醒神通督針刺對腦缺血再灌注損傷大鼠自噬的作用研究?

蘭 瑞,鄒旭歡,馬云枝,付雪琴,王漫漫,王瑋瑋,張 勇

(1.河南中醫藥大學第一附屬醫院,鄭州 450000,2.河南中醫藥大學,鄭州 450000,3.鄭州大學第三附屬醫院,鄭州 450000)

腦卒中屬中醫學“中風病”范疇,是我國居民死亡和長期殘疾的主要原因,對家庭和社會造成了沉重的精神負擔和經濟負擔[1]。缺血性腦卒中是腦卒中的重要類型,可導致腦梗死、永久性腦損傷、神經功能缺損等問題,盡快恢復腦組織灌注以減少缺血損傷是急性期發病的主要治療目的[2],然而組織缺血或缺氧后血液供應恢復會導致活性氧大量生成,進而使腦組織氧化損傷進一步加重,該過程被稱為腦缺血再灌注損傷[3]。研究表明,炎癥反應、氧化應激損傷、自噬和凋亡等參與了腦缺血再灌注損傷的發病過程[4-5]。

針刺在缺血性腦卒中的治療中發揮著重要的作用。督脈是與腦關系最為密切的經脈,如《難經·二十八難》云“督脈者,起于下極之俞,并于脊里,上至風府,入屬于腦”,提示針刺督脈經穴可以治療頭部諸疾。頭為“諸陽之會”,督脈“總督諸陽”,為“陽經之海”,故疏通督脈經氣能夠達到醒腦調神、治療腦卒中的功效。醒神通督針刺選用的穴位為百會、四神聰、足三里,臨床應用率較高,且易操作,安全性好。前期課題組實驗研究發現針刺“百會”“四神聰”可抑制缺血缺氧實驗大鼠海馬組織的細胞凋亡,上調膠質細胞源性神經營養因子(glialcellline-derivedneurotrophicfactor,GDNF)、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表達水平[6]。本研究旨在探討醒神通督針刺是否通過介導腦缺血再灌注損傷后自噬而發揮神經保護作用,進一步明確其作用機制。研究方案經河南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物福利倫理委員會審查批準,編號：YFYDW2017015。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠購自河南省實驗動物中心,體質量230～250 g,動物許可證號：SCXK (豫) 2017-0001。大鼠飼養于河南省實驗動物中心動物房,室溫(24±2)℃,濕度(55±5)%,12 h：12 h黑暗/光照循環,自由進食、飲水。

1.2 主要試劑

氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)購自美國Sigma公司,貨號T8170;微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein light chain 3, LC3)、肌球蛋白樣BCL2結合蛋白(coiled coil moesin like BCL2 interacting protein, Beclin-1)、自噬相關蛋白(autophagy related protein, Atg)12、蛋白激酶B (protein kinase B, PKB,又稱Akt)及磷酸化Akt (phosphorylated Akt, p-Akt)、GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司,貨號分別為12741、3495、4180、4060、9272、5174;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)-山羊抗兔二抗、Cy3標記山羊抗兔二抗與凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,貨號分別為A0208、A0516、P0012A。

1.3 主要儀器

SIGMA 3-18K型超速低溫離心機,美國Sigma-Aldrich公司;164-5070蛋白垂直電泳儀、170-4070轉印儀、170-8265凝膠圖像系統,美國B1O-RAD公司;Ti-E熒光顯微鏡,日本Nikon公司。

1.4 分組與造模

適應性喂養1周后,將所有大鼠分為假手術組、腦缺血再灌注模型組(簡稱模型組)和腦缺血再灌注+醒神通督針刺組(簡稱針刺組)。模型組、針刺組大鼠參照課題組先前報道的方法建立腦缺血再灌注損傷模型[7-8]。大鼠深度麻醉后固定于操作臺,頸部正中偏左切開皮膚,充分暴露頸總動脈后分離頸內動脈、頸外動脈。結扎頸外動脈的遠心端,動脈夾夾閉頸總動脈、頸內動脈近心端,從頸外動脈近心端剪開一V字小口,將1根3.0 mm尼龍絲線從頸外動脈插入頸內動脈,深度約19 mm,結扎。90 min后緩慢退出部分絲線以恢復血流。假手術組大鼠進行動脈分離但不插入線栓。大鼠蘇醒后出現對側前爪不能伸展或向對側旋轉或傾倒,則視為造模成功,納入后續研究。造模成功后假手術組納入20只,模型組、針刺組各納入24只大鼠。

1.5 針刺方法

針刺組大鼠造模前5 d開始進行針刺干預直至造模后24 h,其余2組大鼠只抓取不針刺。針刺穴位選擇“百會”“四神聰”“足三里”,參考《實驗針灸學》[9]進行穴位定位。“百會”：兩耳連線與前后中線交點;“四神聰”：百會前后左右各旁開約2 mm;“足三里”：膝關節后外側腓骨小頭下約5 mm。皮膚消毒后,持華佗牌0.25 mm×15 mm針灸針,“百會”“四神聰”平刺5 mm,“足三里”直刺7 mm,每次留針30 min,日1次,10 min行針1次,施平補平瀉手法1 min。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 腦梗死面積觀察 再灌注24 h后,每組取6只大鼠麻醉、斷頭取腦,-20 ℃冰凍15 min行冠狀切片,于1% TTC溶液中37 ℃避光孵育15 min,浸泡于固定液中24 h后拍照。參考文獻報道的方法按照公式[(梗死面積/總面積)×100%]計算腦梗死面積百分比[3]。

1.6.2 缺血皮層神經元自噬亞顯微結構觀察 再灌注24 h后,每組各取3只大鼠麻醉,先后心臟灌注0.9%氯化鈉溶液、2.5%戊二醛溶液。取缺血皮層1 mm3大小的組織6～8塊,置于2.5%戊二醛溶液中固定,送至電鏡室進行樣本處理,透射電鏡下觀察神經元自噬結構。

1.6.3 Western blot檢測缺血皮層Beclin-1、LC3、Atg12、Akt與 p-Akt表達 再灌注24 h后,每組各取6只大鼠麻醉,提取新鮮的腦缺血皮層組織總蛋白并檢測其濃度。蛋白變性后經凝膠電泳分離蛋白,轉膜。5%脫脂牛奶封閉2 h,加入Beclin-1(1：1 000)、LC3(1：1 000)、Atg12(1：1 000)、Akt(1：1 000)、p-Akt(1：1 000)、GAPDH抗體(1：1 000)4 ℃孵育過夜,洗膜后,與HRP偶聯二抗(1：2 000)孵育90 min,再次洗膜后,滴加增強型化學發光液(enhanced chemiluminescence, ECL),在凝膠成像分析系統中顯影,分析目標條帶灰度值。

1.6.4 免疫熒光檢測缺血皮層LC3表達 再灌注24 h后,每組各取3只大鼠麻醉,心臟灌注固定,取出腦組織制作冰凍切片(片厚8 μm)。腦組織切片室溫靜置15 min,10%山羊血清封閉1 h, LC3(1：500)一抗4 ℃孵育過夜,次日經洗片后滴加熒光二抗(1：800)避光孵育90 min,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色后甘油封片,熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠腦梗死面積比較

圖1、表1提示,假手術組大鼠未出現腦梗死,模型組大鼠在大腦中動脈供血區可見明顯梗死區域(P<0.05);與模型組比較,針刺組大鼠梗死區域面積顯著下降(P<0.05)。

注：氯化三苯基四氮唑(TTC),白色部分為梗死區域;A.假手術組;B.模型組;C.針刺組

表1 各組大鼠腦梗死面積比較

2.2 各組大鼠缺血皮層自噬亞顯微結構比較

圖2示,假手術組大鼠透射電鏡下可見缺血皮層神經元細胞膜,核膜連續,線粒體、內質網等細胞器亞顯微結構正常,染色質均勻,自噬體較少。模型組大鼠可見缺血皮層神經元胞外及胞內均腫脹,線粒體密度減少,嵴斷裂,胞質內可見大量的自噬泡及自噬體,豐富的溶酶體,還可見被降解的線粒體。針刺組大鼠缺血皮層神經元胞外可見輕度水腫,細胞器如線粒體輕微腫脹,基質密度接近正常,自噬體、溶酶體數量較少。

注：透射電鏡圖(A～C 2 μm,D～F 200 nm);假手術組(A,D);模型組(B,E);針刺組(C,F)

2.3 各組大鼠缺血皮層腦組織Beclin-1、LC3、Atg12蛋白表達比較

圖3、表2與圖4示,模型組大鼠缺血皮層腦組織Beclin-1、Atg12蛋白表達及LC3Ⅱ/I比值較假手術組顯著升高(P<0.05),針刺組大鼠缺血皮層腦組織Beclin-1、Atg12表達及LC3Ⅱ/I比值較模型組明顯降低(P<0.05)。

注：肌球蛋白樣BCL2結合蛋白(Beclin-1),自噬微管相關蛋白1輕鏈3(LC3),自噬相關蛋白12(Atg12) ;假手術組(Sham);模型組(IR);針刺組(Acu)

注：紅色標記自噬微管相關蛋白1輕鏈3(LC3),藍色標記細胞核;假手術組(Sham);模型組(IR);針刺組(Acu)

表2 各組大鼠缺血皮層腦組織Beclin-1、LC3、Atg12蛋白表達

2.4 各組大鼠缺血皮層腦組織p-Akt、Akt蛋白表達比較

圖5、表3示,與假手術組比較,模型組大鼠缺血皮層腦組織p-Akt表達顯著下降(P<0.05)。與模型組比較,針刺組大鼠缺血皮層腦組織p-Akt蛋白表達顯著上調(P<0.05)。各組大鼠缺血皮層腦組織Akt蛋白表達比較差異無統計學意義。

注：蛋白激酶B(PKB,又稱Akt),磷酸化Akt (p-Akt);假手術組(Sham);模型組(IR);針刺組(Acu)

表3 各組大鼠大腦缺血皮層腦組織Akt、p-Akt蛋白表達比較

3 討論

針刺治療缺血性腦卒中的記載可追溯至《黃帝內經》,歷代醫家總結了豐富的治療經驗,臨床證據顯示,針刺配合中藥口服可顯著改善缺血性腦卒中患者的肢體運動功能[10],明顯促進患者大腦病灶側初級運動區-健側初級運動區功能連接[11]。此外臨床研究還發現,針刺可改善缺血性腦卒中患者失眠、抑郁狀態、便秘等[12-14]。實驗研究證實,針刺可通過改善腦部的血流量、抑制氧化應激損傷和炎癥反應、減少凋亡與自噬發生、減輕腦水腫形成、調節神經遞質活動、促進神經修復與再生等方面多靶點、多途徑治療缺血性腦卒中[15]。

缺血性腦卒中患者多因臟腑陰陽失調,氣血逆亂,清竅閉阻而出現神志不清、肢體痿軟、語竅不通等癥狀。督脈起于胞中,上至巔頂,總督一身之陽,因其循行路線和功能的特殊性,督脈穴位常被用來針刺以治療該病。百會為百脈之會,通達全身經穴。前后神聰與百會均位于督脈,左右神聰旁及足太陽膀胱經,可通達陽氣、醒神開竅。足三里位于足陽明胃經,可升發陽氣、鼓舞脾胃,是臨床治療缺血性腦卒中患者肢體障礙的必選要穴。三穴聯用可達到醒腦開竅、通督調中等功效。實驗選用上述穴位進行研究發現,針刺“百會”“四神聰”“足三里”后大鼠腦梗死面積顯著縮小,提示針刺可減少腦缺血再灌注損傷。

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的病理過程,其中壞死、凋亡和自噬是重要的神經細胞死亡形式,參與腦缺血后神經元損傷的機制[16]。自噬通過吞噬損壞的蛋白或細胞器,與溶酶體融合形成自噬溶酶體降解細胞內容物,維持細胞內環境的穩定。自噬由自噬泡的發生、自噬體的形成、自噬溶酶體形成和自噬體降解[17]等4個步驟組成,最終實現代謝需要和細胞器的更新[18]。自噬過量或不及均可對神經元的存活產生不利影響[19-20]。研究發現,針刺預處理通過抑制自噬過程減輕腦缺血再灌注損傷[21]。此外,針刺已被證明可通過雷帕霉素靶蛋白復合物 (mechanistic target of rapamycin complex,mTORC) 1-unc-51樣自噬激活激酶 (unc-51 like autophagy activating kinase,ULK) 1復合物-Beclin-1途徑抑制自噬和自噬體形成,發揮抗腦缺血再灌注損傷作用[22]。多項研究發現,磷脂酰肌醇-3-激酶 (phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/Akt信號通路參與細胞增殖、代謝與存活,Akt是PI3K信號通路下游蛋白,被磷酸化激活,參與調節腦缺血再灌注誘導的自噬[23-24]。自噬的過程受到嚴格管控,多種蛋白參與其中,Beclin-1、LC3、Atg12是自噬的關鍵蛋白,Beclin-1與PI3K相互作用可觸發自噬,參與自噬體和溶酶體融合的相關步驟[17],Beclin-1促進自噬蛋白定位到自噬泡[25-26]。Atg5參與自噬泡中吞噬細胞膜延伸,與Atg12形成組成型的復合物進而形成自噬體[27]。LC3與自噬體膜結合形成完整的自噬體,然后與溶酶體融合并降解[28]。LC3分為細胞質型(LC3I)和膜型(LC3Ⅱ),LC3Ⅱ與自噬體膜的增多成正比,被認為是自噬體的標志蛋白[29]。目前自噬相關研究以LC3Ⅱ/I比值評估自噬水平[30]。透射電鏡是研究神經元亞顯微結構及自噬最直接的檢測方法之一。研究結果顯示,假手術組大鼠缺血皮層神經元亞顯微結構正常,自噬結構較少;模型組大鼠缺血皮層神經元亞顯微結構破壞,胞外及胞內均出現嚴重腫脹,自噬被激活,出現大量典型的自噬體、自噬空泡、溶酶體;而針刺組大鼠缺血皮層神經元結構較正常,細胞的自噬體、溶酶體較少。結果提示針刺能夠有效調控腦缺血再灌注后自噬的活化。隨后的免疫印跡、免疫熒光檢測結果表明,針刺治療“百會”“四神聰”“足三里”可以顯著上調p-Akt的表達水平,下調Beclin-1、Atg12蛋白的表達及LC3Ⅱ/LC3I比值。故推測醒神通督針刺可能通過抑制自噬來發揮神經保護作用。

綜上所述,針刺具有抗腦缺血再灌注損傷作用,其作用機制可能通過抑制自噬發生來實現,后續將應用通路抑制劑進一步對自噬的相關信號轉導通路進行研究和驗證,以期為針刺治療缺血性腦卒中提供更多的實驗證據。