基于TLR4信號通路探討宣肺化濕止咳湯干預CVA豚鼠氣道重塑機制研究

★ 羅惠娥 范亞國 何軍 丁兆輝（.江西中醫藥大學 南昌 330006；.江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）是臨床較為常見的哮喘類型，以干咳為主要癥狀，癥狀常在夜間、凌晨或運動時加劇，雖然沒有典型哮喘的呼吸困難癥狀，但仍然存在氣道高反應性和慢性炎癥癥狀［1］。目前，我國CVA的發生率呈明顯上升趨勢，引起專家學者的廣泛關注和重視［2］。CVA的發病機制尚未完全明確，主要改變涉及氣道重塑、氣道高反應性、氣道炎癥等［3］。慢性炎癥損傷氣道上皮細胞，長期暴露的迷走神經末梢會使感受器興奮閾值下降，容易被微小的刺激激惹，使小氣道收縮，刺激神經末梢咳嗽感受器，使患者發生咳嗽［4-5］。CVA是由細胞因子、炎癥因子、炎癥介導、變態反應性炎癥等多種機制引起。TOLL樣受體（TLR）是從果蠅身上發現的模式識別受體，能夠通過對病原體的識別及相關炎癥因子的調節以激活固有免疫及適應性免疫系統，與哮喘的發生密切相關。TLR屬于跨膜糖蛋白，TLR4可能介導CVA。作為固有免疫系統中結構和生物學特性剖析比較透徹的模式識別受體，TLR4與CVA的發病有著密切的關系［6］。氣道上皮細胞TLR4的表達參與吸入過敏原介導的嗜酸性粒細胞反應。這證明不同細胞表達的TLR4對吸入過敏原產生的免疫應答具有不同程度的調控作用［7］。Meta分析結果顯示，TLR4中rs4986791基因變異會增加哮喘發生風險，且突變基因rs1927907可能與哮喘的嚴重程度有關。胸腺基質淋巴細胞（TSLP）由上皮細胞分泌，在氣道重塑中起關鍵作用，TLR4的活化可以促進TLSP的生成，TLR4抑制劑則可通過抑制TLSP表達改善氣道重塑［8］。隨著中醫的發展，中醫在治療各種疾病上具有獨特的見解。CVA在中醫學屬于“久咳”“哮喘”等范疇。本病臨床多見濕熱郁肺證型，其主要病理特征為濕熱郁痹，與現代醫學CVA氣道炎癥、氣道重塑可能存在必然的相關性［9-10］。而宣肺化濕止咳湯以清熱化濕、宣肺止咳為主要功效，對濕熱郁肺型CVA具有明顯臨床療效［11］，宣肺化濕止咳在治療濕熱郁肺型CVA上是否通過影響TLR4信號通路而減輕其氣道炎癥及延緩其氣道重塑。因此本文用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉進行療效比較，分析宣肺化濕止咳湯對TLR4信號通路影響CVA的作用機制，進一步為臨床治療CVA提供理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

60只清潔級豚鼠作為研究對象，均為雄性，平均年齡（3.84±0.42）周。體重90~110 g，平均體重（100.5±12.2）g。

1.2 主要藥物

宣肺化濕止咳湯配方顆粒主要藥物：炙麻黃10 g，連翹10 g，赤小豆30 g，枇杷葉10 g，蔻仁10 g，桑白皮15 g，桔梗10 g，前胡10 g，厚樸10 g，杏仁10 g，甘草6 g。以上中藥均為顆粒劑（廣東一方制藥有限公司）。孟魯司特鈉片（順爾寧，杭州默沙東制有限公司，批號17047，10 mg）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組方法 將60只豚鼠經適應性飼養1周，觀察呼吸次數、體重、進食水量等基礎生命體征無明顯差異，按隨機數字表法分為4組，包括空白組、模型組、宣肺化濕止咳湯組、孟魯司特鈉組，各15只。

1.3.2 造模方法 本造模方法參考咳嗽變異性哮喘的造模方式［12］，采用經典的卵蛋白（OVA）和氫氧化鋁激發致敏并用OVA激發的方法復制CVA模型豚鼠。正常飼養3 d后開始實驗，除空白組外，其余各組均在第1、8天每只豚鼠腹腔注射10%OVA和氫氧化鋁混合溶液1 mL致敏。從第15天起，模型組及各給藥組豚鼠置于密閉有機玻璃罩內，給予含1% OVA溶液的生理鹽水超聲霧化激發2 min，每天1次，共10 d。激發時觀察豚鼠反應，如出現咳嗽、豎毛、噴嚏、干嘔、腹肌抽動、極度煩躁等現象中2種或2種以上者，或抽搐、虛脫現象之一者，判定為造模成功。

1.3.3 模型制備 將咳嗽變異性哮喘病的造模方法與濕熱證的造模方法相結合進行咳嗽變異性哮喘濕熱證模型制備。

第l天、第8天：每只腹腔注射OVA溶液1 mL/次。第8天OVA致敏后開始放入人工氣候箱中，溫度（32.0±0.5）℃，相對濕度（90±5）%，每天造模時間為8∶00—12∶00和13∶00—17∶00，連續1周。

第15天開始1% OVA溶液霧化，30 min/（次·只）。第16天開始濕熱環境暴露改為4 h（13∶00—17∶00）。霧化與濕熱環境暴露交替進行，均隔日1次，連續4周，全程高脂高蛋白飼料喂養。

高脂高蛋白飼料配方：普通鼠類飼料65%，豬油15%，雞蛋10%，全脂奶粉5%，蔗糖3%，芝麻油1%，食鹽0.8%，豬膽鹽0.2%。

模型鑒定方法：豚鼠在激發后出現咳嗽、撓鼻、伸頸、口周發紺、行動遲緩等癥狀，并有濕熱證的表現，如嗜臥、行動呆滯、飲水少、便溏臭穢、小便黃、舌質紅、苔黃膩等，則為造模成功。

1.4 給藥方法

造模成功后，空白組、模型組予以同等劑量生理鹽水。孟魯司特鈉組按孟魯司特鈉0.01 mg/（g·d），制成混懸液灌胃，4 ℃保存。宣肺化濕止咳湯組取顆粒加蒸餾水分別配制成濃度為0.74、1.48、2.22 g/mL的溶液灌胃。每日1次，連續10 d，給藥劑量均為0.17 mL/（g·d）。

1.5 取材方法

治療結束后，先將大鼠禁食（可自由飲水）24 h，稱量各組大鼠體質量，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉實驗動物，在頸部及前胸部通過正中切口暴露氣管及臟、肺，分離氣管，并剪取100 mg氣管，用以做氣管羥脯氨酸測定。結扎右主支氣管后，左肺行支氣管肺泡灌洗術，分2次進行，分別灌入0.9% NaCl 3、4 mL，共計7 mL。每次灌注完畢，輕揉肺葉1~2 min，再回收支氣管肺泡灌洗液（BALF），將2次收集的BALF均勻混合，回收液以1 500 r/min離心5 min，取上清液，-20 ℃貯存待檢測。

1.6 細胞的分類及計數檢測

末次霧化結束24 h后，用10%的水合氯醛按照300 mg/kg麻醉實驗動物，在頸部及前胸部通過正中切口暴露氣管及臟、肺，分離氣管，并剪取100 mg氣管，用以做氣管羥脯氨酸測定。每只豚鼠收集BALF 10 mL離心，沉淀物涂片固定。取右肺中葉在浸泡于4%多聚甲醛室溫固定，用以HE染色、Masson染色等。

1.7 氣道重塑相關指標測量

Masson染色并采用Image- Pro Plus圖像分析軟件測量氣道膠原沉積的面積，同時測氣道壁相關數值。

1.8 蛋白免疫印跡法檢測肺組織TLR4、NF-κB的表達

取豚鼠肺組織100 mg提取總蛋白后，經電泳轉膜封閉后，豚鼠PPAR-γ、TLR4、NF-κB、NLRP3 ADPN一抗孵育，采用HRP標記的二抗，以ECL發光液顯色，采用Alphaease FC軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.9 觀察指標

（1）觀察4組豚鼠肺泡灌洗液中細胞的分類及計數。（2）觀察4組豚鼠氣道重塑相關指標，包括支氣管基底膜周長（Pbm）、內壁面積（WAi）以及氣道平滑肌面積（WAm）水平。測得數據采用Pbm進行標準化，反映氣道重塑程度。（3）觀察4組豚鼠肺組織TLR4、NF-κB的表達水平。

1.10 統計學方法

實驗所有數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，方差不齊用Welch法近似方差分析。兩兩比較方差齊用LSD法，方差不齊用Games- Howell法檢驗。非正態分布、方差不齊者組間比較采用非參數Kruskal-1i檢驗，兩兩比較采用All Pairwise檢驗。以P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 肺泡灌洗液中細胞的分類及計數比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組肺泡灌洗液中各細胞計數明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組各細胞計數明顯降低（P<0.05）；而宣肺化濕止咳湯組與孟魯司特鈉組各細胞計數比較無顯著差異（P>0.05）。見表1。

表1 4組豚鼠肺泡灌洗液中細胞的分類及計數比較（n=15） ×108/L

2.2 氣道重塑相關指標比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平明顯增大（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均顯著降低，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組（P<0.05）。見表2。

表2 4組豚鼠氣道重塑相關指標比較（n=15）

2.3 肺組織TLR4、NF-κB表達水平比較

與空白組比較，模型組、魯司特鈉組、宣肺化濕止咳湯組TLR4、NF-κB表達水平均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組TLR4、NF-κB表達水平均顯著下降，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組（P<0.05）。見表3。

表3 4組豚鼠肺組織TLR4、NF-κB表達水平比較（n=15）

3 討論

CVA是以咳嗽為唯一或主要癥狀的一種特殊類型的哮喘［13］。CVA患者大多數無喘息、氣急等特征，但可存在氣道高反應性。32%~54%的CVA患者可發展為典型哮喘，提示CVA可能是支氣管哮喘的早期，與哮喘存在相同的發病機制［14］。CVA是我國慢性咳嗽最常見的病因，其發病率有所增加［15-16］。隨著對咳嗽變異性哮喘病理生理的進一步研究，國內外專家發現CVA患者存在不同程度的氣道重塑。咳嗽變異性哮喘與典型哮喘具有相同的發病機制與病理生理特點。氣道重塑不僅是CVA持續性氣道高反應性、不可逆性氣道阻塞的重要病理基礎，而且是CVA遷延難愈的主要原因［17-18］。研究表明，CVA的發病機制多從氣道重塑、氣道高反應性、氣道炎癥、喘息閾值改變等方面論述［19］。其中，以嗜酸性粒細胞浸潤為主的氣道炎性反應及相關形態重塑是影響CVA發生發展的關鍵機制［20］。

中醫學認為濕熱郁肺為CVA發病的重要病因，濕熱郁肺之證，濕熱在肺，肺氣郁遏，僅靠宣肺恐難以對此類咳嗽起效。該病濕熱郁滯，肺失宣降的病理特征與現代醫學中CVA氣道炎癥、氣道重塑可能存在必然的相關性。在濕熱治療方面，根據濕熱郁閉肺氣、肺失宣降的病機，提出宣肺與化濕二法相結合，可使濕熱除、氣道暢，肺氣方得宣降復常，而咳嗽自愈。宣肺化濕止咳湯是課題組廣泛應用于CVA濕熱郁肺證患者治療的經驗方，療效顯著。該方由麻黃連翹赤小豆湯加減而成，可達到宣肺化濕、疏通氣道之效［21］。“濕熱郁肺”與CVA氣道炎癥、氣道重塑存在必然的相關性，宣肺化濕止咳湯可能是防治CVA有效途徑。因此本文采用豚鼠建立CVA模型，采用宣肺化濕止咳湯進行治療，并采用孟魯司特鈉進行比較，分析對CVA的治療效果。在本研究結果中，采用宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉對于肺泡灌洗液中的中性粒細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞以及細胞總數均可降低，提示宣肺化濕止咳湯和孟魯司特鈉均能有效抑制豚鼠CVA模型的氣道炎癥，從而減輕CVA豚鼠模型的病情。氣道重塑是目前臨床認為CVA存在的主要變化，不僅是CVA持續性氣道高反應性、不可逆性氣道阻塞的重要病理基礎，而且是CVA遷延難愈的主要原因［22］。在本文研究中發現，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組WAi/Pbm、WAm/Pbm水平均顯著降低，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組。結果提示，宣肺化濕止咳湯有利于改善CVA豚鼠模型的氣道重塑癥狀，抑制氣道重塑的發生。由于宣肺化濕止咳湯中炙麻黃能發汗解表、宣肺平喘；連翹能清熱解毒，疏風去邪；赤小豆能利水消腫、解毒排膿；枇杷葉能清肺止咳；前胡能解表退熱；甘草理氣和中、調和諸藥。全方起到宣肺化濕、疏通氣道之效，對咳嗽變異性哮喘具有良好治療效果。

TLR4與哮喘的發生有密切關系，有學者研究表明，TLR4上的rs4986791基因突變，增加哮喘發生的風險，而rs1927907基因突變則與哮喘的嚴重程度有關［23］。PM2.5被人體吸入氣道后，激活TLRs通路，誘導哮喘的發作。TLR4能促進胸腺基質淋巴細胞的分泌，從而加重氣道的炎癥反應。NF-κB目前也被認為與哮喘的發生和發展有密切關系，NF-κB位于TLRs下游信號通路，可以被TLR4激活，介導炎癥反應的發生［24］。在觀察4組患者細胞因子的TLR4、NF-κB蛋白表達時發現，宣肺化濕止咳湯組和孟魯司特鈉組TLR4、NF-κB均顯著下降，且宣肺化濕止咳湯組低于孟魯司特鈉組。結果表明，宣肺化濕止咳湯能有效降低TLR4、NF-κB蛋白水平。

綜上所述，宣肺化濕止咳湯可能通過下調肺組織中TLR4水平，從而有效調控咳嗽變異性哮喘的臨床癥狀，改善CVA模型豚鼠的細胞因子水平，減輕氣道重塑。