拷貝數(shù)變異測(cè)序聯(lián)合染色體核型分析對(duì)頸項(xiàng)透明層增厚胎兒的產(chǎn)前診斷價(jià)值分析

【摘要】目的 觀察拷貝數(shù)變異測(cè)序（CNV-seq）聯(lián)合染色體核型分析在頸項(xiàng)透明層（NT）增厚胎兒產(chǎn)前診斷中的價(jià)值，為臨床提供參考。方法 選取2021年10月至2022年10月于海口市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)檢并經(jīng)超聲提示胎兒NT增厚的56例孕婦的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)胎兒NT厚度不同分為2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組（24例）和NT≥3.5 mm組（32例）。分析染色體核型分析結(jié)果和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果，比較不同NT值胎兒的CNV-seq檢測(cè)結(jié)果及染色體核型分析結(jié)果。結(jié)果 56例NT增厚胎兒中，有17例（30.36%）被檢出染色體異常，10例為致病拷貝數(shù)變異（CNVs），1例為疑病CNVs，6例為意義不明CNVs；CNV-seq檢測(cè)對(duì)染色體異常檢出率高于染色體核型分析（Plt;0.05）。NT≥3.5 mm組CNV-seq異常率、非整倍體檢出率均高于2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組（Plt;0.05）。結(jié)論 針對(duì)早期超聲篩查發(fā)現(xiàn)的NT增厚胎兒，染色體分析和CNV-seq聯(lián)合檢測(cè)可明確染色體結(jié)構(gòu)異常情況，為臨床診斷提供更詳細(xì)、準(zhǔn)確的信息，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)胎兒缺陷具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】拷貝數(shù)變異測(cè)序；染色體核型分析；頸項(xiàng)透明層；產(chǎn)前診斷

【中圖分類號(hào)】R72 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.04.0097.03

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.04.032

頸項(xiàng)透明層（NT）厚度即妊娠11～13+6周期間胎兒矢狀面頸椎水平與皮下軟組織間液體聚集的最大厚度。既往研究認(rèn)為，NT厚度增加常提示染色體異常，NT厚度增加將顯著增加先天性橫膈、努南綜合征等先天遺傳性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]。染色體核型異常在NT增厚中發(fā)揮重要作用，染色體核型分析對(duì)NT增厚胎兒的診斷也具有重要作用；但染色體核型分析的時(shí)間較長(zhǎng)、操作繁瑣、分辨率較低，需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，且無法檢出5 Mb以下的染色體缺陷，還存在染色體小段重復(fù)或缺失的遺傳變異，容易造成漏診，臨床應(yīng)用受到限制[2]。基于二代測(cè)序（NGS）技術(shù)的拷貝數(shù)變異測(cè)序（CNV-seq）可檢測(cè)染色體非整倍體和100 kb以上拷貝數(shù)變異（CNVs）導(dǎo)致的疾病，是診斷產(chǎn)前細(xì)胞遺傳學(xué)疾病的重要技術(shù)補(bǔ)充[3]。既往已有報(bào)道將其用于NT增厚胎兒的診斷，推測(cè)CNV-seq可彌補(bǔ)染色體核型分析的不足[4]。為此，本研究對(duì)孕早期接受NT超聲檢查顯示結(jié)果異常的56名孕婦進(jìn)行回顧性分析，探討傳統(tǒng)染色體核型分析和 CNV-seq 在NT增厚胎兒診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年10月至2022年10月56例于海口市婦幼保健院進(jìn)行產(chǎn)檢并經(jīng)超聲提示胎兒NT增厚孕婦的臨床資料進(jìn)行回顧性分析。根據(jù)胎兒NT厚度不同分為2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組（24例）和NT≥3.5 mm組（32例）。2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組孕婦年齡20～43歲，平均年齡（30.89±6.75）歲；孕周16+4周～24+6周，平均孕周（20.68±3.15）周。NT≥3.5 mm組孕婦年齡20～41歲，平均年齡（31.05±6.43）歲；孕周16+5周～24+6周，平均孕周（20.20±3.25）周。兩組孕婦年齡、孕周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)海口市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴妊娠11～13+6周時(shí)超聲提示胎兒NT厚度≥2.4 mm；⑵均行羊膜腔穿刺CNV-seq檢測(cè)；⑶單胎妊娠；⑷孕產(chǎn)婦均有遺傳咨詢，提供羊水標(biāo)本和外周血標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴妊娠期間發(fā)生宮內(nèi)感染者；⑵有家族遺傳病史者；⑶合并肝、腎功能異常者；⑷胚胎發(fā)育停止者；⑸合并凝血功能異常者；⑹有先兆流產(chǎn)現(xiàn)象者；⑺羊水過少者。

1.2 研究方法

1.2.1 羊膜腔穿刺 對(duì)孕16～24周經(jīng)超聲提示胎兒NT增厚的孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺，常規(guī)消毒后，抽取羊水30 mL，其中20 mL羊水用于G顯帶染色體核型分析，10 mL羊水用于CNV-seq檢測(cè)。

1.2.2 染色體核型分析 取20 mL羊水，采用離心機(jī)（長(zhǎng)春博研科學(xué)儀器有限責(zé)任公司，吉長(zhǎng)械備20150081號(hào)，型號(hào)：TD-3A型）以2 500 r/min離心10 min，去除清液，將剩余物質(zhì)混勻，采用二氧化碳培養(yǎng)箱（普和希株式會(huì)社，國(guó)械注進(jìn)20172226618，型號(hào)：MCO-18AC）培養(yǎng)1周，再加入秋水仙素溶液（廣州達(dá)暉生物技術(shù)股份有限公司，粵穗械備20220066號(hào)，規(guī)格：20 μg/mL，20 mL/瓶）繼續(xù)培養(yǎng)，劑量按每毫升培養(yǎng)物4 μL計(jì)算。使用懸浮式細(xì)胞培養(yǎng)的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，收獲和制備樣品。然后，利用微陣列芯片掃描儀（成都博奧晶芯生物科技有限公司，川械注準(zhǔn)20162220077，型號(hào)：LuxScan 10K/B）進(jìn)行掃描和記錄，在自動(dòng)生物顯微鏡（江蘇碩世生物科技股份有限公司，蘇械注準(zhǔn)20182221068，型號(hào)：SS-AMIA 3）下選出20個(gè)分散度較好、長(zhǎng)度中等的中期分裂相，按照國(guó)際人類細(xì)胞遺傳學(xué)命名體系，參照ISCN（2020）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行染色體核型分析[5]。如果發(fā)現(xiàn)嵌合體或核型異常，將擴(kuò)大樣本數(shù)量，直至分裂相位達(dá)到100個(gè)。

1.2.3 CNV-seq檢測(cè) 羊水處理方法同上，羊水基因組DNA提取采用試劑盒（廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司），嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)定，從羊水樣本中經(jīng)磁珠法提取基因組DNA。DNA文庫(kù)構(gòu)建樣本DNA片段化：取200～400 ng的羊水樣本DNA進(jìn)行片段化操作，具體操作流程參照試劑盒NEB Next dsDNA fragmentase Kit說明書，打斷提取基因組DNA為小段核酸。以打斷的基因組DNA為起始模板，進(jìn)行末端修復(fù)，接頭連接加入標(biāo)簽序列，構(gòu)建樣本文庫(kù)，利用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增的方法進(jìn)行富集。PCR擴(kuò)增的DNA文庫(kù)利用磁珠法來提純DNA，從而獲得目的DNA片段文庫(kù)，采用熒光定量?jī)x（Thermofisher，型號(hào)：Qubit4.0）進(jìn)行定量、質(zhì)控。采用基因測(cè)序平臺(tái)（廣州達(dá)瑞生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：DA8600）進(jìn)行測(cè)序。具體操作步驟按照胎兒染色體非整倍性體格檢查檢測(cè)劑盒（采用半導(dǎo)體芯片測(cè)序方法）進(jìn)行。高通量測(cè)序結(jié)果與人類參考基因組Hg19進(jìn)行生物信息學(xué)分析后，由廣州達(dá)瑞生物技術(shù)有限公司的染色體拷貝數(shù)變異分析軟件完成。對(duì)樣本的染色體CNV種類變化及復(fù)制數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，正常情況可見23對(duì)染色體，若見染色體不成對(duì)，即染色體有1條或3條現(xiàn)象，即可確診為非整倍體陽性。

1.2.4 CNVs的評(píng)估 通過檢索國(guó)際基因組拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)庫(kù)（UCSC、DECIPHER、OMIM、Clingen、Clinvar）、正常人基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù)（DGV）及PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)查閱文獻(xiàn)。CNVs臨床意義評(píng)估的判定依據(jù)是《低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)》[6]。將CNVs分為致病CNVs、疑病CNVs、意義不明CNVs、良性 CNVs和可能良性 CNVs 五大類。

1.3 觀察指標(biāo) ⑴分析染色體核型分析結(jié)果和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果。⑵比較不同NT值樣本的CNV-seq及染色體核型分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型結(jié)果和CNV-seq檢測(cè)結(jié)果分析 56例NT增厚胎兒中，染色體異常者17例，占30.36%，其中發(fā)現(xiàn)10例為致病CNVs，1例為疑病CNVs，6例為意義不明的CNVs，見表1。CNV-seq檢測(cè)出11例染色體異常，檢出率64.71%，染色體核型分析檢出5例，檢出率29.41%；CNV-seq檢測(cè)的染色體異常檢出率高于染色體核型分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2值=4.250，P=0.039）。

2.2 不同NT值樣本的CNV-seq及染色體核型分析結(jié)果比較 NT≥3.5 mm組CNV-seq異常率、非整倍體檢出率均高于2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），見表2。

3 討論

出生缺陷又稱先天性畸形，是指嬰兒出生前發(fā)生的身體結(jié)構(gòu)、功能或代謝異常，已逐漸成為重大的公共衛(wèi)生問題之一。明確產(chǎn)前胎兒異常情況，及時(shí)作出產(chǎn)前診斷，能有效降低出生缺陷的發(fā)生率。傳統(tǒng)的產(chǎn)前篩查和診斷技術(shù)包括產(chǎn)前超聲檢查、血清學(xué)篩查及染色體核型分析。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基因檢測(cè)技術(shù)因其準(zhǔn)確率高逐漸應(yīng)用于臨床產(chǎn)前診斷中[7]，本研究分析傳統(tǒng)的染色體核型分析及CNV-seq在NT增厚胎兒診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，CNV-seq檢測(cè)的染色體異常檢出率高于染色體核型分析，這與既往報(bào)道結(jié)果一致[8]。已有研究顯示，CNV-seq能篩選出亞顯微染色體結(jié)構(gòu)異常，如微缺失、微重復(fù)等，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)核型分析分辨率較低的缺陷[9-10]。因此， CNV-seq 在精確檢測(cè)染色體微小片段方面優(yōu)勢(shì)顯著。

本研究結(jié)果還顯示，NT≥3.5 mm組CNV-seq異常率、非整倍體檢出率均高于2.4 mm≤NTlt;3.5 mm組，這表明隨著NT厚度的增加，胎兒染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)也增加，這與既往研究結(jié)果一致[11]。分析原因，傳統(tǒng)染色體核型分析與CNV-seq檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用于產(chǎn)檢中，可以更好地補(bǔ)充和佐證，有助于準(zhǔn)確反映胎兒在遺傳學(xué)層面的實(shí)際情況，提高NT增厚胎兒染色體異常的檢出率[12-13]。

綜上所述，CNV-seq檢測(cè)聯(lián)合染色體核型分析用于NT增厚胎兒的臨床診斷中具有較高的價(jià)值，有助于染色體異常疾病的早期篩查。

參考文獻(xiàn)

劉冬菊，雷桔紅，鐘凱.胎兒頸項(xiàng)透明層增厚與胎兒染色體異常的關(guān)聯(lián)性研究[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2016， 37（16）： 2071-2073.

倪夢(mèng)瑤，李潔，朱湘玉，等.染色體微陣列分析在頸項(xiàng)透明將其應(yīng)用于胎兒的層增厚產(chǎn)檢診斷[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2019， 36（10）： 970-974.

魏淑彥，封紀(jì)珍，賈立云，等.產(chǎn)前診斷中CNV-seq和染色體核型分析應(yīng)用效果[J].中國(guó)計(jì)劃生育學(xué)雜志， 2023， 31（10）： 2482-2487.

胡平，王艷，許爭(zhēng)峰. CNV-Seq是否應(yīng)成為產(chǎn)前診斷常規(guī)[J/CD].中國(guó)產(chǎn)前診斷雜志（電子版）， 2019， 11（2）： 9-11.

左伋.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M]. 6版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 2013： 78-81.

中華醫(yī)學(xué)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分會(huì)臨床遺傳學(xué)組，中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)遺傳醫(yī)師分會(huì)遺傳病產(chǎn)前診斷專業(yè)委員會(huì)，中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)出生缺陷預(yù)防與控制專業(yè)委員會(huì)遺傳病防控學(xué)組.低深度全基因組測(cè)序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志， 2019， 36（4）： 293-296.

謝妙妙.頸項(xiàng)透明層不同厚度與胎兒的預(yù)后及染色體異常、正常分娩率相關(guān)性的研究[J]. 中國(guó)性科學(xué)， 2020， 29（6）： 50-52.

杜柳，謝紅寧，鄭菊，等.頸部透明層增厚胎兒中CMA技術(shù)檢測(cè)拷貝數(shù)變異的分析[J].中華婦產(chǎn)科雜志， 2018， 53（10）： 671-676.

楊黎明，張華，袁路，等.基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序與染色體核型分析在胎兒遺傳學(xué)診斷中的比較[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程， 2021， 29（4）： 1-4.

李囡，張遠(yuǎn)，劉小雪，等.基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序聯(lián)合染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志， 2021， 44（10）： 878-881.

唐新華，王蕾，章錦曼，等.拷貝數(shù)變異測(cè)序與染色體核型分析在產(chǎn)前診斷應(yīng)用中的比較研究[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志， 2021， 29（5）： 596-599.

楊鑫，劉煥玲，李偲琦，等.孕16～18周超聲檢查在核型正常但頸項(xiàng)透明層增厚胎兒中的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志， 2019， 22（1）： 10-14.

高值，張?zhí)飯@，黃偉，等.低深度高通量全基因組拷貝數(shù)變異測(cè)序在487例頸項(xiàng)透明層增厚胎兒染色體分析中的應(yīng)用[J].中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志， 2022， 25（3）： 186-191.