearson 相關性分析結果也表明消化前后總酚含量與抗氧化能力具有相關性。Toshima 等[33]研究比較了覆盆子、黑莓和日本紅莓成熟果實中花色苷和多酚的含量及其抗氧化能力，結果也表明這些提取物的總花色苷和總酚含量與抗氧化能力呈極顯著的相關，與本文研究結果一致。

圖4 消化前后對DPPH 自由基的清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging ability before and after digestion

圖5 消化前后的總酚含量與對DPPH 自由基的清除能力的相關性Fig.5 Correlation coefficient amongst total phenol content and DPPH radical scavenging ability before and after simulated gastrointestinal digestion

2.4.2 體外模擬消化前后對ABTS+自由基的清除能力 紫蘇葉提取物體外模擬消化前后對ABTS+自由基的清除能力如圖6 所示。經體外胃腸模擬消化后清除ABTS+自由基的能力顯著提高（P<0.05），且均大于對照組。其中大米淀粉（對照）經消化后清除ABTS+自由基的能力是消化前的1.2 倍，添加5%紫蘇葉粗提物的樣品消化前后對ABTS+自由基的清除能力差距最大，消化后約為消化前的1.5 倍。此外，添加5%紫蘇葉粗提物的樣品消化后對ABTS+自由基的清除能力最低（44.97%），添加15%一次純化物消化后對ABTS+自由基的清除能力最高（57.25%）。如圖3 和圖6 所示，在模擬消化過程中總酚含量與ABTS+自由基清除能力變化規律相似，圖7 中Pearson 相關性分析結果也表明消化前后總酚含量與抗氧化能力具有相關性。汪瑞敏等[34]的研究也發現黃秋葵發酵液對ABTS+自由基的清除率會隨著消化過程中總酚含量的變化而變化，與本文研究結果一致。

圖6 消化前后對ABTS+自由基的清除能力Fig.6 ABTS+ radical scavenging ability before and after digestion

圖7 消化前后的總酚含量與對ABTS+自由基的清除能力的相關性Fig.7 Correlation coefficient amongst total phenol content and ABTS+ radical scavenging ability before and after simulated gastrointestinal digestion

3 結論

本實驗分別研究了紫蘇葉、紫蘇葉粗提物、一次純化物（經大孔樹脂）、二次純化物（經葡聚糖凝膠層析）經過模擬胃腸消化過程的多酚含量變化、抗氧化活性變化以及降糖作用。樣品糊化特性表明，添加活性物質對淀粉的糊化性質有顯著影響，其峰值黏度、谷值黏度、最終黏度、糊化溫度以及回生值等均與活性物質添加量密切相關。體外模擬胃腸道消化過程中，添加了活性物質的樣品還原糖釋放量明顯減少，隨著活性物質添加量從5%增加到15%，AUC 值總體呈下降趨勢，表明紫蘇葉提取物對淀粉體外升糖反應有抑制作用。此外，紫蘇葉、紫蘇葉粗提物、一次純化物和二次純化物消化后樣品中總酚含量均顯著增加（P<0.05），樣品對DPPH 和ABTS+自由基的清除能力提高。研究表明紫蘇葉在食品領域具有重要的利用價值，對提高其在功能性食品中的應用意義重大。

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