基于中藥網絡與靶點網絡探究中藥治療糖尿病合并缺血性中風的用藥規律與作用機制?

李清麗,李 浩,謝雁鳴,劉 毅

(1.中國中醫科學院中醫臨床基礎醫學研究所,北京 100700;2.中國中醫科學院望京醫院,北京 100102)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)被公認為是缺血性中風(ischemic stroke,IS)發生的獨立危險因素,并且DM也會增加其他中風危險因素的發生[1]。DM以血糖緩慢升高為主要表現,病因包括胰島素分泌受損或/和作用受損[2-3]。中國DM防治指南顯示,從2007年到2017年,DM的發生由9.7%上升到11.2%,西醫主要運用降糖藥或胰島素進行治療,仍存在胃腸道反應、水腫等諸多不良反應[4]。IS以腦組織血液灌注不足、腦組織壞死為基礎,臨床主要表現為肢體活動障礙[5]。我國每年新增300余萬IS患者,中風是全球主要的死亡和致殘原因,且增加患者的生活負擔[6-7]。西醫主要通過靜脈溶栓、血管內治療、抗血小板藥物進行治療,但仍不能有效防止IS的復發[8]。

DM合并IS在中醫古籍中沒有相應的病名,現代醫家將其稱為“消渴病中風”,二者密切相關,本病起初以消渴為主要表現,逐漸出現中風的癥狀[9]。經過多年的臨床實踐,現代醫家對DM合并IS的病機有了更深入的見解,中藥的綜合治療也取得了安全、有效的成果。但對于有效藥物成分、分子作用機制的研究尚不清楚,網絡藥理學方法可分析藥物與藥物、藥物與疾病之間的關系,被廣泛用于中藥組方治療疾病的機制探討中,本研究收集臨床研究有確切療效的中藥復方,通過中藥網絡與靶點網絡探究中醫藥治療DM合并IS的組方規律,探索藥物有效成分和疾病靶點的關系,以期為后續臨床應用提供思路。

1 資料與方法

1.1 數據來源

檢索中國知網(CNKI)、萬方 (Wanfang)、維普(VIP)、中國生物醫學文獻服務系統(SinoMed)四大中文數據庫。以“糖尿病”“消渴”“缺血性中風”“腦梗死”“缺血性卒中”“病案”“臨床研究”“處方”等為關鍵詞或主題詞進行檢索,年限為建庫至2022年10月3日,根據納排標準納入符合要求的文獻。

1.2 納入標準

文獻為臨床研究或名老中醫驗案、病案,其中有復診的病案只錄入加減的藥物;公開發表的期刊、會議、學位論文等文獻;干預措施為口服中藥湯劑或組成明確的中藥顆粒劑;藥物組成清晰,療效確切。

1.3 排除標準

綜述、系統綜述、指南、專家共識、動物實驗、理論探索等類型文獻;中藥復方藥物組成不明確或信息嚴重缺失;干預措施為針灸、中藥注射液、膠囊制劑等;數據重復發表者,收錄數據完整者或發表較前者。

1.4 數據庫的建立與數據標準化

運用NoteExpress軟件進行文獻管理和查重,以雙人雙錄入的方式收錄文獻相關信息,包括文獻題目、研究者、來源、中醫證型、治法、中藥復方名稱和組成,運用Microsoft Excel 2016建立DM合并IS中藥復方數據庫。參考2020版《中華人民共和國藥典》[10]和《中藥學》[11]規范中藥名稱,對存在別名、不同炮制方式、不同藥用部位的中藥名稱進行統一,如川菖、九節菖蒲、富蒲統稱為石菖蒲等;若主要功效不同,則保留原名,如地黃和熟地黃等。

1.5 數據統計與分析

將規范處理后的數據錄入到古今醫案云平臺中,對藥物出現的頻次及藥物的屬性進行統計;設置置信度為50%,支持度為20%,分析高頻藥物的關聯性;篩選前20個中藥,采用歐氏距離,最長距離法進行群集分析;對高頻藥物構建復雜網絡,挖掘中醫藥治療DM合并IS的核心組方。

1.6 核心組方藥物成分的獲取與靶點篩選

在TCMSP(https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數據庫檢索所得的藥物成分,選擇口服生物利用度 (oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18的部分,收集藥物的成分和相應的靶點,并匯總于表格中。對于TCMSP數據庫中沒有檢索到的中藥,其主要有效成分通過查閱中國知網相關文獻獲得,并利用Pubchem數據庫、SwissADME(http：//www.swissadme.ch/)、SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平臺查找結構、預測作用靶點。之后利用Uniprot(http：//www.uniprot.org/)數據庫,篩選智人(homo sapiens)、已經證實的(reviewed)靶點,并規范靶點所對應的基因名稱,與收集的藥物成分作用靶點匹配,并對靶點進行去重。

1.7 DM合并IS疾病靶點的獲取

借助Genecards(https：//www.genecards.org/)、TTD(http：//db.idrblab.net/ttd/)、OMIM(https：//www.omim.org/)數據庫檢索“diabetes”“ischemic stroke”獲取疾病靶點。將兩疾病靶點匯總后剔除相同的部分,與Uniprot數據庫人類已驗證過的基因靶點相對比后取相同的部分,得到DM合并IS疾病的靶點。

1.8 疾病-藥物-成分-共有靶點網絡構建

將以上得到的藥物成分靶點和DM合并IS疾病靶點取共有部分得到共有靶點,以疾病、核心組方、各中藥、藥物成分和共有靶點為網絡中的一點,其之間的聯系為邊,運用Cytoscape3.9.1軟件,構建相互作用網絡;進一步分析網絡,以度值(degree)≥60為條件,篩選藥物有效成分。

1.9 蛋白相互作用網絡構建(protein protein interaction,PPI)與關鍵靶點篩選

將所得共有靶點導入到STRING數據庫(https：//cn.string-db.org/)中,設置物種為智人,分析獲得蛋白與蛋白相互作用結果,設置所需最低交互分數=0.9,獲取數據后通過Cytoscape3.9.1進行結果可視化分析,借助MCODE插件,設置節點度值(degree)=4,節點(node score)=0.3,K-core=3對PPI網絡進行聚類分析,以大于度值的二倍中位數為條件篩選每一聚類的關鍵靶點。

1.10 靶點基因本體(gene ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

將共有靶點導入到Metascape數據庫(https：//metascape.org/),選擇智人選項,進行GO(生物過程、細胞組分、分子功能)和KEGG富集分析,分別獲取相應的結果。

1.11 分子對接驗證

將PPI網絡中篩選的關鍵靶點與核心組方有效成分兩兩進行分子對接,得到相應的結合能。從PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)下載蛋白的結構,從TCMSP數據庫下載小分子的結構,利用pymol、Auto Dock Tools 1.5.7軟件得到結合能大小,并用R語言制作結合能熱圖。

2 結果

2.1 中藥組方篩選和藥物頻次統計結果

共檢索文獻2 527篇,根據文章標題和摘要初步篩選得到371篇,通過納排標準最終得到文獻144篇,處方239首,涉及中藥194味,共使用1 878次;其中使用頻次≥20次的藥物有26味,運用次數最高的黃芪為103次,見表 1。

表1 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風高頻(頻次≥20)中藥統計

2.2 藥物性、味和歸經統計結果

對239首方劑里的194味中藥進行性、味、歸經的統計,194味中藥的藥性以溫、平、寒為主;藥味以甘、辛、苦為主;歸經以肝、心、脾、肺經為主,見圖 1、圖 2、圖 3。

圖1 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風中藥藥性頻次統計

圖2 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風中藥藥味頻次統計

圖3 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風中藥歸經頻次統計

2.3 關聯規則分析結果

對194味中藥進行關聯規則分析,選擇置信度≥0.55,支持度≥0.20,提升度≥1.65。挖掘出6個潛在藥物配伍,共涉及6味中藥,按支持度從高到低依次排列,見表 2。

2.4 藥物聚類分析結果

基于古今醫案云平臺對高頻中藥進行層次聚類,共獲得4個大的聚類。聚類一：地龍、黃芪、川芎;聚類二：丹參、葛根、水蛭、石菖蒲;聚類三：地黃、麥冬、桃仁、紅花、當歸、赤芍;聚類四：甘草、玄參、牛膝、大黃、天麻、茯苓、山茱萸。見圖 4。

2.5 復雜網絡分析結果

對高頻藥物進行中藥-中藥復雜網絡分析,以邊權重不小于30進行篩選,結合臨床和文獻研究,芳香之品石菖蒲能夠開竅豁痰、醒神益智,在預防和治療IS后認知功能障礙中取得較好的療效,故將石菖蒲納入其中[12-14]。綜合以上分析得出治療DM合并IS的核心組方為赤芍、川芎、丹參、當歸、地龍、葛根、黃芪、石菖蒲、水蛭(補陽還五湯加減),高頻中藥復雜網絡展示如下,見圖 5。

圖4 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風高頻藥物聚類分析

圖5 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風中藥的復雜網絡展示

表2 中醫藥治療糖尿病合并缺血性中風中藥關聯規則分析

2.6 核心組方藥物有效成分獲取和靶點收集結果

經過對TCMSP數據庫的檢索及相關文獻的查閱,通過SwissTargetPrediction平臺進行靶點的選擇,共得到藥物成分187個,經過匯總、去重后得到藥物靶點1 138個。

2.7 疾病靶點獲取結果

通過OMIM、TTD、Genecards數據庫得到的DM、IS靶點分別為4 326、1 034個,DM和IS共有靶點為871個。上述靶點取交集后得到靶點299個。

2.8 疾病-藥物-成分-靶點網絡

運用Cytoscape軟件構建疾病-藥物-成分-靶點網絡,見圖 6,網絡共包含497個節點(299個靶基因、187個藥物成分、9個藥物成分、疾病名稱和核心處方),5 646條邊。篩選度值(degree)≥60的藥物成分進行展示,見表3。度值排位較前的成分槲皮素(quercetin)、水蛭素A(hirudinoidine A)、二氫辣椒素(dihydrocapsaicin)、花生四烯酸(arachidonicacid)等為核心組方的有效成分。

圖6 糖尿病合并缺血性中風-核心組方有效成分-共有靶點網絡圖

表3 中藥治療糖尿病合并缺血性中風的高頻藥物有效成分(度值≥60)

2.9 PPI網絡分析結果

將299個共有靶點導入至STRING數據庫,獲取交集靶點PPI網絡,在相互作用的網格中包含299個作用點和1 148條連接線。將得到的數據導入Cytoscape 3.9.1中進行分析,構建PPI網絡圖,通過MCODE插件分析出3個聚類形式,見圖 7,分別以各自的二倍中位數為界值,篩選3個模塊的關鍵靶點,共得到靶點12個。聚類1得到靶點為絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)3、轉錄因子JUN(transcription factor Jun, JUN);聚類2得到靶點為細胞腫瘤抗原p53 (tumor protein P53,TP53)、信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)3、SRC原癌基因(SRC proto-oncogene,SRC)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、絲裂原活化蛋白激酶又稱MAPK1等;聚類3得到靶點為HRAS原癌基因(HRAS proto-oncogene,HRAS)、凝血酶原F2(coagulation factor Ⅱ,F2)等。這些靶點在PPI中具有重要作用,是核心組方藥物有效成分治療DM合并IS的關鍵靶點。

圖7 核心組方有效成分治療糖尿病合并缺血性中風PPI網絡關鍵靶點篩選流程圖

2.10 GO功能及KEGG通路富集分析結果

299個藥物疾病共有靶點通過Metascape數據庫進行GO功能和KEGG通路富集分析,見圖 8、圖 9。通過GO功能分析篩選得到生物過程(biological process,BP),包括對無機物的反應、對激素的反應、循環系統過程等;細胞組分(cellular components,CC)包括膜筏、質膜微區、小腔、膜側等;分子功能(molecular functions,MF)包括氧化還原酶活性、血紅素結合、四吡咯結合等。KEGG富集通路,富集比較明顯通路為癌癥通路、晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體(advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products,AGE-RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)/AKT信號通路、環腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號通路等。

圖8 核心處方藥物對糖尿病合并缺血性中風作用靶點GO分析

圖9 核心處方藥物對糖尿病合并缺血性中風作用靶點KEGG富集分析氣泡圖

2.11 分子對接結果

利用Auto Dock Tools 1.5.7對接工具對PPI網絡中篩選的關鍵靶點與核心組方有效成分分別進行分子對接,結合能數值可反映其結合強弱,結合能計算結果見圖 10。結合能<0 kcal/mol表明成分與關鍵靶點在自然狀態下可以對接,<-5 kcal/mol表示可以穩定對接。結果顯示槲皮素、水蛭素A、花生四烯酸、丹參新酮與MAPK3、TP53、F2等均有較好的對接結果。

圖10 核心處方有效成分與關鍵靶點分子對接結果

3 討論

大量臨床數據表明, IS的發病與DM有著密切的聯系[15],國內外研究已證實2型DM合并IS的發病機制與炎性反應、氧化應激反應、內皮受損、血小板凝集、凝血纖溶系統異常及胰島素抵抗有關[16]。DM合并IS屬于中醫的“消渴”“中風”,《證治要訣·消渴》篇載“三消久之津血既虧,或目無見,或手足偏廢如風疾”[17]。其發生發展的主要病機為氣虛陰虧、燥熱內盛、煎灼陰津,進而導致血液瘀滯、絡脈瘀阻。因此中藥在治療時運用益氣養陰、活血通脈的治法, 往往取得較好的療效[18]。

本研究通過數據挖掘得到中藥治療DM合并IS的核心組方為清代名醫王清任的補陽還五湯加減。補陽還五湯以補氣活血通絡為主要功效,黃芪甘溫補一身之氣,氣旺則血行通暢,祛瘀生新通絡;川芎、赤芍、丹參養陰活血祛瘀,水蛭破血逐瘀通經,諸活血藥與當歸同用活血而不傷血;地龍通經活絡,性專善走,引領諸藥深入經絡;葛根甘涼,增液生津,使陽明津液上承于口;石菖蒲豁痰醒神,益智開竅,防止痰瘀阻絡進一步加重病情。諸藥合用,符合中藥治療DM合并IS的治則治法。現代藥理學認為補陽還五湯可以保護血管功能、減輕炎癥,臨床研究也證實了補陽還五湯可緩解DM合并IS患者的臨床癥狀[19-20]。

基于中藥靶點網絡和分子對接分析,補陽還五湯治療DM合并IS的有效成分包括槲皮素、水蛭素A、二氫辣椒素、花生四烯酸、丹參新酮等。槲皮素可以通過提高一氧化氮(nitric oxide,NO)水平、增強血管內皮細胞功能、清除自由基以抗炎、抗氧化,還能調控MAPK通路,增強胰島素的敏感性,在DM及腦血管疾病治療方面發揮巨大優勢[21-23]。水蛭素A具有抗凝血、抗血栓、抗腫瘤等多種藥理作用,其通過降低血栓素(thromboxane,TXA2)的含量和激活一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的活性抑制血小板聚集、減輕內皮細胞損傷[24-25]。二氫辣椒素是一種辣椒堿,具有抗氧化應激和抗炎的能力,研究發現,二氫辣椒素能夠激動瞬時受體電位香草酸1受體(transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),誘導藥物性體溫降低,在腦缺血導致的腦損傷中起到保護作用,并且降低活性氧的產生,進而減少腦神經的損傷[26-27]。花生四烯酸在降血脂、抑制血小板聚集、抗炎性物質生成等方面具有自己的優勢,研究表明花生四烯酸能夠減少白介素6、腫瘤壞死因子、活性氧等炎性物質的產生,可有效逆轉2型DM的外周胰島素抵抗[28-29]。丹參新酮是一種丹參酮類物質,通過發揮抗炎、抗氧化應激的作用抑制腦缺血區神經元的凋亡,促進血管新生,改善DM微血管病變,減輕DM大鼠腎細胞的損傷[30-31]。綜上可知,核心組方的多種有效成分具有協同作用,主要通過抗氧化、抗炎、抗血栓、抗胰島素抵抗、改善內皮功能等作用達到治療DM合并IS的目的,與中醫藥配伍理論相一致。

通過PPI網絡分析得到核心處方治療DM合并IS的核心靶點主要包括MAPK3、MAPK1、JUN、TP53、STAT3、AKT1、F2等。MAPK1、MAPK3是絲裂原活化蛋白激酶家族成員,參與機體生長、凋亡、應激適應及細胞炎癥等諸多生理、病理過程,研究發現抑制MAPK信號通路,可以抑制多種炎癥反應,保護DM大鼠的胰腺組織,又能夠抗血小板聚集,保護腦神經細胞[32-33]。JUN是一類蛋白激酶,其中包含c-Jun蛋白,其調控血糖的機制與 MAPK相似,并且當JUN通路被激活時,會降低胰島素的敏感性[34];劉佩等人發現IS時,神經細胞中的c-Jun表達增加,黃芪的使用可以抑制c-Jun蛋白表達,保護已缺血的腦組織[35]。有研究表明,TP53是一種促細胞凋亡基因,可誘導凋亡和內皮損傷,加重腦損傷,通過抑制TP53的表達,可以減輕小鼠的局灶缺血性損傷;TP53還能在炎癥因子的誘導下激活,導致胰島細胞功能紊亂,促進胰島素抵抗[36-39]。STAT3參與Janus激酶(janus tyrosine kinase,JAK)2/信號轉導及轉錄激活因子(signal transducer and activator of tranion,STAT)3通路,此通路的激活,能減輕缺血后促炎物質聚集,減少細胞凋亡,加速血管新生[40]。AKT1參與調節血糖、胰島素抵抗等病理生理過程[41-42];張成發現AKT1可通過磷酸化抑制神經元的凋亡,促進IS后的血管生成,減少腦組織損傷[33]。F2是凝血酶的前體,研究表明DM合并IS的發生與內皮細胞損傷以及凝血纖溶系統異常有關,減少凝血酶的含量可以保護內皮細胞[43-44]。以上基因的表達或抑制跟DM合并IS的病理機制密切相關,推測核心組方或通過對以上靶點的調控發揮治療DM合并IS的作用。

通過KEGG通路富集分析,發現主要有4條通路與DM合并IS的發生發展過程緊密相關,可能為核心組方發揮治療作用的關鍵通路。首先是癌癥通路,其通過參與細胞增殖、分化、免疫、炎性反應、血管調節等過程發揮相應的調節作用[45]。AGE/RAGE信號通路已被證明可以直接或間接(通過激活MAPK通路)活化核轉錄因子(nuclear factor,NF)-κB,增加氧化應激、炎性物質的釋放和血栓的形成,加重血管的病變[46-48]。已知PI3K/AKT信號通路參與機體的免疫炎癥機制,PI3K/AKT通路激活可以促進腦微血管內皮細胞的形成,PI3K/ATK通路障礙可導致胰島素抵抗[33,49-51]。cAMP通路已被證實可以影響胰島B細胞的增殖和凋亡,從而達到抗DM的作用,上調cAMP信號通路可減輕免疫介導的損傷,維持神經元的結構和功能,改善急性腦卒中的預后[52-53]。

本研究通過分析用藥數據與構建用藥網絡,探究中藥治療DM合并IS的組方規律和核心藥物,得到的核心組方為補陽還五湯加減;基于中藥網絡和靶點網絡,分析與DM合并IS相關的氧化應激、炎癥等分子通路機制信息;最后通過分子對接進一步驗證有效成分和關鍵靶點結合的穩定性。體現了中藥復方治療DM合并IS多成分、多作用部位、多機制的特點,為后續的治療提供理論依據及參考。由于本研究是基于數據庫進行用藥組方的規律探討,臨床治療還需結合病人的個體差異制定個性化的治療組方。