基于生物信息學(xué)探討犀角地黃湯治療銀屑病的作用機制?

張 冰,李建偉,劉學(xué)偉,沈萃萃,何 英

(河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000)

銀屑病是一種免疫介導(dǎo)的多基因遺傳性皮膚病,臨床主要表現(xiàn)為丘疹、紅斑、膿皰、鱗屑等皮膚損害,同時可伴有瘙癢、灼痛、關(guān)節(jié)痛等特征,給患者的社會和私人生活帶來較大困擾,有的患者甚至出現(xiàn)精神抑郁、焦慮等癥狀,導(dǎo)致總體生活質(zhì)量低下[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示全世界范圍內(nèi)銀屑病的成人患病率為0.51%至11.43%,兒童患病率則為0%至1.37%[2],近年來其患病率及發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢,給社會和家庭帶來很大的負(fù)擔(dān)[3]。銀屑病病因病機復(fù)雜,與遺傳、環(huán)境及免疫應(yīng)答異常等因素相關(guān)[4]。諸多研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在銀屑病的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。林玲等[7]發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞浸潤、促炎因子釋放等誘導(dǎo)炎癥反應(yīng),導(dǎo)致了銀屑病的發(fā)生發(fā)展。活化的角質(zhì)形成細(xì)胞可釋放趨化因子和細(xì)胞因子參與炎癥反應(yīng),進而維持銀屑病皮損[8]。也有研究發(fā)現(xiàn)中醫(yī)不同證候銀屑病患者血清中細(xì)胞因子的表達存在差異[9]。目前研究報道銀屑病的發(fā)病過程與眾多細(xì)胞因子、趨化因子及其參與炎癥反應(yīng)有關(guān),但未對其特征基因進行篩選,并缺乏系統(tǒng)分析和總結(jié)。

中醫(yī)藥治療銀屑病歷史悠久,療效確切,但作用機制尚待進一步研究。篩選與銀屑病炎癥反應(yīng)相關(guān)的特征基因、有針對性地抑制特征基因的表達可能是銀屑病治療的有效選擇。犀角地黃湯作為治療銀屑病的經(jīng)典方劑,是否存在具有減輕銀屑病炎癥反應(yīng)作用的中藥成分以及相關(guān)的作用靶點值得探索[10]。本研究通過生物信息學(xué)方法篩選出銀屑病炎癥反應(yīng)相關(guān)特征基因,并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測犀角地黃湯中作用于銀屑病炎癥相關(guān)特征基因的成分,以期為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的切入點,為臨床研究提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

本研究所使用的數(shù)據(jù)庫有：GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(https：//www.uniprot.org/)、GSEA數(shù)據(jù)庫(http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)TCMSP數(shù)據(jù)庫與分析平臺(https：//tcmsp-e.com/)、TCMID數(shù)據(jù)庫(http：//www.megabionet.org/tcmid/)、swissdock數(shù)據(jù)庫(http：//www.swissdock.ch/)、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB(http：//www.rcsb.org/)和pubchem數(shù)據(jù)庫(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。數(shù)據(jù)分析主要使用R語言4.1.2,主要使用了“WGCNA”“clusterprofiler”“ggpubr”“Glmnet”“l(fā)imma”及“pROC”等R包。

1.2 銀屑病基因表達數(shù)據(jù)獲取及差異基因分析

使用“Psoriasis”為檢索詞檢索GEO數(shù)據(jù)庫,篩選包含銀屑病皮損及正常對照的數(shù)據(jù)集2組,其中1組作為訓(xùn)練組,另1組作為驗證組。使用R語言中“l(fā)imma”包對表達矩陣進行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因分析,設(shè)置|log2FC|≥1.5和校正P<0.05進行篩選,得出銀屑病的差異基因并繪制火山圖和熱圖。

1.3 炎癥相關(guān)基因提取

以“inflammatory response”為檢索詞檢索GSEA數(shù)據(jù)庫,得到與炎癥反應(yīng)最相關(guān)的基因集,再與上述步驟中的差異基因取交集,得到銀屑病差異表達的炎癥相關(guān)基因(differentially expressed inflammation-related genes, DEIRGs),作為中藥干預(yù)的靶點并進行后續(xù)分析。

1.4 基因本體論 (gene ontology, GO) 和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析

為分析銀屑病DEIRGs潛在的生物學(xué)功能,使用R語言“clusterprofiler”包將步驟1.3得到的DEIRGs進行GO和KEGG富集分析,以P<0.05為過濾閾值篩選出最相關(guān)的GO條目和KEGG通路。

1.5 加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析(weighted geneco-expression network analysis,WGCNA)

首先對基因表達矩陣進行標(biāo)準(zhǔn)化處理,后使用R語言中“WGCNA” 包和“l(fā)imma”包進行WGCNA,分別進行樣本聚類,剔除離群樣本,構(gòu)建無尺度網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)渲丿B矩陣,動態(tài)模塊分析及合并,找到與臨床信息相關(guān)性最強的基因模塊,最后以基因與模塊相關(guān)性>0.8、基因重要性>0.5為過濾條件,在與臨床信息相關(guān)性最強的基因模塊中篩選出核心基因。

1.6 最小絕對值收斂和選擇算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回歸篩選特征基因及驗證

將得到的銀屑病DEIRGs與核心模塊基因取交集得到銀屑病核心炎癥反應(yīng)基因,通過LASSO回歸篩選出與銀屑病發(fā)生高度相關(guān)的特征炎癥基因。然后,通過對驗證組繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve,ROC)評價LASSO回歸篩選特征基因的準(zhǔn)確性和模型的準(zhǔn)確性。

1.7 犀角地黃湯活性成分和靶點的篩選

以中藥名為檢索詞檢索TCMSP、TCMID數(shù)據(jù)庫,根據(jù)口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18或Lipinski五規(guī)則和Veber原則篩選候選活性成分及其對應(yīng)靶點。使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點進行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.8 藥物-炎癥反應(yīng)交集靶點及有效作用成分篩選

將得到的銀屑病DEIRGs與中藥作用靶點取交集得到中藥作用于炎癥反應(yīng)的靶點,并得出起作用的有效成分和中藥。

1.9 分子對接

從Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取中藥有效作用成分的結(jié)構(gòu)文件作為配體,從PDB數(shù)據(jù)庫獲取中藥作用于炎癥反應(yīng)交集靶點的蛋白結(jié)構(gòu)作為受體。將對應(yīng)的配體和受體導(dǎo)入swissdock數(shù)據(jù)庫進行分子對接,并計算結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集與差異基因分析結(jié)果

在GEO數(shù)據(jù)庫檢索得到GSE14905和GSE13355這2個包含銀屑病皮損和正常對照的數(shù)據(jù)集,GSE14905包含21個正常對照和33個銀屑病皮損樣本,GSE13355包含64個正常對照和58個銀屑病皮損樣本。本研究使用GSE14905作為訓(xùn)練組,獲取銀屑病炎癥反應(yīng)特征基因并進行相關(guān)分析,使用GSE13355作為驗證組驗證特征基因的準(zhǔn)確性。經(jīng)差異基因分析,GSE14905共有560個差異基因,其中344個上調(diào)基因,216個下調(diào)基因,見圖1。

a.火山圖;b.熱圖

2.2 銀屑病DEIRGs獲取結(jié)果

在GSEA數(shù)據(jù)庫中,下載炎癥相關(guān)基因集(ID號為M5932),使用該基因集與差異基因取交集,共得到20個銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因,分別為腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin,ADM)、水通道蛋白(aquaporin,AQP)9、C-C趨化因子配體(C-C motif chemokine ligand, CCL)20、CCL22、C-C趨化因子受體(C-C chemokine receptor type,CCR)7、C-X-C基序趨化因子(C-X-C motif chemokine,CXCL)10、CXCL9、凝血因子Ⅲ(coagulation factor Ⅲ,F3)、白細(xì)胞介素( interleukin,IL)-6、IL-7R、CXCL8、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon regulatory factor, IRF)7、溶酶體相關(guān)膜蛋白(lysosomal-associated membrane protein, LAMP)3、淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, LCK)、Lck/Yes相關(guān)新型蛋白酪氨酸激酶(Lck/Yes-related novel protein tyrosine kinase,LYN)、N-myc相互作用因子(N-myc-interactor,NMI)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein,NOD)2、P2Y嘌呤受體(P2Y purinoceptor,P2RY)2、受體轉(zhuǎn)運蛋白(receptor-transporting protein,RTP)4、滋養(yǎng)層糖蛋白(trophoblast glycoprotein,TPBG)。并將它們作為中藥干預(yù)銀屑病炎癥反應(yīng)的潛在靶點基因。

2.3 GO和KEGG富集分析結(jié)果

銀屑病炎癥差異基因的GO富集分析結(jié)果顯示,共富集到779個條目,其中生物過程(biological process,BP)707條,細(xì)胞組分(cell components,CC)21條,分子功能(molecular function,MF)51條。主要與細(xì)胞趨化性、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)吞囊泡、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合等有關(guān),見圖2a。KEGG富集分析結(jié)果顯示,共映射出37條通路,主要與病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號傳導(dǎo)途徑、IL-17信號通路和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)信號通路等有關(guān),見圖2b。

a.GO富集分析;b.KEGG富集分析

2.4 WGCNA分析結(jié)果

WGCNA分析結(jié)果顯示,數(shù)據(jù)集GSE14905的最佳軟閾值β=16,因此本研究選擇軟閾值16構(gòu)建加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò),見圖3a。基于最佳軟閾值分步構(gòu)建基因模塊和共表達矩陣網(wǎng)絡(luò),并通過動態(tài)混合剪切得到6個以熱圖呈現(xiàn)基因模塊與臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性的結(jié)果,對應(yīng)的顏色分別為black、red、blue、brown、green、grey,見圖3b。選擇與銀屑病皮損最顯著相關(guān)的brown模塊,將brown模塊中滿足模塊相關(guān)性>0.8、基因顯著性>0.5標(biāo)準(zhǔn)的基因定義為銀屑病核心基因,共篩選出483個基因,見圖4,并用于下一步分析。

a.軟閾值圖;b.模塊聚類圖

a.銀屑病炎癥差異基因的基因模塊與樣本特征相關(guān)性;b.brown模塊中基因顯著性與模塊相關(guān)散點圖

2.5 核心炎癥反應(yīng)基因篩選結(jié)果

將得到的20個銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因與WGCNA篩選出來的483個核心基因取交集,得到9個銀屑病核心炎癥反應(yīng)基因,分別為CXCL10、F3、IRF7、LAMP3、NMI、NOD2、P2RY2、RTP4和TPBG,見圖5。將此9個銀屑病核心炎癥反應(yīng)基因作為候選特征基因。

圖5 銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因與WGCNA核心基因韋恩圖

2.6 LASSO回歸篩選特征基因及驗證組驗證結(jié)果

提取候選特征基因的表達量建立LASSO回歸模型,共得出6個與銀屑病發(fā)病高度相關(guān)的炎癥反應(yīng)基因,分別為CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG,見圖6a、b、c。使用GSE13355作為驗證組,通過ROC曲線評估特征基因及LASSO回歸模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明各個基因的曲線下面積(area under curve,AUC)均>0.9,見圖6c。LASSO回歸模型的AUC為1,見圖6d,表明該模型準(zhǔn)確性較高,CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG在銀屑病發(fā)病及炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮了重要作用。

a.交叉驗證曲線圖;b.系數(shù)路徑圖;c.圖為不同基因的ROC曲線及其AUC數(shù);d.LASSO回歸模型的AUC為1

2.7 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示,犀角地黃湯中赤芍有29種活性成分,生地黃有8種活性成分,水牛角有5種活性成分,牡丹皮有11種活性成分,這些活性成分共對應(yīng)216個靶點。將靶點標(biāo)準(zhǔn)化后與銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因取交集,得到交集靶點4個,見圖7,分別為CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。進一步解析發(fā)現(xiàn),赤芍中的有效成分鞣花酸(ellagic acid)可作用于CXCL8,芍藥苷(paeoniflorin)可作用于IL-6;牡丹皮中的有效成分櫟精(quercetin)可作用于CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。本研究重點關(guān)注銀屑病炎癥反應(yīng)基因,最終得出的作用靶點和成分較少,故未進行中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖的繪制。

圖7 犀角地黃湯中藥物靶點與銀屑病炎癥靶點韋恩圖

2.8 分子對接結(jié)果

分子對接結(jié)果顯示,鞣花酸與CXCL8結(jié)合能為-7.25 kcal/mol,芍藥苷與IL-6結(jié)合能為-8.08 kcal/mol,櫟精與 CXCL8結(jié)合能為-7.35 kcal/mol,櫟精與IL-6結(jié)合能為-7.15 kcal/mol,櫟精與F3結(jié)合能為-7.47 kcal/mol,櫟精與CXCL10結(jié)合能為-6.94 kcal/mol,各結(jié)合能均小于-6.9 kcal/mol,表明配體和受體均能較好結(jié)合,見圖8。

注：a.代表櫟精與CXCL8;b.代表櫟精與IL-6;c.代表櫟精與F3;d.代表櫟精與CXCL10;e.代表鞣花酸與CXCL8;f.代表芍藥苷與IL-6

3 討論

銀屑病的發(fā)病機制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。具體機制涉及遺傳、免疫等領(lǐng)域,與角質(zhì)形成細(xì)胞異常表達、T淋巴細(xì)胞功能失常、微生物生態(tài)失調(diào)、皮膚屏障功能受損以及持續(xù)存在的炎癥反應(yīng)等有關(guān)[11-12]。本研究通過生物信息學(xué)方法分析GSE14905基因數(shù)據(jù)集,共篩選出560個差異基因,包含344個上調(diào)基因和216個下調(diào)基因,得到了20個銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因。GO富集分析表明銀屑病炎癥差異基因涉及多個生物學(xué)過程,如細(xì)胞趨化性、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、質(zhì)膜外側(cè)、內(nèi)吞囊泡、趨化因子活性、趨化因子受體結(jié)合等。KEGG富集分析主要涉及病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、Toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、IL-17信號通路、TNF信號通路等。這些基因主要參與免疫異常應(yīng)答(包含G蛋白偶聯(lián)體受體結(jié)合,細(xì)胞因子受體結(jié)合,趨化因子受體結(jié)合等)、皮膚屏障功能破壞(包含質(zhì)膜外側(cè),內(nèi)吞囊泡等構(gòu)成皮膚的結(jié)構(gòu)成分)和生物功能調(diào)節(jié)(包含細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路,細(xì)胞趨化性,趨化性的調(diào)節(jié)等)。其中,銀屑病炎癥反應(yīng)差異基因CXCL8、CXCL9、CXCL10、CCL20、Lck可能是趨化T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)維持銀屑病皮損發(fā)展的關(guān)鍵因素[13-16]。細(xì)胞趨化因子參與了銀屑病全身炎癥的發(fā)展,如CCR7、CXCL10等趨化因子可能在銀屑病性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[17-19]。T細(xì)胞中的CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞在銀屑病中的作用已經(jīng)明確,而CD4+輔助細(xì)胞Th1、Th2、Th17亞群分泌的細(xì)胞因子與銀屑病關(guān)節(jié)炎、銀屑病年齡、持續(xù)時間、皮損面積及銀屑病甲等密切相關(guān)。Th17細(xì)胞分泌的IL-17 在銀屑病的發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用,它能夠刺激角質(zhì)形成細(xì)胞并促進樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-12和IL-23等細(xì)胞因子,致T細(xì)胞進一步分化和活化后驅(qū)動銀屑病炎癥發(fā)生[20-21],IL-17家族中的IL-17A已被證明是銀屑病及其關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要參與者[22]。因此,銀屑病皮損及關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展與趨化因子及免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

通過WGCNA分析和LASSO 回歸篩選出與銀屑病發(fā)生高度相關(guān)的6個特征炎癥基因,分別為CXCL10、F3、NMI、P2RY2、RTP4和TPBG。ROC曲線顯示各個基因的AUC面積均>0.9,LASSO回歸模型的AUC為1。這些基因與銀屑病的免疫異常應(yīng)答及皮膚屏障功能受損密切相關(guān)。CXCL10在6個特征炎癥基因中相關(guān)度最高,研究表明,CXCL10在銀屑病患者的病變皮膚和血清中均呈上調(diào)狀態(tài),它能夠吸引輔助性Th1細(xì)胞,通過促進T細(xì)胞趨化和黏附特性在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23]。一項研究發(fā)現(xiàn),NMI廣泛參與了細(xì)胞因子信號傳導(dǎo),而且NMI與PI3、IRF9、IFIT1基因組成的基因簇在女性銀屑病患者的皮損組織和血漿樣本中呈正相關(guān)和差異共表達,這可能是銀屑病的特異性生物標(biāo)志物[24]。P2RY2基因的表達產(chǎn)物P2Y2受體已被既往研究證實參與了人類角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖,P2Y2受體的細(xì)胞外核苷酸是調(diào)控角質(zhì)形成細(xì)胞生長和分化的重要因素[25]。此外,本研究還發(fā)現(xiàn)F3、RTP4和TPBG也參與了銀屑病的相關(guān)炎癥反應(yīng),這揭示了銀屑病的潛在發(fā)病機制并為診斷提供了新的生物標(biāo)志物。

在犀角地黃湯中藥成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中,發(fā)現(xiàn)赤芍的有效成分鞣花酸可作用于CXCL8,芍藥苷可作用于IL-6;牡丹皮中的櫟精可作用于CXCL8、IL-6、F3和CXCL10。研究顯示,鞣花酸可高效抑制銀屑病發(fā)病關(guān)鍵靶點熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)70-1[26]。芍藥苷可顯著降低銀屑病患者外周血單核細(xì)胞中IL-17、干擾素(interferon,INF) -γ、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達[27]。櫟精可通過降低血清中TNF-α、IL-6和IL-17的表達,抑制核因子(nuclear factor,NF)-κB信號通路并改善機體的抗氧化和抗炎狀態(tài),從而發(fā)揮治療銀屑病的作用[28]。這些中藥的有效成分均可作為治療銀屑病的潛在藥物,具有廣闊的研究前景。除了已知的作用靶點外,本研究還發(fā)現(xiàn)鞣花酸和櫟精可共同作用于CXCL8,而櫟精也可作用于本研究前期篩選出的特征炎癥基因F3和CXCL10,這表明,牡丹皮中的櫟精可能是通過影響這些炎癥相關(guān)基因來減輕銀屑病炎癥。

本研究還存在一些不足之處。首先,由于GEO數(shù)據(jù)庫里滿足研究條件的樣本較少,本研究納入分析的樣本有限;其次,網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥物研究的一種新模式[29],其內(nèi)容是基于現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫開展研究,因為這些數(shù)據(jù)庫存在不完善之處,可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響;最后,本研究利用生物信息學(xué)和WGCNA的方法挖掘出6個銀屑病相關(guān)炎癥特征基因,并采用外部數(shù)據(jù)驗證了其診斷效能,但后續(xù)仍需要動物或細(xì)胞實驗進行驗證。綜上所述,本研究明確了6個與銀屑病高度相關(guān)的炎癥反應(yīng)特征基因,這些基因可能成為治療銀屑病的潛在靶點。本研究還探討了這些基因的功能和可能涉及的信號通路,為探索銀屑病的發(fā)生機制提供了參考。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究,本研究發(fā)現(xiàn)治療銀屑病的經(jīng)典方劑犀角地黃湯中的鞣花酸、芍藥苷和櫟精可能是治療銀屑病炎癥的潛在藥物,這為從炎癥角度應(yīng)用中醫(yī)藥治療銀屑病提供了思路。