不同咀嚼壓力對大鼠正畸移動牙壓力側牙槽骨改建的影響

摘要：目的 研究不同咀嚼壓力對大鼠正畸移動牙壓力側牙槽骨改建的影響。方法 選取8周齡雄性SD大鼠45只，按隨機數字表法分為基線組5只、軟食組20只和硬食組20只。基線組大鼠在實驗初始處死、取材。軟食組和硬食組建立上頜右側第一磨牙近中移動模型，左側不加力作為對照。各組喂以相應飲食，分別于加力后第3、5、7、14天各處死5只大鼠，取雙側上頜骨。Micro CT測量加力磨牙近中移動距離及壓力側牙槽骨骨體積/組織體積（BV/TV）、骨小梁分離度（Tb.Sp）和骨小梁厚度（Tb.Th）。抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色計數破骨細胞數量；原位雜交染色觀察細胞核因子-κB受體活化因子配體（RANKL）和骨保護素（OPG）mRNA表達隨時間變化情況。結果 第14天時軟食加力組牙齒移動距離小于硬食加力組（P＜0.05）。軟食加力組與硬食加力組壓力側牙槽骨BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th差異無統計學意義。細胞計數和原位雜交結果顯示，在第5、7天，軟食加力組的破骨細胞數量和RANKL/OPG比值均低于硬食加力組（P＜0.05）。結論 較小的咀嚼壓力會減低大鼠正畸牙壓力側牙槽骨中的破骨活動，減小牙齒移動距離。

關鍵詞：咀嚼；壓力；牙齒移動技術；正畸學；破骨細胞；骨保護素；細胞核因子-κB受體活化因子配體

中圖分類號：R783.5 文獻標志碼：A DOI：10.11958/20230630

Effects of different masticatory pressures on alveolar bone remodeling in the pressure side during orthodontic tooth movement in rats

TIAN Jing1， WANG Zilong2， XIAO Danna1， FAN Xiangfei1

1 Department of Orthodontics， Tianjin Stomatological Hospital， Tianjin 300041， China;"2 School of Medicine， Nankai University

Corresponding Author E-mail： 1259815407@qq.com

Abstract： Objective To study the effect of different masticatory pressures on alveolar bone remodeling in rats with orthodontic moving teeth. Methods Forty-five male SD rats aged 8 weeks were randomly divided into 3 groups： the baseline group （n=5）， the soft diet group （n=20） and the hard diet group （n=20）. Rats in the baseline group were sacrificed at the beginning of the experiment. The experimental rat models of right upper first molar movement were established in the soft diet group and the hard diet group. Left side of the maxillary was used as the control group. Each group was fed with corresponding diet. Five rats were sacrificed in each group on the day 3， day 5， day 7 and day 14 after orthodontic treatment respectively. Micro CT was used to measure the mesial movement distance of molar， bone volume/tissue volume （BV/TV）， trabecular separation （Tb.Sp） and trabecular thickness （Tb.Th） of the alveolar bone on the pressure side. The number of osteoclasts in alveolar bone was counted after TRAP staining. In situ hybridization was used to detect the expression of RANKL and OPG. Results The amount of tooth movement was smaller on day 14 in the soft diet group than that of the hard diet group （P＜0.05）. There were no significant differences in BV/TV， Tb.SP and Tb.Th between the soft diet group and the hard diet group. TRAP staining and in situ hybridization showed that the number of osteoclasts and the RANKL/OPG ratio on day 5 and day 7 were lower in the soft diet group" than those of the hard diet group （P＜0.05）. Conclusion The osteoclast activity in the alveolar bone on the pressure side of the orthodontic tooth is decreased and the tooth movement is inhibited under lower masticatory pressure.

Key words： mastication; pressure; tooth movement techniques; orthodontics; osteoclasts; osteoprotegerin; RANKL

在正畸治療中，矯治力通過牙齒傳遞至牙周膜和牙槽骨，引起牙周組織一系列適應性變化，進而實現牙齒移動。此時牙槽骨內破骨和成骨活動處于高度活躍狀態，多種細胞因子、激素和機械應力均調節破骨細胞主導的骨吸收過程［1］。牙齒移動過程中，牙槽骨在受到矯治力作用的同時還間接受到咀嚼壓力的影響。研究表明咀嚼壓力改變不僅會對顱頜面部骨骼形態［2-4］和咀嚼肌功能運動［5-6］產生影響，也參與到牙槽骨代謝的破骨過程中［7］。以往研究多集中于牙周組織對矯治力的應答［8-9］，對咀嚼壓力在口腔正畸中發揮的作用關注較少。探索咀嚼壓力對正畸移動牙牙周組織中破骨活動和牙槽骨微結構的影響，以利于更科學地為患者提供正畸期間飲食指導，安全有效地縮短矯治時間十分必要。咀嚼壓力是一種多方向、持續時間短且反復加載在牙齒上的力［10］，難以用人為施加的機械力模擬。故本研究在大鼠正畸牙移動模型的基礎上，通過改變食物硬度模擬不同咀嚼壓力［11-12］，以初步探索不同咀嚼壓力和正畸力共同作用下壓力側牙槽骨的改建差異。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 45只8周齡清潔級雄性SD大鼠，體質量（300±20）g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有實驗動物于中國醫學科學院放射醫學研究所（天津）動物中心飼養，室溫20～26 ℃，濕度55%，12 h/12 h明暗循環。本實驗經天津市口腔醫院醫學倫理委員會審核通過（批號PA2020-B-009）。

1.2 試劑與儀器 正畸結扎絲（直徑0.02 mm，長沙市天天齒科器材有限公司）；正畸恒力鎳鈦拉簧（50 g，深圳市速航科技發展有限公司）；光固化流體樹脂（Z350XT，美國3M公司）；全封閉組織脫水機（ASP300）、組織包埋機（EC350-1）、石蠟切片機（RM2135）均購自德國徠卡微系統有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（南京建成科技有限公司）；細胞核因子-κB受體活化因子配體（receptor-activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）、骨保護素（osteoprogerin，OPG）mRNA原位雜交檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；尼康光學顯微鏡（Ni-U型，日本尼康）；Micro CT（Skyscan1276型，比利時Skyscan）。

1.3 分組及模型建立 45只SD大鼠按隨機數字表法分為基線組（5只）、軟食組（20只）和硬食組（20只）。其中硬食組喂以短顆粒狀常規大鼠飼料，軟食組喂以與硬食組成分相同但研磨為粉末狀的大鼠飼料。所有大鼠經3%異氟烷混合氧氣吸入麻醉。基線組大鼠在實驗初始即在麻醉狀態下處死，取雙側上頜骨，記為第0天標本。其余各組分別在大鼠上頜右側第一磨牙和左右上門齒牙冠頸1/3區制備水平淺溝。用結扎絲將鎳鈦拉簧一端進入淺溝固定在上頜右側第一磨牙，另一端進入淺溝固定在上門齒并用流體樹脂粘接加固。上頜的左側不加力作為對照。各組大鼠喂以相應軟、硬質飼料，自由飲水。術后對大鼠加力裝置、進食等一般情況進行觀察。各組分別于加力后第3、5、7、14天處死5只大鼠，取雙側上頜骨。左側上頜骨樣本對應記為軟食對照組和硬食對照組，右側上頜骨樣本對應記為軟食加力組和硬食加力組。所有標本放入4%多聚甲醛中，4 ℃固定24 h待后續處理。

1.4 Micro CT掃描及分析 將各組第14天的上頜骨樣本進行Micro CT掃描，掃描電壓70 kV，電流141 μA，掃描層厚10 μm。在矢狀面上測量右側上頜第一磨牙牙冠遠中面與第二磨牙牙冠近中面間的最短水平距離并作為牙齒移動距離。在上頜第一磨牙根分叉壓力區選擇300 μm′300 μm′400 μm的長方體為感興趣區，三維重建后測量該部位松質骨的骨體積分數即骨體積/組織體積（bone volume/tissue volume，BV/TV）、骨小梁分離度（trabecular separatio，Tb.Sp）和骨小梁厚度（trabecular thicknes，Tb.Th）。

1.5 制作石蠟切片 各組所取上頜骨組織經固定、脫鈣、脫水透明、石蠟包埋后，切片機沿牙齒近、遠中方向切取4 μm厚組織切片。

1.6 TRAP染色 按TRAP染色試劑盒說明書染色，光學顯微鏡下在各組大鼠上頜第一磨牙壓力側牙槽骨隨機抽取3個非重疊視野拍照，計數TRAP染色呈陽性的破骨細胞。

1.7 原位雜交染色 按照RANKL、OPG mRNA原位雜交檢測試劑盒說明書行原位雜交。分別以預雜交液代替雜交液、RNA酶預處理標本作為陰性對照。光學顯微鏡下在第一磨牙牙槽骨壓力區隨機選取3個非重疊視野拍照，使用Image Pro Plus 6.0軟件對圖像進行半定量分析，以積分光密度/面積計算RANKL、OPG平均光密度（mean optical density，MOD），并計算RANKL/OPG比值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 26.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以[[x] ±s

]表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析，破骨細胞數量、RANKL mRNA MOD、OPG mRNA MOD和RANKL/OPG比值多組間比較使用多因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Micro CT測量結果 第14天時軟食加力組牙齒移動距離（mm）小于硬食加力組（0.284[±]0.027 vs. 0.324[±]0.026，n=5，t=2.382，P＜0.05），見圖1。軟食加力組與軟食對照組相比、硬食加力組與硬食對照組相比BV/TV均減小（P＜0.05），Tb.Sp、Tb.Th差異無統計學意義；軟食加力組與硬食加力組間BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th差異無統計學意義，見表1。

2.2 壓力側破骨細胞數量變化 TRAP染色可見軟食對照組與硬食對照組牙周纖維排列整齊、形態舒展；軟食加力組與硬食加力組牙周纖維呈壓縮狀態，破骨細胞多位于壓力側牙槽骨表面，胞漿深染呈酒紅色。各組第7天TRAP染色結果見圖2。軟食對照組與硬食對照組各時間點的破骨細胞數量差異無統計學意義；軟食加力組、硬食加力組破骨細胞數量隨加力時間延長呈先升高再降低趨勢，第7天達到峰值（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的破骨細胞數量在第5、7、14天時均高于各自對照組（P＜0.05）；在第5、7天時，軟食加力組破骨細胞數量少于硬食加力組（P＜0.05），見表2。

2.3 壓力側RANKL和OPG mRNA表達量變化 原位雜交染色顯示，RANKL 和OPG mRNA主要表達于靠近牙槽骨表面的牙周膜內，各組第7天原位雜交染色結果見圖3。軟食對照組與硬食對照組各時間點的RANKL mRNA表達水平差異無統計學意義；軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA 表達水平隨加力時間延長呈先升高再降低趨勢，第7天達到最高（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA 表達水平在第5、7、14天時均高于各自對照組（P＜0.05）；在第5、7天時，軟食加力組RANKL mRNA表達水平低于硬食加力組（P＜0.05），見表3。軟食對照組與硬食對照組各時間點的OPG mRNA表達水平差異無統計學意義；軟食加力組與硬食加力組OPG mRNA表達水平隨加力時間延長呈逐漸升高趨勢；軟食加力組與硬食加力組的OPG mRNA表達水平在第5、7、14天時均高于各自對照組（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組各時間點OPG mRNA表達水平差異無統計學意義，見表4。軟食對照組與硬食對照組各時間點的RANKL/OPG比值差異無統計學意義；軟食加力組與硬食加力組RANKL/OPG比值隨加力時間延長呈先升高再降低趨勢，第7天達到最高（P＜0.05）；軟食加力組與硬食加力組的RANKL/OPG比值在第3、5、7、14天時均高于各自對照組（P＜0.05）；在第5、7天時，軟食加力組的RANKL/OPG比值低于硬食加力組（P＜0.05），見表5。

3 討論

3.1 咀嚼壓力對移動牙壓力側牙周組織中破骨細胞、RANKL和OPG表達的影響 當機械力通過牙周韌帶作用于牙槽骨時，間充質干細胞、骨細胞、成骨細胞和破骨細胞都可以感知機械信號并作出應答，通過相互作用調節破骨細胞的募集、增殖和分化［13-14］。其中RANKL/RANK/OPG信號通路是成骨細胞與破骨細胞相互調控的關鍵環節［15-17］。成骨細胞表達的RANKL與破骨前體細胞表面的RANK結合，能夠誘導破骨細胞增殖分化，促進骨吸收過程。而由基質和成骨細胞譜系分泌的OPG會競爭性地與RANKL結合，抑制破骨細胞活化［18］。RANKL/OPG比值是破骨細胞分化成熟和功能表達的決定因素［19］。

本研究結果顯示，軟食加力組和硬食加力組RANKL/OPG比值均呈先升高后降低的變化趨勢，與以往研究結果類似［20-21］。軟食加力組與硬食加力組的RANKL mRNA表達水平在第5、7、14天時均高于各自對照組，證明矯治力可以上調壓力側牙周組織內RANKL的表達量，誘導破骨細胞分化成熟，引起壓力側牙槽骨吸收［22］；而在加力后期，隨著牙齒移動、矯治力逐漸減小，RANKL/OPG比值降低，活化的破骨細胞數量減少、破骨活動隨之減弱。本研究中，加力14 d內不同的咀嚼壓力并未對正畸過程中RANKL和OPG mRNA表達量和破骨細胞數量的整體變化趨勢造成影響，但在第5、7天時軟食加力組破骨細胞數量、RANKL mRNA表達量及RANKL/OPG比值均低于硬食加力組，提示咀嚼壓力也可以刺激參與骨改建細胞細胞膜上的機械感受器，引發下游RANKL/RANK/OPG信號通路的激活，進而調控牙槽骨改建過程。在牙槽骨代謝活躍時，咀嚼壓力減小會引起牙周組織中RANKL mRNA表達量減少，抑制破骨細胞分化，減慢骨吸收過程。在加力后期，壓力側牙槽骨破骨活動減低，咀嚼壓力對骨改建的影響變小，軟食加力組與硬食加力組間差異不再明顯。本研究中，軟食與硬食加力組牙周組織中OPG mRNA的表達量無明顯差異，分析原因可能是加力組各時間點的RANKL/OPG比值均高于基線水平，壓力側破骨活動占優勢，成骨活動較弱，咀嚼壓力對成骨活動尚未充分表達。

3.2 咀嚼壓力對牙槽骨微結構的影響 牙槽骨是體內代謝最為活躍的骨組織，咀嚼壓力和正畸矯治力都可以引起其微結構的變化。鄒昭琪等［23］選擇23日齡的SD大鼠分組進行軟、硬食喂養，2周后發現軟食組與硬食組相比下頜第一磨牙根分叉區松質骨BV/TV減小、Tb.Sp增高、Tb.Th無明顯差別。Wei等［24］用不銹鋼方絲在8周齡SD大鼠上頜第一磨牙加載垂直向矯治力，14 d后發現磨牙根分叉區松質骨BV/TV減小、Tb.Sp增加、Tb.Th無明顯變化。本研究中第14天時軟食加力組、硬食加力組相比各自對照組的BV/TV減小，Tb.Sp、Tb.Th均無明顯差異，表明正畸加力會造成牙根壓力側松質骨內骨量降低，但骨小梁微結構無明顯變化。而軟食加力組與硬食加力組的BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th均無明顯差異。這可能是破骨細胞及相關因子多集中在壓力側牙槽骨表面的皮質骨，而在松質骨內的分布較少，故軟、硬食加力組間松質骨微結構的差異尚無法在影像學上檢測到。

綜上，本研究初步證實正畸過程中較小咀嚼壓力會減低壓力側牙槽骨中的破骨活動，減小牙齒移動距離，提示在正畸牙齒移動時不宜長期保持硬度過軟的飲食，否則可能降低牙齒移動速率、延長治療時間。但在本研究14 d的加力周期內，不同咀嚼壓力尚未引起牙槽骨微結構變化出現差異，后續可延長觀察時間，保持正畸加力裝置穩固性，更完整地探索正畸矯治力及不同咀嚼壓力共同作用下牙槽骨改建的差異。

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基金項目：天津市衛生健康科技項目（ZC20002）

作者單位：1天津市口腔醫院正畸科（郵編300041）；2南開大學醫學院

作者簡介：田靜（1987），女，主治醫師，主要從事口腔正畸方面研究。E-mail：tianjing0225@163.com

通信作者 E-mail：1259815407@qq.com

（本文編輯 李志蕓）