前癃通膠囊介導miR-216a-5p/TPT1/mTORC1通路調控良性前列腺增生的實驗研究

〔摘要〕 目的 通過細胞實驗探討前癃通膠囊（qian long tong capsule， QLTC）能否通過調控miR-216a-5p/腫瘤蛋白翻譯控制1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1，miR-216a-5p/TPT1/mTORC1）信號通路抑制良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia， BPH）。方法 將25只大鼠隨機分為對照組（等體積生理鹽水），QLTC低（56.25 mg/mL）、中（112.50 mg/mL）、高（225.00 mg/mL）劑量組，LBSC組（168.75 mg/mL），每組5只。每組灌胃1 mL/次，2次/d，連續5 d。各組大鼠麻醉后制備含藥血清。根據實驗目的不同，將CP-H022細胞分5步做實驗處理，每部分實驗進行獨立分組。將miR-216a-5p過表達和沉默表達，及TPT1過表達進行對照研究；RT-qPCR法檢測正常和BPH模型CP-H022細胞內miR-216a-5p表達量，并觀察不同濃度QLTC處理的BPH細胞中miR-216a-5p表達量的差異；細胞集落形成實驗檢測細胞增殖能力；CCK-8法檢測BPH模型細胞增殖；RT-qPCR法檢測miR-216a-5p、TPT1 mRNA表達水平；流式細胞術檢測細胞凋亡；生信分析、雙熒光素酶實驗驗證miR-216a-5p與TPT1的靶向關系；過表達TPT1后，Western blot法檢測BPH細胞中TPT1/mTORC1信號通路相關分子表達情況。結果 與對照組1比較，模型組1的CP-H022細胞內miR-216a-5p表達量下調（Plt;0.05）；不同濃度的QLTC均能上調miR-216a-5p表達量（Plt;0.05）；根據本實驗結果，本研究將選用QLTC（高劑量）組CP-H022細胞進行后續實驗。與模型組2比較，QLTC組2細胞增殖減少、凋亡增加（Plt;0.05），B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）表達降低（Plt;0.05），Bcl-2關聯X蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein，Bax）、cleaved Caspase-3表達升高（Plt;0.05）。敲低miR-216a-5p后，與模型組4比較，QLTC組4細胞增殖增強、凋亡減少（Plt;0.05），Bcl-2表達升高（Plt;0.05），Bax、cleaved Caspase-3表達降低（Plt;0.05）。與mimic-NC組比較，miR-216a-5p mimic組TPT1表達量降低（Plt;0.05）；QLTC處理后，細胞TPT1、p-mTORC1表達均降低（Plt;0.05）；過表達TPT1后BPH細胞增殖功能增強（Plt;0.05），凋亡減少（Plt;0.05），Bcl-2表達升高（Plt;0.05），Bax、cleaved Caspase-3表達下降（Plt;0.05）。結論 QLTC可通過介導miR-216a-5p下調TPT1/mTORC1通路，進而抑制BPH。

〔關鍵詞〕 前癃通膠囊；良性前列腺增生；細胞實驗；miR-216a-5p；腫瘤蛋白翻譯控制1；哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1；信號通路

〔中圖分類號〕R277.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.005

Experimental study of Qianlongtong Capsule on mediating miR-216a-5p/TPT1/mTORC1 pathway to regulate benign prostate hyperplasia

HUANG Hongyu1，2， GUO Zishen1，2， ZHU Wenxiong3， YUAN Yifeng3， HE Juqiao3， LIU Tao3，

TAN Meixin1， YANG Jinyu2， CAO Yutan2， ZHANG Xi1*

1. Hunan Brain Hospital （Hunan Second People's Hospital）， Changsha， Hunan 410021， China; 2. School of Integrated Chinese and Western Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. The First

Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Abstract〕 Objective To investigate whether Qianlongtong Capsule （QLTC） can inhibit benign prostatic hyperplasia （BPH） by regulating the signaling pathway of miR-216a-5p/tumor protein translationally controlled 1/mammalian target of rapamycin complex 1 （miR-216a-5p/TPT1/mTORC1） through cell experiments. Methods A total of 25 rats were randomized into control （equal volume of normal saline）， low-（56.25 mg/mL）， medium-（112.50 mg/mL）， and high-dose （225.00 mg/mL） QLTC， and LBSC groups （168.75 mg/mL）， with five rats in each group. The rats in each group were given corresponding drug 1 mL by gavage， twice a day， for continual five days. Drug-containing serum was prepared from rats in each group after anesthesia. According to different experimental purposes， CP-H022 cells were treated experimentally by five steps， and each part of the experiment was grouped independently. The comparative study on overexpression and silencing expression of miR-216a-5p， and TPT1 overexpression was performed; RT-qPCR was used to determine the expression levels of miR-216a-5p in normal and BPH model CP-H022 cells， and observe the differences of miR-216a-5p expression levels in BPH cells treated with different concentrations of QLTC; cell colony formation assay was used to examine cell proliferation; CCK-8 was used to test the proliferation of BPH model cells; RT-qPCR was used to determine the expression levels of miR-216a-5p and TPT1mRNA; cell apoptosis was checked by flow cytometry; bioinformatics analysis and dual luciferase assay were used to verify the targeting relationship between miR-216a-5p and TPT1; after overexpression of TPT1， Western blot was used to examine the expression of TPT1/mTORC1 signaling pathway related molecules in BPH cells. Results Compared with the control group， the expression level of miR-216a-5p in CP-H022 cells in the model group 1 downregulated （Plt;0.05）; different concentrations of QLTC can upregulate the expression of miR-216a-5p; based on the results of this experiment， QLTC （high-dose） group CP-H022 cells will be selected for subsequent experiments in this study. Compared with the model group 2， cell proliferation decreased and apoptosis increased in QLTC group 2 （Plt;0.05）， Bcl-2 expression decreased （Plt;0.05）， and expressions of Bax and cleaved Caspase-3 increased （Plt;0.05）; compared with the model group 4，after knocking down miR-216a-5p， the QLTC group 4 showed higher cell proliferation and lower apoptosis （Plt;0.05）， increased expression of Bcl-2 （Plt;0.05）， and decreased expressions of Bax and cleaved Caspase-3 （Plt;0.05）. Compared with the mimic-NC group， the expression of TPT1 of miR-216a-5p mimic group decreased （Plt;0.05）; after QLTC treatment， the expressions of TPT1 and p-mTORC1 in cells decreased （Plt;0.05）; after overexpression of TPT1， the proliferation function of BPH cells was higher （Plt;0.05）， apoptosis was lower （Plt;0.05）， Bcl-2 expression increased （Plt;0.05）， and expressions of Bax and Cleaved Caspase-3 decreased （Plt;0.05）. Conclusion QLTC can inhibit benign prostatic hyperplasia by mediating miR-216a-5p to downregulate TPT1 / mTORC1 pathway.

〔Keywords〕 Qianlongtong Capsule; benign prostatic hyperplasia; cell experiment; miR-216a-5p; tumor protein translationally controlled 1; mammalian target of rapamycin complex 1; signaling pathway

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性最常見的泌尿系統疾病之一，其特征是前列腺非惡性腫大導致的尿液儲存和膀胱排空障礙[1]。目前，治療手段主要包括手術療法和藥物療法（如α受體阻斷劑、5α-還原酶抑制劑等），但常伴隨一系列不良反應[2]。近年來有研究表明，中藥復方有助于BPH患者自身免疫功能的提高和機體修復[3]。因此，中醫藥已成為治療BPH的重要方法之一。前癃通膠囊（qian long tong capsule，QLTC）由黃芪、丹參、三七、穿山甲、牛痘精液、蒲公英等組成，是賀菊喬教授廣研中醫文獻并根據多年臨床經驗研制的治療BPH的中藥復方[4]。前期研究證實，QLTC能明顯改善BPH國際前列腺癥狀評分、尿流率和殘余尿量，縮小增生的前列腺體積，其治療BPH臨床療效顯著[5-6]。由于BPH是由于前列腺過渡區（prostate transition zone，PTZ）和尿道周圍區域的上皮和肌纖維組織不受調節地增生生長所致[7]，故控制前列腺纖維細胞過度增殖是治療BPH的關鍵。目前研究發現，miR-216a-5p與前列腺成纖維細胞的增殖相關[8]，但miR-216a-5p在BPH中的調節作用及病理生理過程中涉及的具體分子通路還有待深入研究。亦有研究指出，在胰腺癌治療中，miR-216a-5p可靶向調控腫瘤蛋白翻譯控制1（tumor protein translationally controlled 1，TPT1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）信號，可有效抑制腫瘤發生[9]。然而，在BPH治療相關研究中，TPT1是否受miR-216a-5p調控以及TPT1是否參與miR-216a-5p介導的協同作用目前尚未有研究討論。本文從QLTC介導miR-216a-5p調控前列腺成纖維細胞增殖和凋亡的分子機制展開研究，擬進一步確認QLTC能否介導miR-216a-5p靶向TPT1/mTORC1信號通路對BPH進行有效治療，以期為臨床應用QLTC延緩BPH提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1" 動物和細胞

25只SD雄性大鼠，6周齡，體質量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號SCXK（湘）2019-0004]，在湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心飼養（溫度25 ℃，濕度50%）。倫理編號：2020（K）034。飼養籠具、墊料、飲水的制備與消毒均符合SPF級實驗動物飼養要求。人前列腺成纖維細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：CP-H022）。

1.2" 主要藥物和試劑

QLTC（湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，規格：0.5 g×40粒/瓶，批號：090223）；癃閉舒膠囊（long bi shu capsule，LBSC）（石家莊科迪藥業有限公司，國藥準字Z20050356，0.3 g/片，批號：171004）；Trizol試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，批號：15596026）；miRNA逆轉錄試劑盒、mRNA逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀生物科技有限公司，批號：CW2141、CW2569）；B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2關聯X蛋白單克隆抗體（monoclonal antibody to Bcl-2 associated X protein，Bax）、TPT1抗體、辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗兔IgG、293T細胞、oe-TPT1（長沙艾碧維生物科技有限公司，批號：AWA43352、AWA47651、AWA43641、AWS0002、HG-NC002、HG-HO003295）；cleaved Caspase-3抗體（美國CST生物公司，批號：#9661）；mTORC1抗體、磷酸化mTORC1抗體（p-mTORC1）（美國Abcam公司，批號：ab134903、ab109268）；HRP標記的二抗山羊抗兔IgG抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：SA00001-2）；APC凋亡試劑盒（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號：KGA1007）；miR-216a-5p mimcs及inhibitor、野生型人TPT1基因雙熒光素酶報告質粒（psiCHECK-2-TPT1）、突變型人TPT1基因雙螢光素酶報告質粒（psi?

CHECK-2-TPT1-MUT）（上海皓元生物醫藥科技有限公司，批號：HY-R00451、HY-R00385、HY-R00451）；雙螢光素酶檢測試劑盒（普洛麥格生物技術有限公司，批號：E1910）。

1.3" 主要儀器

化學發光成像系統（勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；電泳儀（中國北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-2C）；酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：800TS）；熒光定量PCR儀、熒光PCR板（美國賽默飛世爾科技公司，型號：PIKOREAL96、SPL0960）；流式細胞儀（貝克曼庫爾特生物科技有限公司，型號：A00-1-1102）；顯微鏡（北京中顯恒業儀器儀表有限公司，型號：DSZ2000X）。

1.4" 含藥血清制備

將25只大鼠隨機分為對照組，QLTC低、中、高劑量組，LBSC組，每組5只。根據團隊前期研究，QLTC低、中、高劑量組大鼠給予相應濃度的QLTC藥液（取QLTC中藥粉溶入蒸餾水中；QLTC低、中、高劑量組濃度分別為56.25、112.50、225.00 mg/mL）；LBSC組大鼠給予LBSC藥液（取LBSC中藥粉溶入蒸餾水中，配制成168.75 mg/mL藥液）；對照組大鼠給予等體積生理鹽水進行灌胃[10]。每組灌胃1 mL/次，2次/d，連續5 d。末次灌胃后1 h，用戊巴比妥鈉將各組大鼠麻醉，從后腹主動脈及心室采血，無菌分離血清，滅活除菌后分裝入小瓶，保存于-80 ℃冰箱。

1.5" 細胞培養與分組處理

CP-H022細胞使用含10% FBS和1% P/S的MEM培養基培養。細胞均于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。為了模擬體內雄激素誘導的BPH，均用10 nm DHT處理接種的CP-H022細胞72 h[11]。根據實驗目的不同，分4步做實驗處理，每部分實驗進行獨立分組。

第一部分實驗中，將CP-H022細胞隨機分為6組。對照組1：CP-H022細胞+10%對照組大鼠血清；模型組1：CP-H022細胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC（低劑量）組：CP-H022細胞+10%QLTC低劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC（中劑量）組：CP-H022細胞+10%QLTC中劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC（高劑量）組：CP-H022細胞+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；LBSC組：CP-H022細胞+10%LBSC組大鼠血清含藥血清+10 nm DHT。

第二部分實驗中，將CP-H022細胞隨機分為4組。模型組2：CP-H022細胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC組2：CP-H022細胞+10% QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+inhibitor-NC組：CP-H022細胞（轉染inhibitor-NC）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+miR-216a-5p inhibitor組：CP-H022細胞（轉染miR-216a-5p inhibitor）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT。

第三部分實驗中，將CP-H022細胞隨機分為4組。inhibitor-NC組：CP-H022細胞（轉染inhibitor-NC）+10 nm DHT；miR-216a-5p inhibitor組：CP-H022細胞（轉染miR-216a-5p inhibitor）+10 nm DHT；mimic-NC組：CP-H022細胞（轉染mimic-NC）+10 nm DHT；miR-216a-5p mimic組：CP-H022細胞（轉染miR-216a-5p mimic）+10 nm DHT。

第四部分實驗中，將CP-H022細胞隨機分為4組。模型組4：CP-H022細胞+10%對照組大鼠血清+10 nm DHT；QLTC組4：CP-H022細胞+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+oe-NC組：CP-H022細胞（轉染oe-NC）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT；QLTC+oe-TPT1組：CP-H022細胞（轉染oe-TPT1）+10%QLTC高劑量組大鼠含藥血清+10 nm DHT。

1.6" 細胞轉染

CP-H022細胞在體外用MEM培養基（含10% FBS和1% P/S）培養在37 ℃、5% CO2的培養箱中。將轉染所需質粒和轉染試劑Lip2 000加入無血清MEM培養基中配置轉染液，混勻。CP-H022細胞與轉染混合液37 ℃下孵育6 h后，更換完全培養基進行培養。

1.7" RT-qPCR法檢測各組細胞中miR-216a-5p、TPT1 mRNA的表達水平

收集細胞樣本，使用Trizol試劑盒提取各組細胞總RNA，RNA的濃度和純度通過帶紫外波長濾光片的酶標儀測定。參照miRNA逆轉錄試劑盒，mRNA逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。使用SYBR Green RTPCR試劑盒擴增DNA片段，重復3次。以相對定量2-Ct法分析細胞中miR-216a-5p、TPT1 mRNA的表達量。所有基因均來源于人類。TPT1內參為β-actin，miR-216a-5p內參為U6。引物序列詳見表1。

1.8" 細胞集落形成實驗

CP-H022細胞按照每孔200個的密度種植在6孔板內，每3天更換一次培養基。當菌落明顯形成時，終止培養。用4%多聚甲醛固定細胞，待菌落被結晶紫染色，對細胞菌落進行拍照和計數。

1.9" CCK-8實驗

胰酶消化后，根據5×104個細胞/孔的密度將CP-H022細胞接種于12孔板內，培養24 h。按照50 μL/孔的濃度，用完全培養基配制CCK-8溶液，每孔CP-H022細胞加入500 μL含有CCK-8的培養基。CP-H022細胞在37 ℃、5% CO2條件下繼續孵育2 h后轉移到96孔板，并于多功能酶標儀450 nm測量吸光度。每組設置3復孔，取均值做柱狀圖。

1.10" 流式細胞術檢測細胞凋亡

CP-H022細胞被胰酶（無EDTA）消化后，收集細胞懸液，1 000 r/min離心5 min（離心半徑 9 cm）。洗滌細胞沉淀后，500 μL的Binding buffer被加入離心管中懸浮細胞。使用APC細胞凋亡檢測試劑盒對CP-H022細胞進行染色，避光孵育10 min。CP-H022細胞的凋亡情況使用流式細胞儀觀察并記錄。

1.11" 雙螢光素酶實驗

采用TargetScan數據庫（http：//www.Targetscan. org/）預測miR-216a-5p與TPT1的結合位點。分別構建miR-216-5p inhibitor和miR-216a-5p mimic質粒，將CP-H022細胞培養于MEM培養基中。將psiCHECK-2-TPT1、psiCHECK-2-TPT1-MUT進行轉染級質粒大提。為檢測miR-216a-5p與TPT1的結合位點，將CP-H022細胞隨機分為以下4組。TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p NC組：CP-H022細胞共轉染psiCHECK-2-TPT1大提質粒+hsa-miR-216a-5p NC（終濃度50 nm）的293T細胞；TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p mimic組：CP-H022細胞共轉染psiCHECK-2-TPT1大提質粒+hsa-miR-216a-5p mimics（終濃度50 nm）的293T細胞；TPT1-MUT+hsa-miR-216a-5p NC組：CP-H022細胞共轉染psiCHECK-2-TPT1-MUT大提質粒+hsa-miR-216a-5p NC（終濃度50 nm）的293T細胞；TPT1-MUT+hsa-miR-216a-5p mimic組：CP-H022細胞共轉染psiCHECK-2-TPT1-MUT大提質粒+hsa-miR-216a-5p mimics（終濃度50 nm）的293T細胞。細胞共轉染和培養48 h后收集細胞沉淀，采用雙螢光素酶活性檢測試劑盒根據說明書檢測細胞螢光素酶活性并計算海腎螢光素酶與螢火蟲螢光素酶的比值。

1.12" Western blot檢測TPT1和mTORC1蛋白表達情況

RIPA緩沖液提取細胞蛋白裂解物。BCA法檢測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳于室溫封閉1.5 h，將分離的蛋白轉移到PVDF膜。洗膜3次后加Bcl-2（1∶3 000）、Bax（1∶3 000）、cleaved Caspase-3（1∶3 000）、TPT1（1∶3 000）、p-mTORC1（1∶3 000）、mTORC1（1∶3 000）和β-actin（1∶1 000）抗體稀釋液于4 ℃孵育過夜；洗膜3次后加二抗HRP山羊抗兔IgG（1∶6 000），室溫孵育1.5 h后添加ECL顯影液顯影。結果運用Quantity One軟件進行分析。

1.13" 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行分析，符合正態分布的數據以“x±s”表示。兩組之間比較采用非配對t檢驗；3組及以上數據比較采用one-way ANOVA，Tukey's進行事后檢驗。Plt;0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1" BPH細胞中miR-216a-5p相對表達情況

與對照組1比較，模型組1，QLTC（低、中、高劑量）組，LBSC組miR-216a-5p的相對表達量均下調（Plt;0.05）；與模型組1比較，QLTC（低、中、高劑量）組和LBSC組miR-216a-5p的相對表達量均上調（Plt;0.05）；與QLTC（低劑量）組比較，QLTC（中、高劑量）組和LBSC組中miR-216a-5p相對表達量均上調（Plt;0.05）；與QLTC（中劑量）組比較，QLTC（高劑量）組和LBSC組中miR-216a-5p的相對表達量均上調（Plt;0.05）；與QLTC（高劑量）組比較，LBSC組miR-216a-5p的相對表達量下調（Plt;0.05）。根據本實驗結果，本研究將選用QLTC（高劑量）組CP-H022細胞進行后續實驗。詳見圖1。

2.2" QLTC 干預后BPH細胞中miR-216a-5p表達情況及細胞增殖情況

與模型組2比較，QLTC組2、QLTC+inhibitor-NC組的miR-216a-5p相對表達量上調，集落形成數減少，在24 h、48 h、72 h時細胞增殖能力均減弱，CP-H022細胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白相對表達降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達升高（Plt;0.05）；與QLTC組2、QLTC+inhibitor-NC組比較，QLTC+miR-216a-5p inhibitor組miR-216a-5p相對表達量下降，集落形成數增多，在24 h、48 h、72 h時細胞增殖能力均增強，CP-H022細胞凋亡率減少，Bcl-2蛋白相對表達升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達降低（Plt;0.05）。詳見圖2。

2.3" BPH細胞中TPT1與miR-216a-5p的靶向關系情況

生信分析檢測，發現miR-216a-5p與TPT1存在堿基互作，詳見圖3A。與TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p NC組比較，TPT1-WT+hsa-miR-216a-5p組海腎螢光素酶/螢火蟲螢光素酶比值降低（Plt;0.05），詳見圖3B。與inhibitor-NC組比較，miR-216a-5p inhibitor組TPT1的mRNA表達和蛋白相對表達水平增加（Plt;0.05），miR-216a-5p mimic組TPT1的mRNA表達和蛋白相對表達水平降低（Plt;0.05）；與miR-216a-5p inhibitor組比較，miR-216a-5p mimic組、mimic-NC組TPT1的mRNA表達和蛋白相對表達水平降低（Plt;0.05）；與mimic-NC組比較，miR-216a-5p mimic組TPT1的mRNA表達和蛋白相對表達水平降低（Plt;0.05）。詳見圖3C、D。

2.4" QLTC介導miR-216a-5p/TPT1/mTORC1信號通路對BPH細胞增殖和凋亡的影響

與模型組4比較，QLTC組4和QLTC+oe-NC組的TPT1、p-mTORC1/mTORC1蛋白相對表達降低，集落形成數減少，在48 h、72 h時細胞增殖減弱，BPH細胞凋亡率增加，Bcl-2蛋白相對表達降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達升高（Plt;0.05）；與QLTC組4、QLTC+oe-NC組比較，QLTC+oe-TPT1組TPT1、p-mTORC1/mTORC1蛋白相對表達均升高，集落形成數增多，在48 h、72 h時細胞增殖能力增強，BPH細胞凋亡率減少，Bcl-2蛋白相對表達升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達下降（Plt;0.05）。詳見圖4。

3 討論

BPH是中老年男性泌尿系統中最常見的疾病之一，在50～65歲的男性中發病率高達15%～25%[12-13]。BPH典型表現是小腹脹痛、排尿困難和夜尿頻多，使得中老年男性生活質量嚴重下降。前列腺切除治療和藥物治療等聯合療法在BPH的臨床應用中日趨成熟，但其不良反應仍未得到有效改善，且機體容易出現耐藥現象[14-15]。BPH病理表現為前列腺體積增大，屬于中醫學“癥瘕”范疇，且中醫藥治療BPH有獨特優勢[16-17]。中醫學認為，BPH病因病機是腎氣衰憊、氣化失司、氣血運行不暢、瘀滯日久，其基本病機是氣虛血瘀。有研究表明，QLTC對BPH有良好的治療效果，QLTC方中重用黃芪為君藥，味甘性溫，歸肺、脾經，益氣利水，培補后天；丹參、三七、水蛭、穿山甲活血化瘀、軟堅散結為之臣；王不留行具有利尿、活血化瘀之效，為佐使藥，以輔助君臣藥益氣利水、活血散瘀之效。諸藥合用，共奏益氣利水、活血散結之功[4]。

有研究前期通過體外細胞實驗證實，QLTC含藥血漿可抑制前列腺間質細胞增殖，促進前列腺間質細胞凋亡[18]。進一步研究發現，QLTC含藥血漿可通過抑制前列腺間質細胞Fibronectin與CollagenⅣ基因表達[19]，從而抑制基質細胞增生。動物實驗研究表明，QLTC能顯著改善BPH大鼠前列腺上皮組織增生，降低間質面積，縮小前列腺體積，降低前列腺濕重、體積及指數[20]。有研究表明，QLTC在BPH的治療中能產生良好作用[21-22]，但具體機制不明，而本研究表明，QLTC能夠上調miR-216a-5p，導致TPT1/mTORC信號通路的下調，從而延緩BPH發展。研究發現，miR-216a-5p與前列腺癌細胞的分裂失控有關[8]。作為miRNA家族成員之一，miR-216a-5p在細胞的生長周期調控過程中發揮關鍵作用[23]。miR-216a-5p在體外和體內均能有效抑制腫瘤增殖和轉移[24]。本研究結果顯示，BPH細胞中miR-216a-5p表達量降低，并且QLTC對miR-216a-5p的表達上調作用隨劑量增多而增強。本研究的實驗均圍繞QLTC和miR-216a-5p對BPH細胞增殖功能的具體作用展開，本研究結果證實，QLTC介導miR-216a-5p上調可抑制BPH細胞增生，并促進BPH細胞凋亡。TPT1基因是抑癌基因P53和癌癥干細胞的關鍵調節因子[25]。mTORC1在維持TPT1的高蛋白水平方面起關鍵作用[26]。抑制TPT1可通過mTORC1依賴性途徑（進一步使mTOR上的Ser371殘基去磷酸化）和mTORC1非依賴性途徑（抑制Bcl-2）增強雷帕霉素誘導的自噬[27]。已有研究表明，miRNAs轉錄后能夠下調目的基因的表達，從而在腫瘤的惡性過程中發揮作用[28]。在神經膠質瘤細胞中，TPT1可以與miR-770-5p競爭性結合，從而影響腫瘤進程[29]。同時有研究證實，miR-216a-5p通過靶向TPT1/mTORC1抑制胰腺癌的腫瘤發生[9]。TPT1在惡性前列腺增生中過表達[30-31]。前文實驗已經證實，miR-216a-5p在BPH中呈現低表達現象，故推測在BPH中miR-216a-5p和TPT1/mTORC1之間存在類似胰腺癌中的調控通路。生物信息學分析和螢光素酶報告系統提示，TPT1是miR-216a-5p的重要結合靶點。

本研究結果進一步證實，miR-216a-5p在BPH中下調TPT1的表達。TPT1/mTORC1通路在癌癥中的高度活躍與癌癥預后不良相關[32]。過表達TPT1后，BPH細胞集落形成增多，增殖能力增強，凋亡減少的同時mTORC1磷酸化增加。這一系列結果表明，TPT1/mTORC1促進BPH發展。結合前文實驗結果，QLTC通過介導miR-216a-5p上調抑制TPT1/mTORC1信號通路，從而抑制BPH的發展。但本研究僅在體外進行實驗，對QLTC介導miR-216a-5p的針對性治療以及對BPH的臨床效果尚未可知，有待進一步深入研究。

綜上所述，QLTC抑制BPH病程可能與QLTC介導miR-216a-5p下調TPT1/mTORC1信號通路相關。本研究結果在一定程度上揭示了，QLTC對BPH抑制作用的分子機制，表明QLTC可能是一種極具潛力的治療BPH的中成藥，而miR-216a-5p/TPT1/mTORC1也有望成為BPH分子靶向療法的新靶標。

參考文獻

[1] MIERNIK A， GRATZKE C. Current treatment for benign prostatic hyperplasia[J]. Deutsches Arzteblatt International， 2020， 117（49）： 843-854.

[2] PLOCHOCKI A， KING B. Medical treatment of benign prostatic hyperplasia[J]. The Urologic Clinics of North America， 2022， 49（2）： 231-238.

[3] 程" 巍. 黃莪膠囊聯合西藥治療良性前列腺增生癥臨床研究[J]. 新中醫， 2023， 55（18）： 66-70.

[4] 陳其華. 前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥臨床觀察及其對間質細胞作用的實驗研究[D]. 長沙， 湖南中醫藥大學， 2011.

[5] 楊" 晶， 賀哲淳， 袁軼峰， 等. 前癃通膠囊治療良性前列腺增生癥120例[J]. 中國民間療法， 2015， 23（1）： 41-43.

[6] 賀哲淳， 楊" 晶， 賀菊喬， 等. 前癃通膠囊對良性前列腺增生癥前列腺體積影響的臨床觀察[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2014， 34（11）： 40-42.

[7] DEVLIN C M， SIMMS M S， MAITLAND N J. Benign prostatic hyperplasia-what do we know？[J]. BJU International， 2021， 127（4）： 389-399.

[8] YANG B， GAO G， WANG Z X， et al. Long non-coding RNA HOTTIP promotes prostate cancer cells proliferation and migration by sponging miR-216a-5p[J]. Bioscience Reports， 2018， 38（5）： BSR20180566.

[9] ZHANG J， GAO S H， ZHANG Y D， et al. MiR-216a-5p inhibits tumorigenesis in Pancreatic Cancer by targeting TPT1/mTORC1 and is mediated by LINC01133[J]. International Journal of Biological Sciences， 2020， 16（14）： 2612-2627.

[10] 朱文雄， 袁軼峰， 陳立蔓， 等. 前癃通膠囊對前列腺增生大鼠前列腺組織TFF2、Wnt4、Wnt6的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報， 2022， 42（5）： 743-747.

[11] JIN B R， LIM C Y， KIM H J， et al. Antioxidant mitoquinone suppresses benign prostatic hyperplasia by regulating the AR-NLRP3 pathway[J]. Redox Biology， 2023， 65： 102816.

[12] 楊國榮， 呂" 超， 呂凱凱， 等. 單中心10年2050例良性前列腺增生手術圍手術期數據分析[J/OL]. 解放軍醫學雜志， 1-10[2024-02-22].

[13] 逄璦博， 呂俊剛， 凌存保， 等. 探討體質量指數和血脂指標對良性前列腺增生前列腺體積的影響[J/OL]. 現代泌尿外科雜志， 1-5[2024-02-22].

[14] JOSEPH D B， HENRY G H， MALEWSKA A， et al. 5-Alpha reductase inhibitors induce a prostate luminal to club cell transition in human benign prostatic hyperplasia[J]. The Journal of Pathology， 2022， 256（4）： 427-441.

[15] 赫艷梅， 盛" 濤， 邵" 歡， 等. 益腎通癃方聯合經尿道等離子電切術對腎氣虛型良性前列腺增生癥患者PSA、PGE2、IL-6及尿動力學的影響[J]. 浙江中醫雜志， 2023， 58（11）： 800-802.

[16] 羅郭峰， 遲振海， 毛強健， 等. 近5年中西醫治療良性前列腺增生研究進展[J]. 中國民間療法， 2023， 31（4）： 106-110.

[17] 韓" 濤， 趙逢騰. 前列腺增生患者行中藥八正散治療的臨床效果研究[J]. 中國實用醫藥， 2023， 18（13）： 134-136.

[18] 凌" 智， 劉" 慧， 楊" 晶， 等. 前癃通膠囊含藥血漿對前列腺間質細胞Smad4基因表達的影響[J]. 中華男科學雜志， 2014， 20（8）： 730-733.

[19] 陳其華， 劉" 慧， 凌" 智， 等. 前癃通對前列腺間質細胞Fibronectin和CollagenⅣ基因表達的影響[J]. 中醫學報， 2015， 30（5）： 719-721.

[20] 袁軼峰， 李" 毅， 朱文雄， 等. 前癃通膠囊對良性前列腺增生模型大鼠前列腺組織病理形態學的影響[J]. 中醫雜志， 2018， 59（19）： 1685-1688.

[21] 張" 熙， 賀菊喬， 袁軼峰， 等. 前癃通治療前列腺增生前后血清IL-6、IL-23、CD8、CD20表達變化分析[C].//中國轉化醫學和整合醫學研究會， 中華高血壓雜志社. 中國轉化醫學和整合醫學研討會（廣州館）論文綜合刊. 長沙： 湖南中醫藥大學， 2015.

[22] YUAN Y F， YANG J， ZHU W X， et al. Qianlongtong inhibits proliferation and induces apoptosis of hyperplastic prostate cells[J]. American Journal of Men's Health， 2018， 12（5）： 1548-1553.

[23] LI H， LI T， FAN J， et al. MiR-216a rescues dexamethasone suppression of osteogenesis， promotes osteoblast differentiation and enhances bone formation， by regulating c-Cbl-mediated PI3K/AKT pathway[J]. Cell Death and Differentiation， 2015， 22（12）： 1935-1945.

[24] PATRA S， PRADHAN B， NAYAK R， et al. Apoptosis and autophagy modulating dietary phytochemicals in cancer therapeutics： Current evidences and future perspectives[J]. Phytotherapy Research， 2021， 35（8）： 4194-4214.

[25] WEI W， HUANG X H， SHEN X W， et al. Overexpression of IncRNA TPT1-AS1 suppresses hepatocellular carcinoma cell proliferation by downregulating CDK2[J]. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression， 2022， 32（1）： 1-9.

[26] 張" 飛. 翻譯控制腫瘤蛋白（TCTP）增加Pim-3蛋白穩定性促進胰腺癌形成的實驗研究[D]. 上海： 復旦大學， 2013.

[27] GOUVEIA ROQUE C， HOLT C E. Growth cone tctp is dynamically regulated by guidance cues[J]. Frontiers in Molecular Neuroscience， 2018， 11： 399.

[28] 周超瑞， 馬偉斌， 葉孝乾， 等. 基于小鼠黑色素瘤肺轉移模型探討丙泊酚上調DR5表達發揮抑瘤作用的研究[J]. 中華全科醫學， 2022， 20（7）： 1126-1130.

[29] JIA L， SONG Y W， MU L Y， et al. Long noncoding RNA TPT1-AS1 downregulates the microRNA-770-5p expression to inhibit glioma cell autophagy and promote proliferation through STMN1 upregulation[J]. Journal of Cellular Physiology， 2020， 235（4）： 3679-3689.

[30] BAE S Y， BYUN S， BAE S H， et al. TPT1 （tumor protein， translationally-controlled 1） negatively regulates autophagy through the BECN1 interactome and an MTORC1-mediated pathway[J]. Autophagy， 2017， 13（5）： 820-833.

[31] JUN J， ZHANG B T， ZHANG Z Q， et al. Novel gene signatures predictive of patient recurrence-free survival and castration resistance in prostate cancer[J]. Cancers， 2021， 13（4）： 917.

[32] LIN Z B， ZHANG X， WANG J L， et al. Translationally controlled tumor protein promotes liver regeneration by activating mTORC2/AKT signaling[J]. Cell Death amp; Disease， 2020， 11（1）： 58.