益氣解毒方對(duì)12 Gy60Coγ射線誘導(dǎo)的支持細(xì)胞鐵死亡的防護(hù)作用及機(jī)制研究?

莊鑫麗,姜薈茜,徐旻灝,葉一帆,徐文慧,王 安,王 磊,王舒冉,趙章弟,張文彥,張淑靜,胡素敏

(北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029)

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全球有近15%的育齡夫婦受不孕不育問題的困擾,其中男性因素占50%[1]。由于睪丸組織對(duì)放射線非常敏感,長(zhǎng)期接觸放射線的男性出現(xiàn)生殖障礙的概率更高[2]。放射線會(huì)造成曲細(xì)精管的各級(jí)生精細(xì)胞和支持細(xì)胞損傷,影響精子的生成,造成男性不育[3]。支持細(xì)胞是曲細(xì)精管內(nèi)唯一與生精細(xì)胞直接接觸的體細(xì)胞,為精子發(fā)生提供物理支撐、穩(wěn)定的微環(huán)境以及營(yíng)養(yǎng)支持[4],保證精子發(fā)生的正常有序進(jìn)行,一旦受損必然影響精子發(fā)生。近年來有研究顯示,電離輻射可引發(fā)一種新型、依賴活性氧和鐵的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡形式——鐵死亡[5-6]。本課題組前期研究表明,放射線會(huì)引起小鼠睪丸組織氧化損傷,誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生,導(dǎo)致生精功能障礙[7]。課題組前期研究表明益氣解毒方對(duì)上述損傷有很好的防護(hù)作用。那么,放射線是否誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞發(fā)生鐵死亡?益氣解毒方是否能干預(yù)支持細(xì)胞的鐵死亡?為明確以上兩個(gè)問題,本文以小鼠睪丸支持細(xì)胞為切入點(diǎn)展開研究,以期為進(jìn)一步探討該方防治睪丸輻射損傷的潛在分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過,編號(hào)：BUCM-4-20211120301-4085 。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

5～6周齡SPF級(jí)SD大鼠40只,雄性,體質(zhì)量(170±10)g,由斯貝福(北京)生物公司提供,動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0010。所有大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房,溫度(23±2)℃,濕度(50±10%),動(dòng)物自由攝食飲水。

TM4細(xì)胞(正常小鼠支持細(xì)胞)購自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái),細(xì)胞編號(hào)為：1101MOU-PUMC000298。

1.2 藥物與試劑

益氣解毒方由黃芪30 g、馬齒莧15 g、枸杞子10 g 、當(dāng)歸6 g、茯苓12 g、白芍10 g、西洋參6 g、淫羊藿10 g等組成,飲片均購自北京同仁堂有限公司,并由北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中藥教研室老師鑒定,符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定[8]。

胎牛血清(依科賽生物科技有限公司,貨號(hào)：FND500);DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司,貨號(hào)：C11330500BT);胰蛋白酶消化液(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào)：T1300);細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑(Cell Counting Kit-8, CCK-8)試劑盒(北京翱擎生物科技有限公司,貨號(hào)：AQ308-500t);Erastin(美國(guó)APExBIO公司,貨號(hào)：B1524);Liproxstatin-1 (美國(guó)Selleck生物科技有限公司,貨號(hào)：S7699);高遷移率族蛋白B1 ( high mobility group protein box-1, HMGB1) ELISA試劑盒(武漢云克隆生物科技有限公司,貨號(hào)：SEA399Mu);活性氧(reactive oxygen species, ROS)檢測(cè)試劑盒,JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)：S0033S,C2006);鐵離子比色法檢測(cè)試劑盒,蛋白定量試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號(hào)：E1042,P1511);總RNA小量抽提試劑盒(廣州美基生物科技有限公司,貨號(hào)：R4111-02);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,貨號(hào)：K1622);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒(蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司,貨號(hào)：E096-01A)。

1.3 儀器

循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)公司,型號(hào)：SHB-Ⅲ),CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào)：Heracell Vios 160i),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)( 德國(guó) Eppendorf 公司,型號(hào)：5424R),BioTek Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTeK公司,型號(hào)：Epoch2C),熒光酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào)：Varioskan LUX ),正倒置一體熒光顯微鏡(美國(guó) Echo 公司,型號(hào)：Echo Revolve),超微量紫外可見分光光度計(jì)(杭州遂真生物技術(shù)有限公司,型號(hào)：F-2100 ),T100梯度PCR儀(美國(guó) Bio-Rad 公司,型號(hào)：T100 Thermal Cycler),RT-qPCR擴(kuò)增儀(美國(guó) Bio-Rad 公司,型號(hào)：CFX96 ) 。

2 方法

2.1 含藥血清制備

益氣解毒方水煎液制備方法與本課題組前期制備方法一致[9],參考《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[10],將人用藥劑量換算成大鼠等效劑量。所有藥材洗凈后加10倍水量浸泡1 h,武火煮沸后文火繼續(xù)煮1 h,濾出第一次藥液。藥渣繼續(xù)加8倍水量煎煮,步驟同第一次煎藥液,將兩次藥液混勻,繼續(xù)加熱濃縮至原藥材為1～2 g/mL。藥液靜置冷卻后緩慢加入無水乙醇至乙醇濃度為60%,4 ℃冰箱靜置24 h,減壓抽濾藥液,回收乙醇,最終得到生藥濃度為1.044 g/mL的藥液。因前期研究發(fā)現(xiàn)益氣解毒方中、低劑量組對(duì)生殖系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)效果優(yōu)于高劑量組[11-12],所以本實(shí)驗(yàn)選用了效果較好的兩個(gè)劑量進(jìn)行研究。本次實(shí)驗(yàn)高劑量益氣解毒方給藥量為人體臨床等效劑量,生藥濃度為1.044 g/mL,低劑量益氣解毒方給藥量為人體臨床等效劑量0.5倍, 生藥濃度為0.522 g/mL。

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d,隨機(jī)分為空白組和益氣解毒方高、低劑量組,空白組20只,給藥組各10只。空白組灌胃去離子水,益氣解毒方高、低劑量組分別灌胃高、低劑量中藥復(fù)方懸液,給藥劑量為1 mL/100 g,連續(xù)灌胃5 d。末次給藥后30 min,麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈取血,將采血管于室溫靜置4 h后,離心,取血清,同組混合分裝至離心管中,于56 ℃水浴鍋中30 min滅活,經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜除菌,將含藥血清于-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及造模

本研究選用鐵死亡激動(dòng)劑(erastin)作為陽性對(duì)照組,鐵死亡抑制劑(liproxstatin-1, Lip-1)作為陽性藥對(duì)照組。激動(dòng)劑及抑制劑制備方法：將 Erastin和Lip-1分別溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),再用無血清培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。

支持細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的培養(yǎng)基中,置于含有5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中,后續(xù)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的支持細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組及處理如下：空白(negative Control, NC)組：支持細(xì)胞+空白組大鼠血清;模型(ionizing Radiation, IR)組：支持細(xì)胞+IR+空白組大鼠血清;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組：支持細(xì)胞+IR+益氣解毒方高劑量含藥血清;益氣解毒方低劑量(YQJD-L)組：支持細(xì)胞+IR+益氣解毒方低劑量含藥血清;鐵死亡激動(dòng)劑(Erastin)組：支持細(xì)胞+空白組大鼠血清+Erastin,照射前4 h加入 Erastin,使 Erastin的終濃度為 5 μmol/L;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組：支持細(xì)胞+IR+空白組大鼠血清+Lip-1,照射前4 h加入 Lip-1,使 Lip-1的終濃度為 0.2 μmol/L。

造模方法與本課題組前期研究一致[12],除空白組和鐵死亡激動(dòng)劑組的支持細(xì)胞外,其余各組細(xì)胞都使用12 Gy60Coγ射線進(jìn)行一次性照射,照射劑量率為1 Gy/min。

2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

消化細(xì)胞后,將密度調(diào)整至8×104/mL,接種于96孔板中,每孔100 μL,6 個(gè)復(fù)孔/組。接種后24 h按照2.2中的方法復(fù)制支持細(xì)胞輻射損傷模型,在照射24 h后,加入CCK8溶液,10 μL/孔,繼續(xù)孵育2 h。孵育結(jié)束后,使用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm處的吸光度,并按照CCK8說明書計(jì)算細(xì)胞存活率。

2.4 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)支持細(xì)胞ROS水平

將DCFH-DA探針用無血清培養(yǎng)基按1：1 000的比例稀釋至10 μmol/L。細(xì)胞按照8×104/mL的密度接種于12孔板中,每孔1 mL,6個(gè)復(fù)孔/組。分組處理后,消化細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/mL,收集于1.5 mL離心管中,用無血清培養(yǎng)基洗滌2次,重懸于稀釋好的DCFH-DA懸液,于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min,每隔5 min顛倒混勻一次,讓細(xì)胞充分接觸探針。孵育結(jié)束后,細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基洗滌3次,最后重懸于500 μL的無血清培養(yǎng)基中,取100 μL重懸液移入黑色的96孔板,熒光酶標(biāo)儀設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm,測(cè)定熒光強(qiáng)度,熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。

2.5 鐵離子比色法試劑盒檢測(cè)支持細(xì)胞二價(jià)鐵離子(Fe2+)水平

將支持細(xì)胞按照8×104/mL的密度接種于6孔板內(nèi),每孔2 mL,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,經(jīng)分組處理后,去除培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌2次,吸棄PBS。每孔加入200 μL 裂解液裂解細(xì)胞,置于搖床裂解2 h后,取25 μL裂解液用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,根據(jù)BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本濃度,再加入不同體積的裂解液調(diào)整至樣本濃度一致,每個(gè)樣本取100 μL裂解液于1.5 mL離心管中,加入100 μL混合液A(按說明書配制),混勻,于60 ℃水孵育1 h,再加入30 μL鐵離子檢測(cè)劑,混勻,室溫孵育30 min,取上述混合液體200 μL于96孔板,在550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算鐵離子濃度。

2.6 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液 HMGB1水平

將細(xì)胞按照 8×104/mL 的密度接種于24孔板中,每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞經(jīng)分組處理后,于照射后24 h吸取細(xì)胞培養(yǎng)液。嚴(yán)格按照HMGB1檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作,應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處讀板,檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1水平。

2.7 JC-1試劑盒檢測(cè)線粒體膜電位

將細(xì)胞按照 8×104/mL 的密度接種于24孔板中,每孔0.5 mL,3個(gè)復(fù)孔/組。細(xì)胞經(jīng)分組處理后,吸除培養(yǎng)液,用無菌PBS清洗。每孔加入0.25 mL 無血清培養(yǎng)基和0.25 mL的JC-1染色工作液,混勻,于培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。孵育結(jié)束后,吸除上清液,用配制好的JC-1緩沖液洗滌2次,再加入0.5 mL的無血清培養(yǎng)基,在熒光顯微鏡下觀察、拍照,并用Image J軟件分析平均熒光強(qiáng)度。

2.8 RT-qPCR檢測(cè)鐵死亡相關(guān)mRNA的表達(dá)水平

細(xì)胞以8×104/mL接種于6孔板中,每孔2 mL。分組處理后采用總RNA小量抽提試劑盒說明書操作提取總RNA。檢測(cè)RNA濃度及純度,結(jié)果中A260/280的取值在1.9～2.1之間,說明提取的RNA純度高,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)RNA樣本取3 μg用于逆轉(zhuǎn)錄,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制20 μL的逆轉(zhuǎn)錄體系,逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃孵育60 min,70 ℃孵育5 min,終止反應(yīng)。進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增體系：SYBR 10 μL,上下游引物各 0.4 μL,cDNA 2 μL,無酶水7.2 μL;擴(kuò)增條件：95 ℃變性5 min,95 ℃循環(huán)10 s,55 ℃循環(huán)30 s,循環(huán)40次。本實(shí)驗(yàn)選取GAPDH作為內(nèi)參,2-△△Ct表示目的基因相對(duì)定量,引物序列見表1。

表1 鐵死亡相關(guān)基因引物序列

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 益氣解毒方對(duì)12 Gy60Coγ射線輻射后支持細(xì)胞活力的影響

與NC組比較,Erastin組和IR組細(xì)胞活力顯著下降(P<0.01);與IR組比較,Lip-1組、YQJD-H組、YQJD-L組的細(xì)胞活力均顯著提高(P<0.01)。結(jié)果見圖1。

注：與NC組比較**P<0.01;與IR組比較##P<0.01;空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動(dòng)劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組;益氣解毒方低劑量(YQJD-L)組

3.2 益氣解毒方對(duì)12 Gy 60Coγ射線輻射后支持細(xì)胞ROS、Fe2+、HMGB1水平的影響

與 NC組比較,IR組ROS、Fe2+、HMGB1水平均顯著升高 (P<0.01),趨勢(shì)與Erastin組一致。與IR組比較,Lip-1組、YQJD-H組、YQJD-L組的ROS、Fe2+、HMGB1水平均降低(P<0.01)。與YQJD-H組比較,YQJD-L組ROS、Fe2+、HMGB1水平升高(P<0.05)。結(jié)果見表2。

表2 各組支持細(xì)胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平

由于益氣解毒方高、低劑量組含藥血清均對(duì)輻射后的支持細(xì)胞活力降低及ROS、Fe2+、HMGB1水平升高具有明顯的防護(hù)作用,且高劑量益氣解毒方的防護(hù)作用比低劑量益氣解毒方更顯著(P<0.05),因此本研究在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中僅選用益氣解毒方高劑量組作為益氣解毒方組的代表劑量進(jìn)一步研究。

3.3 益氣解毒方對(duì)12 Gy 60Coγ射線輻射后支持細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位的異常改變不僅是線粒體損傷的重要標(biāo)志,也是鐵死亡發(fā)生的早期預(yù)警[13]。JC-1染色表明,與NC組比較,Erastin組和IR組細(xì)胞線粒體JC-1聚合物降低,紅色熒光減弱(P<0.01),線粒體膜電位降低。與IR組比較,Lip-1組和YQJD-H組支持細(xì)胞的線粒體膜電位均顯著提高(P<0.01)。結(jié)果見圖2、表3。

注：空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動(dòng)劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組

表3 各組支持細(xì)胞的線粒體膜電位相對(duì)熒光強(qiáng)度

3.4 益氣解毒方對(duì) 12 Gy60Coγ射線輻射后支持細(xì)胞鐵死亡相關(guān)mRNA表達(dá)水平的影響

與NC組比較,IR組和Erastin組的GPX4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);IR組的ACSL4和 LPCAT3 mRNA 水平顯著升高(P<0.05);而Erastin組的ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平呈升高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與 IR 組比較,Lip-1組GPX4、ACSL4和LPCAT3 mRNA表達(dá)水平均呈升高趨勢(shì),但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與 IR 組比較,YQJD-H組的GPX4 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);ACSL4和LPCAT3 mRNA 水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

注：與NC組比較*P<0.05;與IR組比較#P<0.05;空白(NC)組;模型(IR)組;鐵死亡激動(dòng)劑(Erastin)組;鐵死亡抑制劑(Lip-1)組;益氣解毒方高劑量(YQJD-H)組

4 討論

近半個(gè)世紀(jì)以來,男性精液質(zhì)量以及男性生育率的下降趨勢(shì)十分明顯[14-15],而電離輻射是導(dǎo)致男性不育的重要原因之一。放射線可引起睪丸生精功能損傷,使精子發(fā)生出現(xiàn)異常。精子發(fā)生的過程離不開支持細(xì)胞,支持細(xì)胞為各級(jí)生精細(xì)胞提供了重要的骨架支撐以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),并且能夠通過緊密連接形成血睪屏障,為精子發(fā)育提供必要的微環(huán)境[4]。研究表明,電離輻射作用于生殖系統(tǒng),不僅會(huì)造成生精細(xì)胞的損傷,也會(huì)導(dǎo)致支持細(xì)胞變性、壞死、破壞其緊密連接結(jié)構(gòu),進(jìn)而破壞生精微環(huán)境,不利于精子的生成[16-17]。課題組前期研究表明,電離輻射可嚴(yán)重?fù)p傷由支持細(xì)胞緊密連接構(gòu)成的血睪屏障,使生精功能受損[18],且生精功能的這一損傷與鐵死亡密切相關(guān)[7]。

鐵死亡是一種在形態(tài)、生化方面有特征性變化的細(xì)胞死亡方式,主要生化特征為Fe2+水平升高、ROS聚積,形態(tài)特征為線粒體萎縮、外膜破裂、嵴減少或消失[19]。線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的主要場(chǎng)所,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Fe2+含量升高時(shí),會(huì)通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生大量ROS,導(dǎo)致線粒體損傷、膜電位下降[20],并使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài),誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng),對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴(yán)重破壞,致使細(xì)胞大量死亡。HMGB1是細(xì)胞內(nèi)高度保守的核蛋白,能夠由細(xì)胞發(fā)生鐵死亡后所釋放,被認(rèn)為是鐵死亡中的關(guān)鍵作用分子[21-22]。研究表明,ROS累積能夠促進(jìn)HMGB1從細(xì)胞核易位到細(xì)胞質(zhì),從而促進(jìn)HMGB1的分泌,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡[23]。本研究發(fā)現(xiàn),12 Gy60Coγ射線照射后,支持細(xì)胞的細(xì)胞活力及線粒體膜電位降低,而Fe2+、ROS及HMGB1水平均顯著升高,上述指標(biāo)的變化趨勢(shì)均與鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin的作用結(jié)果一致,且能被鐵死亡抑制劑Lip-1所抑制,提示電離輻射導(dǎo)致了支持細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生。

調(diào)控鐵死亡的通路有很多,其中Xc-/GPX4通路是主要的發(fā)生途徑之一。GPX4是鐵死亡通路的中心調(diào)控因子,能夠抑制細(xì)胞的過氧化,保護(hù)其免受鐵死亡的影響,它的缺失會(huì)造成ROS的累積和脂質(zhì)過氧化物的增多[24]。ACSL4和LPCAT3是脂質(zhì)代謝過程中的重要調(diào)節(jié)者,可以通過催化多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂質(zhì)過氧化物,進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡[25-26],而GPX4可以抑制ACSL4及LPCAT3的活性,降低多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn),12 Gy60Coγ射線照射后,支持細(xì)胞的GPX4 mRNA表達(dá)水平降低,ACSL4、LPCAT3 mRNA表達(dá)水平升高,表明電離輻射能夠通過GPX4/ACSL4/LPCAT3通路,使細(xì)胞ROS累積、脂質(zhì)代謝異常,進(jìn)而誘發(fā)支持細(xì)胞鐵死亡。

鐵死亡屬于調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡(regulated cell death,RCD)的一種[29],可以通過藥物或基因干預(yù)來進(jìn)行調(diào)節(jié)。既往研究表明,鐵死亡是疾病發(fā)展進(jìn)程中的早期事件,會(huì)進(jìn)一步觸發(fā)炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性壞死性細(xì)胞死亡[30-31],因此,早期用藥物對(duì)鐵死亡進(jìn)行調(diào)節(jié),對(duì)病程的截?cái)嗑哂兄匾饬x。中醫(yī)理論認(rèn)為,電離輻射具火毒之性,課題組通過前期的病因?qū)W研究,將其命名為“電離毒”,認(rèn)為其所致?lián)p傷具有暴戾性、廣泛性、頑固性等特點(diǎn)[32]。根據(jù)“電離毒”的致病特點(diǎn),課題組以中醫(yī)治未病理論為指導(dǎo),做到未病先防,既病防變[33],這與鐵死亡的早期干預(yù)不謀而合。源自臨床的益氣解毒方能夠益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)血生精、涼血解毒,在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均被證實(shí)對(duì)輻射造成的生殖損傷具有良好的防治效果[7,12,18]。本研究發(fā)現(xiàn),益氣解毒方能夠恢復(fù)照射后支持細(xì)胞的活力、線粒體膜電位,降低照射后支持細(xì)胞的ROS、Fe2+、HMGB1水平,并且能夠緩解GPX4 mRNA的下降趨勢(shì),與鐵死亡抑制劑Lip-1作用一致。此外,益氣解毒方還降低了ACSL4、LPCAT3 mRNA表達(dá)水平,說明該方可以通過GPX4/ACSL4/LPCAT3信號(hào)通路,調(diào)控電離輻射后細(xì)胞的鐵代謝、脂質(zhì)代謝平衡,從而維持細(xì)胞內(nèi)鐵水平含量平衡,減少細(xì)胞中脂質(zhì)過氧化物的積累,減輕支持細(xì)胞鐵死亡,從而減輕輻射損傷。

綜上,本研究證實(shí)了鐵死亡參與小鼠睪丸支持細(xì)胞輻射損傷,而益氣解毒方可通過調(diào)控GPX4/ACSL4/LPCAT3信號(hào)通路,減輕小鼠睪丸支持細(xì)胞鐵死亡,起到輻射防護(hù)作用。在下一步的研究中,將進(jìn)一步探討電離輻射誘導(dǎo)的支持細(xì)胞鐵死亡影響了該細(xì)胞的哪些結(jié)構(gòu)或功能,益氣解毒方對(duì)上述結(jié)構(gòu)或功能損傷又發(fā)揮了怎樣的防護(hù)作用,從而為進(jìn)一步揭示睪丸輻射損傷的分子機(jī)制及益氣解毒方的防護(hù)機(jī)理奠定基礎(chǔ)。