痰常規培養和RT-PCR對鏈球菌和克雷伯菌肺炎的鑒別價值

曾燕 張金平 劉揚成 張傳圣

【摘要】 目的 探討鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷中痰常規培養和實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time polymerase chain

reaction，RT-PCR）的應用價值。方法 選取2022年6月—2022年12月在會昌縣中西醫結合醫院就診的78例疑似鏈球菌肺炎患者與克雷伯菌肺炎患者作為研究對象，結合臨床癥狀、影像學和培養法檢測結果，確診單一病原體感染肺炎。對患者進行痰常規培養和RT-PCR檢測，比較2種檢測方法的陽性檢出率和診斷價值。結果 RT-PCR檢測在肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，S.pn）、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，Kpn）中的檢出率較痰常規培養更高（P＜0.05）；RT-PCR檢測在S.pn、Kpn診斷中的靈敏度和陰性預測值較痰常規培養更高（P＜0.05）。結論 在鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷過程中，RT-PCR檢測的應用能夠提高陽性診斷率，為后續治療提供依據。

【關鍵詞】 痰常規培養；熒光實時定量聚合酶鏈反應；肺炎鏈球菌；肺炎克雷伯菌

文章編號：1672-1721（2024）04-0106-03? ? ?文獻標志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R563.1

肺炎鏈球菌（S.pn）、肺炎克雷伯菌（Kpn）感染是導致肺炎發生的重要原因之一。前者屬于革蘭陽性球菌，可導致腦膜炎、支氣管炎等疾病的發生。后者屬于革蘭陰性桿菌，正常人群攜帶率約為10%，可導致肺部感染的發生[1]。有資料顯示，發展中國家5歲兒童中，S.pn所導致的肺炎病死率達到500萬人/年。廣譜抗生素是治療肺炎的有效方法，但濫用容易導致耐藥菌的產生，不利于疾病治療，會增加患者病死風險，因此，應在疾病發生早期進行及時明確的診斷[2]。痰常規培養在臨床中的應用較為廣泛。近幾年，隨著分子生物學檢驗實驗室在縣級醫療和疾控機構的普及，RT-PCR檢測方法逐漸得到應用，但臨床對于2種檢測方式在S.pn和Kpn中的應用價值未進行探討。基于此，本研究對78例患者進行研究，旨在探討不同檢測方式對鏈球菌和克雷伯菌肺炎陽性檢出率和診斷價值的影響，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年6月—2022年12月會昌縣中西醫結合醫院收治的78例肺炎患者作為研究對象，其中男性42例、女性36例；年齡2～87歲，平均年齡（42.39±3.27）歲；合并吸煙史者35例。本研究經醫院醫學倫理委員會審批，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標準

納入標準：年齡2～87歲；存在發熱、胸痛、咳嗽、咳痰、呼吸困難或呼吸音異常等癥狀；影像學檢測肺部存在異常；臨床資料完整。

排除標準：病毒性感染肺部疾病者；合并惡性腫瘤者；免疫抑制者；合并其他肺部疾病者。

1.3 方法

1.3.1 標本采集

患者使用質量分數為0.9%的氯化鈉注射液（北京天壇生物制品股份有限公司，國藥準字S10870001）漱口，同時使用質量分數為0.9%的氯化鈉注射液對口腔殘留物質進行沖洗，將深處痰液咳出，置于無菌盒中。若患者無法順利咳出痰液，則使用15 mL 45 ℃質量分數為0.9%的氯化鈉注射液對患者進行霧化或無菌操作以吸痰取樣。取樣后立即將樣本送至實驗室進行檢測。通過顯微鏡觀察標本是否合格，其中鱗狀上皮細胞≤10個/低倍視野、多核白細胞≥25個/低倍視野為合格。樣本不合格則需重新采樣送檢。分取部分痰液進行痰常規培養，另取1 mL標本轉移到環氧己烷滅菌螺口管中進行RT-PCR檢測。若超過24 h不能及時檢測，需置-80 ℃條件下保存。

1.3.2 痰常規培養

按照《全國臨床檢驗操作規程》進行痰常規培養，取痰液膿性部分，分別接種于血平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵械注準20172400071）、伊紅美藍瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵械注準20152400485）、巧克力瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵穗械備20150086號）中，放入培養箱中，培養時間為24 h，溫度36 ℃，CO2含量5%。經革蘭染色（珠海貝索生物技術有限公司，粵珠械備20170095）鏡檢，初步觀察后，用全自動細菌鑒定系統（湖南邁瑞醫療科技有限公司，湘械注準20172220232）、革蘭陰性菌鑒定及藥敏試條（溫州市康泰生物科技有限公司，浙械注準20152400399）、革蘭陽性菌鑒定及藥敏試條（溫州市康泰生物科技有限公司，浙械注準20152400298）對克雷伯菌和鏈球菌進行鑒定。

1.3.3 RT-PCR檢測

吸取4 mL質量分數為4%的氫氧化鈉溶液加入待測樣本螺口管內，充分搖勻，室溫下靜置30 min，后取0.5 mL混合液，置入離心管，加入0.5 mL氫氧化鈉，靜置10 min，設置離心機轉速為13 000 r/min，5 min后加入1 mL質量分數為0.9%的氯化鈉注射液，離心5 min，在沉淀物中加入DNA提取液（天根生化科技有限公司，2022WO117），沸水浴10 min，離心5 min，將其作為反應模板。陰性對照，取3 mL水樣，離心機離心2 min，將DNA提取液加入沉淀物中，沸水浴10min，設置離心機轉速13 000 r/min，5 min后取上層清液。稀釋陽性對照品為標準品。按試劑盒說明（17∶3）配置PCR反應體系，漩渦混勻器上混勻，按每個反應體系為20 μL，分裝到8聯管內，提取樣本、封蓋、離心，利用PCR儀（ABI 7500型擴增儀）進行擴增，擴增試劑為廣州達安生物科技有限公司生產（20220826/20220718），擴增條件為50 ℃×2 min、95 ℃×15 min、94 ℃×15 s、55 ℃×45 s，循環40次。

1.4 觀察指標

整個過程中，主要觀察指標如下。（1）比較2種檢測方法的陽性檢出率；（2）比較2種檢測方式的診斷效能，即對靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值進行對比。

1.5 統計學方法

采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計數資料以百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 痰常規培養和RT-PCR檢測陽性檢出率比較

與痰常規培養相比，RT-PCR在S.pn、Kpn中的陽性檢出率更高（P＜0.05），見表1。

2.2 痰常規培養和RT-PCR檢測診斷價值比較

與痰常規培養相比，RT-PCR檢測在S.pn、Kpn診斷中有著更高的靈敏度和陰性預測值（P＜0.05），見表2。

3 討論

Kpn、S.pn是導致肺炎發生的主要致病菌[3]。Kpn是一種條件致病菌，屬于呼吸道的菌群之一，是臨床中發現最早的可導致肺炎發生的革蘭陰性桿菌。身體虛弱人群尤其住院患者更易感染Kpn。Kpn經呼吸道感染，住院患者使用呼吸器、人工導管或霧化過程中容易發生交叉感染，從而導致肺炎的發生。Kpn可導致嬰幼兒發生肺炎、腸炎、敗血癥等。隨著臨床抗菌藥物的使用，耐藥菌逐漸增多，革蘭陰性桿菌肺炎（gram-negative bacillary pneumonia，GNBP）發生率增加。這也是導致社區獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）和醫院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）發生的重要原因，病死率較高[4]。S.pn在自然界分布廣泛，其中大部分在人體鼻咽部定植，對健康人群無明顯危害，但對于免疫力較低的嬰幼兒及老年人群，極易導致呼吸道感染等疾病的發生，已成為現階段世界范圍內主要致病原之一。隨著光譜抗生素的不當使用甚至濫用，耐藥菌感染越來越普遍，細菌耐藥性逐漸加強，尤其是革蘭陰性菌。在疾病發生早期盡快明確致病菌，合理選用抗生素，臨床對癥治療，對患者康復有著極為重要的意義。

呼吸道標本培養是臨床常見的檢測方式，包括胸腔積液培養、肺泡灌洗液培養、痰常規培養等。取灌洗液或胸腔積液對細菌進行培養是現階段肺炎診斷的“金標準”，對疾病診斷有著確定性的意義，但這種操作方式具有一定創傷性，對醫生操作技術水平要求較高，存在并發癥發生的風險，因此未普遍應用[5]。

痰常規培養是臨床應用較多的病原學檢測方式，通過對下呼吸道分泌物進行培養分析，能夠反映感染情況，為后期用藥提供指導。在臨床研究中發現，痰常規培養存在一定局限性，檢測需要較長時間，在有氧環境下細菌一般在6～8 h開始生長，厭氧菌一般需2～4 d。對于不典型病原體，在肺炎發生早期檢測中不能及時得到準確的結果。檢測結果受藥物使用及標本采集質量影響較大。有研究人員發現，在使用過抗生素患者中，S.pn分離率明顯下降[6]。

PCR又名體外擴增，是一種新型檢測方式，用時較短，結果準確率高，有效彌補了常規培養方式的不足，它在基因表達中的應用更有利于疾病診斷，在多種遺傳疾病、傳染性疾病、下呼吸道感染中的應用效果較好。實時熒光定量PCR與PCR原理相同，是檢測領域的新技術，在保留PCR檢測優勢的同時，解決了檢測過程準確定量和靈敏度的問題，能夠重復進行檢測，并監控檢測過程[7]。

有研究人員對慢性肺部疾病患者痰液進行培養，結果顯示S.pn檢出率較低[8]。本研究中，痰常規培養S.pn、Kpn的陽性檢出率、靈敏度和陰性預測值較低，這與上述研究結果相一致。究其原因，細菌痰培養結果受多種因素影響，標本獲取、培養過程中的相關操作均會影響檢測準確性，以及部分患者存在抗生素使用情況，導致培養結果呈現假陰性。痰液中細菌的分布是不均勻的，在檢測痰液膿性部分時，可能存在標本選取不當或生長不良的情況，降低檢測陽性率。S.pn為苛養菌，痰培養所需時間較長，從樣本送檢到出具報告一般需要2～3 d。患者使用抗生素治療及各種原因導致敏感性下降，不利于快速給予準確的臨床用藥指導。本研究中，RT-PCR檢測中S.pn、Kpn的陽性檢出率、靈敏度和陰性預測值較痰常規培養更高，提示RT-PCR檢測的應用價值較高。究其原因，RT-PCR在S.pn、Kpn檢測中更能體現自身優勢，通過少量呼吸道分泌物便可明確病原菌，更適用于S.pn、Kpn等導致的缺乏特異性癥狀的感染診斷中。RT-PCR檢測中Kpn、S.pn陽性檢出率較高，但仍未完全檢出，原因可能為：采集標本不當，影響檢測準確性；細菌檢測標本不同，國外在進行RT-PCR檢測時多通過防污染毛刷、肺泡灌洗等方式獲取標本，國內多從痰液中獲取標本；細菌DNA未能成功提取；相關致病菌數量過多。

綜上所述，RT-PCR檢測在鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷中的陽性檢出率較高，靈敏度和陰性預測值較痰常規培養更高，診斷價值較好，可推廣使用。

基金項目：贛州市科技計劃項目（20222ZDX7846）

參考文獻

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（編輯：郭曉添）

作者簡介：曾 燕，女，本科，主治醫師。