達格列凈對ApoE^-/-小鼠單核巨噬細胞系統及動脈粥樣硬化的影響

李宵 王丹丹 馬巍 李兵 賈俊棟 王泰然 趙季紅

摘要 目的：研究達格列凈對載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠動脈粥樣硬化（AS）斑塊的影響，探討其抗AS作用的可能機制。方法：16只8周齡雄性ApoE^-/-小鼠高脂飲食喂養8周形成AS模型后，隨機分為對照組和實驗組，每組8只，實驗組予達格列凈干預，對照組予同等劑量的生理鹽水，兩組干預4周后取材。油紅O染色檢測主動脈及主動脈瓣AS斑塊面積比例；流式細胞術分析循環中單核細胞亞群的比例（Ly6G-CD11b＋Ly6C^hi和 Ly6G-CD11b＋Ly6C^lo）；免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡成像檢測斑塊內的巨噬細胞和增殖的巨噬細胞（F4/80和Ki67雙陽性細胞）；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清中總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的水平。結果：實驗組與對照組比較有降低主動脈及主動脈瓣斑塊負荷的作用，降低循環中Ly6C^hi單核細胞比例，降低斑塊內增殖巨噬細胞比例，降低LDL-C水平，且具有升高HDL-C作用。結論：達格列凈可減輕ApoE^-/-小鼠AS負荷的作用，可能與調節單核細胞亞群和血脂代謝相關。

關鍵詞 動脈粥樣硬化；達格列凈；單核細胞亞群；增殖巨噬細胞；血脂；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.03.012

基金項目 邯鄲市科學技術研究與發展計劃項目（No.21422083111）

作者單位 1.邯鄲市中心醫院（河北邯鄲056001），E-mail：lixiao130406@163.com；2.華北醫療健康集團峰峰礦區總醫院；3.武警特色醫學中心/天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室

引用信息 李宵，王丹丹，馬巍，等.達格列凈對ApoE^-/-小鼠單核巨噬細胞系統及動脈粥樣硬化的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜志，2024，22（3）：470-474.

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致心血管疾病的主要病理生理基礎，其發病機制有多種學說，包括脂質浸潤學說、慢性炎癥學說等^［1］，其特征是動脈壁內膜發生明顯的慢性炎癥反應，而單核巨噬細胞系統參與了炎癥反應的過程，在AS的進程中發揮了重要作用^［2］。達格列凈作為鈉-葡萄糖協同轉運體2（sodium glucose co-transporters 2，SGLT2）抑制劑，是用于治療糖尿病相對新的一類抗高血糖藥物。國外一些臨床研究已經證實，達格列凈可以降低糖尿病病人心血管疾病的發生率。有臨床研究也證實，達格列凈能夠通過降低核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白-3的活化，減少白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin 18，IL-18）等炎性因子的產生和釋放，發揮抗AS形成的功效^［3］，而單核巨噬細胞系統的變化參與了炎癥反應會直接影響動脈粥樣硬化的進展^［4］。因此，設想達格列凈是否能通過單核巨噬細胞系統發揮抗炎作用，進而影響動脈粥樣硬化進程。為了驗證該假設，本研究通過給載脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠喂食高脂飼料構建AS模型，并觀察達格列凈對單核巨噬細胞系統及AS的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

油紅O購自Sigma公司，USA；酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒購自北京艾然生物有限公司；流式細胞儀（Cytomics FC 500，Beckman Coulter，USA）；熒光顯微鏡（ECLIPSE 80i，Nikon，Japan）；激光掃描共聚焦顯微鏡（TCS SP8，Leica，Germany）；冰凍切片機（CM7500，Leica，Germany）；抗CD11b-PE、抗Ly6G-PerCP/Cy5.5和抗Ly6C-FITC均購自Biolegend公司，USA；抗F4/80、抗Ki67均購自Abcam公司，USA；FITC標記山羊抗小鼠二抗、TRITC標記山羊抗兔二抗均購自ImmunoReagents公司，USA；Mounting medium with DAPI，購自中杉金橋公司，中國；其余國產試劑均為分析純；高脂飼料及正常飼料購自江蘇省南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 實驗動物

16只8周齡ApoE^-/-小鼠，雄性，體質量22～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為 SCXK（京）2102-0001，實驗前均經 DNA 檢測為純合子。

1.3 動物模型的制備、標本的采集和處理

將小鼠高脂飲食喂養8周形成AS后，隨機分為對照組和實驗組，每組8只。實驗組喂食達格列凈劑量為1 mg/（kg·d），對照組給予同等劑量的生理鹽水。喂養4周后，麻醉并通過摘眼球取血，第1滴血用于檢測單核細胞亞群，剩余血液制備血清檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglycerides，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的水平，留取主動脈及主動脈瓣進行病理染色。本實驗小鼠的飼養、模型制備、標本采集及處理均在天津市心血管重塑與靶器官損傷重點實驗室進行。

1.4 油紅O染色

主動脈和主動脈瓣進行油紅O染色，在光學顯微鏡下觀察主動脈和主動脈瓣的斑塊及斑塊負荷。具體方法參照本實驗室前期研究^［5］，采用圖像分析軟件（Image Pro Plus，IPP）計算主動脈斑塊的面積、主動脈的面積、主動脈瓣斑塊面積和血管橫斷面面積，主動脈斑塊負荷＝主動脈斑塊面積/主動脈面積，主動脈瓣斑塊負荷＝主動脈瓣斑塊面積/血管橫斷面面積。

1.5 流式細胞術檢測循環Ly6G-CD11b＋Ly6C^hi單核細胞亞群比例

參照本實驗室前期建立的方法進行檢測^［5］，具體步驟：取100 μL抗凝全血加入 Ly6G-PerCP/Cy 5.5，Ly6C-FITC，CD11b-PE，cell staining buffer吹打混勻，室溫避光孵育15 min，加入600 μL紅細胞裂解液，上機檢測，FlowJo 7.6.1軟件分析流式細胞術結果。

1.6 免疫熒光染色

參照本實驗室前期建立的方法進行免疫熒光染色^［5］，將冷凍的主動脈瓣切片于室溫解凍，1%的TritonX^-100破膜20 min，山羊血清封閉20 min，加入大鼠抗小鼠單抗F4/80（1∶100）和兔抗小鼠多抗Ki67（1∶300）4 ℃孵育過夜，次日加入山羊抗兔IgG，TRITC 和山羊抗大鼠Ig G，FITC，室溫孵育1 h，含DAPI的防淬滅封片劑封片。巨噬細胞和增殖巨噬細胞密度計算如下，采用圖像分析軟件IPP計算熒光顯微鏡拍攝視野內巨噬細胞和增殖巨噬細胞（F4/80和Ki67雙陽性細胞）個數和斑塊面積，增殖巨噬細胞比例＝增殖巨噬細胞密度/巨噬細胞密度。

1.7 血清血脂水平測定

按照本實驗室前期建立的方法^［5］，取出血清復溫后，按照試劑盒說明書進行實驗操作，ELISA分析TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.8 統計學處理

采用Graph Pad Prism6進行統計學分析，符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x^-±s）表示，組間比較采取獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組油紅O染色結果

主動脈經油紅O染色，紅色即為AS斑塊區域（見圖1），實驗組與對照組比較，主動脈內斑塊負荷量減輕，差異有統計學意義（0.150±0.007與 0.121±0.007，P＝0.010）。主動脈瓣經油紅O染色，紅色即為AS斑塊區域（見圖2）；經統計學分析后提示，實驗組主動脈瓣的斑塊負荷較對照組降低，差異有統計學意義（0.329 9±0.009 0 與 0.270 0±0.012 5，P＝0.001 6）。詳見圖3。

2.2 循環中單核細胞亞群比值結果

循環中單核細胞亞群的設門策略詳見圖4，通過 FlowJo 7.6.1 軟件分析數據，實驗組與對照組比較，循環中Ly6C^hi比例下降，差異有統計學意義（0.3299±0.009 0 與 0.270 0±0.012 5，P＝0.001 6）。詳見圖5。

2.3 主動脈瓣AS斑塊內增殖巨噬細胞比例

主動脈瓣經免疫熒光染色后，通過激光共聚焦觀察，其中藍色為DAPI標記細胞核所激發熒光，綠色為FITC標記F4/80所激發熒光，紅色為TRITC標記Ki67所激發熒光，結果所示DAPI和FITC雙陽性表示巨噬細胞（藍色和綠色共存），DAPI、FITC和TRITC三色標記同時在一個細胞則證明為增殖的巨噬細胞（粉色和綠色共存，見圖6）。實驗組與對照組比較，斑塊內增殖巨噬細胞比例下降，差異有統計學意義（0.3500±0.022 4 與 0.273 8±0.024 6，P＝0.037 9）。詳見圖7。

2.4 小鼠血清中血脂比較

實驗組與對照組比較，血清中TG水平下降，差異有統計學意義［（3.61±0.17）mmol/L與（0.29±0.22）mmol/L，P＝0.021］，HDL-C的水平升高，差異有統計學意義［（2.72±0.16）mmol/L與（3.15±0.13）mmol/L，P＝0.048］，但TC［（24.06±0.99）mmol/L與（23.16±0.95）mmol/L，P＝0.525］及LDL-C［（22.68±0.79）mmol/L與（21.10±1.11）mmol/L，P＝0.262］水平下降，兩組比較差異無統計學意義。詳見圖8。

3 討 論

AS是心血管疾病、外周動脈及腦血管疾病發病的基礎，動脈血管內皮下斑塊的形成導致血管腔明顯狹窄，引起組織缺血缺氧，大部分心肌梗死是由于AS斑塊破裂導致自發血栓形成阻塞血管引起的，這也是全球最常見的死因^［6］。AS的藥物治療非常有限主要是抗血小板聚集、調脂穩斑、降低心肌耗氧量、抑制心室重塑，近年來，有研究發現，達格列凈可以降低大鼠心肌組織中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-6、IL-1β、單核細胞趨化因子-1（MCP-1）的水平，延緩心室重塑進程^［7］；也有研究發現，達格列凈可通過抑制炎性因子 IL-1β、IL-18 的產生和釋放，降低糖尿病ApoE^-/-小鼠主動脈及主動脈瓣區AS斑塊負荷^［3］，2021年《老年人慢性心力衰竭診治中國專家共識（2021）》中推薦SGLT-2抑制劑可有效降低心力衰竭病人死亡率，適用于美國紐約心臟病協會（NYHA） 心功能分級Ⅱ～Ⅳ級射血分數降低的心力衰竭（HFrEF）病人^［8］，達格列凈對心血管保護作用的證據越來越多。

本研究發現，達格列凈可以降低主動脈及主動脈瓣斑塊的負荷，存在抑制AS進程的作用。單核巨噬細胞系統可以影響AS的進程，小鼠循環中單核細胞通過Ly6C的表達量不同可分為Ly6C^hi和Ly6C^lo兩種亞型，發揮不同的功能，健康小鼠的單核細胞中50%～60%為Ly6C^hi亞型，機體發生炎癥反應的狀態下，骨髓和脾臟中單核細胞的生成增加，使Ly6C^hi單核細胞亞型明顯升高，發揮抗炎作用^［9］。通過單核細胞亞群結果的柱狀圖，發現達格列凈可降低Ly6C^hi亞型的比例，抑制炎癥反應。傳統的觀點認為單核細胞通過血液循環到達局部組織分化為巨噬細胞，但是近些年有研究證實了巨噬細胞在局部有增殖的現象，并且增殖巨噬細胞在動脈粥樣硬化斑塊進展過程中發揮了重要作用^［10］，具體機制可能是平滑肌細胞和內皮細胞分泌的巨噬細胞集落刺激因子刺激局部巨噬細胞的自我增殖^［11］。本課題組前期研究通過免疫熒光染色技術證明了斑塊內增殖巨噬細胞的存在^［12］，提示達格列凈存在降低主動脈瓣斑塊內增殖巨噬細胞比例的作用，存在抑制AS的進程。由此分析，達格列凈可能通過調節單核巨噬細胞系統發揮抑制AS進展的作用。

脂質代謝紊亂是AS的主要危險因素，目前文獻報道SGLT2抑制劑對血脂譜的影響尚無定論，但多為改善或中性結局，也有研究表明可升高LDL-C水平，但具體機制目前尚未明確^［13-14］。本研究發現，在達格列凈有降低TG和升高HDL-C水平的作用，說明達格列凈有調節血脂代謝的作用，這也可能是其發揮抗AS作用的潛在機制。

綜上所述，達格列凈可能通過影響單核巨噬細胞系統及血脂代謝發揮抗AS的作用，為AS的治療提供了新的思路，但具體的分子機制仍需進一步探索。

參考文獻：

［1］ PEDRO-BOTET J，CLIMENT E，BENAIGES D.Atherosclerosis and inflammation.New therapeutic approaches［J］.Med Clin，2020，155（6）：256-262.

［2］ LASZLO G，KEATING SAMUEL T，JOOSTEN LEO A B，et al.Monocyte and macrophage immunometabolism in atherosclerosis［J］.Seminars in Immunopathology，2018，40（2）：203-214.

［3］ LENG W L，OUYANG X S，LEI X T，et al.The SGLT-2 inhibitor dapagliflozin has a therapeutic effect on atherosclerosis in diabetic ApoE^-/-mice［J］.Mediators of Inflammation，2016，2016：6305735.

［4］ LIU J X，LI X，JI W J，et al.The dynamics of circulating monocyte subsets and intra-plaque proliferating macrophages during the development of atherosclerosis in ApoE^-/-mice［J］.International Heart Journal，2019，60（3）：746-755.

［5］ 李宵，周欣，姬文婕，等.載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化病變進展過程中循環單核細胞亞群和斑塊內增殖巨噬細胞的動態變化［J］.中國動脈硬化雜志，2015，23（1）：24-28.

［6］ WOLF D，LEY K.Immunity and inflammation in atherosclerosis［J］.Circulation Research，2019，124（2）：315-327.

［7］ LEE T M，CHANG N C，LIN S Z.Dapagliflozin，a selective SGLT2 Inhibitor，attenuated cardiac fibrosis by regulating the macrophage polarization via STAT3 signaling in infarcted rat hearts［J］.Free Radical Biology & Medicine，2017，104：298-310.

［8］ 中華醫學會老年醫學分會心血管疾病學組，《老年慢性心力衰竭診治中國專家共識》編寫組.老年人慢性心力衰竭診治中國專家共識（2021）［J］.中華老年醫學雜志，2021，40（5）：550-561.

［9］ DENNEY L，KOK W L，COLE S L，et al.Activation of invariant NKT cells in early phase of experimental autoimmune encephalomyelitis results in differentiation of Ly6C^hiinflammatory monocyte to M2 macrophages and improved outcome［J］.Journal of Immunology，2012，189（2）：551-557.

［10］ ROBBINS C S，HILGENDORF I，WEBER G F，et al.Local proliferation dominates lesional macrophage accumulation in atherosclerosis［J］.Nature Medicine，2013，19（9）：1166-1172.

［11］ SINHA S K，MIIKEDA A，FOULADIAN Z，et al.Local M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）expression regulates macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis［J］.Arteriosclerosis，Thrombosis，and Vascular Biology，2021，41（1）：220-233.

［12］ LI T，WANG W，LI Y X，et al.Pseudolaric acid B attenuates atherosclerosis progression and inflammation by suppressing PPARγ-mediated NF-κB activation［J］.International Immunopharmacology，2018，59：76-85.

［13］ SA-NGUANMOO P，TANAJAK P，KERDPHOO S，et al.SGLT2-inhibitor and DPP-4 inhibitor improve brain function via attenuating mitochondrial dysfunction，insulin resistance，inflammation，and apoptosis in HFD-induced obese rats［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2017，333：43-50.

［14］ CHA S A，PARK Y M，YUN J S，et al.A comparison of effects of DPP-4 inhibitor and SGLT2 inhibitor on lipid profile in patients with type 2 diabetes［J］.Lipids in Health and Disease，2017，16（1）：58.

（收稿日期：2022-04-12）

（本文編輯 王雅潔）