灰氈毛忍冬MADS-box基因家族鑒定與CMB1基因克隆

〔摘要〕 目的 鑒定灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides MADS-box家族基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析與表達(dá)模式驗(yàn)證，克隆湘蕾型和野生型灰氈毛忍冬MADS-box家族成員CMB1全長(zhǎng)。方法 基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用在線工具對(duì)灰氈毛忍冬MADS-box進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR驗(yàn)證MADS-box基因在不同品種中的表達(dá)模式，通過(guò)RT-PCR、RACE技術(shù)克隆湘蕾型和野生型灰氈毛忍冬CMB1基因全長(zhǎng)。結(jié)果 28個(gè)灰氈毛忍冬MADS-box蛋白長(zhǎng)度為89～359 aa，堿性蛋白占比85.7%，不穩(wěn)定蛋白占比96.4%，親水性蛋白占比96.4%，均定位于細(xì)胞核，均為無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)的非分泌蛋白。轉(zhuǎn)錄組顯示，與野生型比較，湘蕾型中28個(gè)MADS-box基因有17.86%表達(dá)下調(diào)，MIKCC型基因中有18.75%表達(dá)下調(diào)?？寺〉玫皆趦蓚€(gè)品種的灰氈毛忍冬花中高度特異性表達(dá)的CMB1基因全長(zhǎng)，均包含一個(gè)738 bp的ORF，編碼245個(gè)氨基酸。CMB1基因在兩個(gè)品種的花中表達(dá)量存在顯著差異（Plt;0.01），且與莖、葉相比，在花中高度特異性表達(dá)（Plt;0.01）。結(jié)論 基于灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了28個(gè)MADS-box家族基因，克隆得到湘蕾型與野生型灰氈毛忍冬CMB1基因全長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究灰氈毛忍冬花發(fā)育、優(yōu)良表型形成的分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 灰氈毛忍冬；MADS-box基因家族；表達(dá)分析；CMB1基因；基因克??；表型變異

〔中圖分類號(hào)〕R28" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.006

Identification of the MADS-box gene family and cloning of the

CMB1 gene in Lonicera macranthoides

FU Xuesen1， LIU Zixuan1， WANG Ling1， LONG Yuqing1， ZENG Juan1，

ZHOU Ribao1，2，3，4*， LIU Xiangdan1，2，3，4*

1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Key Research Laboratory of Germplasm Resources and Standardized Planting of Genuine Regional Medicinal Materials Produced in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Key Laboratory of Modern Research of Chinese Medicine， Education Department of Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Hunan Engineering Technology Research Center for Standardization and Function of Chinese Herbal Decoction Pieces， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To identify the MADS-box gene family of Lonicera macranthoides， analyze its bioinformatics， validate the expression patterns， and clone the full-length sequences of CMB1， a member of the MADS-box family of Lonicera macranthoides of Xianglei and wild types. Methods Based on the transcriptome data， the bioinformatics of Lonicera macranthoides MADS-box was analyzed with online tools， the expression patterns of MADS-box genes in different cultivars were verified using qRT-PCR， and the full-length sequences of Lonicera macranthoides CMB1 gene of the Xianglei and wild types were cloned by RT-PCR and RACE techniques. Results The sequence lengths of 28 MADS-box proteins of Lonicera macranthoides ranged from 89 aa to 359 aa， with alkali proteins accounting for 85.7%， unstable proteins accounting for 96.4%， and hydrophilic proteins accounting for 96.4%， which were localized in the nucleus， and were non-secretory proteins without transmembrane structure. The transcriptome showed that compared with the wild type， 17.86% of the 28 MADS-box genes in the Xianglei type and 18.75% of the genes of MIKCC type were downregulated. The full-length sequences of CMB1 genes， which were highly specifically expressed in two varieties of flowers of Lonicera macranthoides， were cloned. Both of them contained a 738 bp ORF， encoding 245 amino acids. There was a significant difference in expression level of CMB1 gene between the two varieties of flowers （Plt;0.01）， and it was highly and specifically expressed in flowers compared to that in stems and leaves （Plt;0.01）. Conclusion Based on the transcriptome data of Lonicera macranthoides， 28 MADS-box family genes were identified， and the full-length sequences of CMB1 gene of Xianglei and wild types were cloned， which provides the research foundation and theoretical basis for the further study of molecular mechanism of development and superior phenotype formation of Lonicera macranthoides.

〔Keywords〕 Lonicera macranthoides; MADS-box gene family; expression analysis; CMB1 gene; gene clone; phenotypic variation

MADS-box是一類古老的基因家族，廣泛存在于植物、動(dòng)物和真菌中。MADS-box基因家族分為T(mén)ypeⅠ型和TypeⅡ型兩個(gè)譜系[1]。植物中TypeⅠ型分為Mα、Mβ、Mγ 3個(gè)亞家族，TypeⅡ型MADS-box基因分為MEF2型和MIKC型，MEF2型基因主要存在于真菌和動(dòng)物中，而MIKC型基因?yàn)橹参锾赜小IKC型基因又分為MIKCC型和MIKC*型，植物中大多數(shù)MIKC型基因?yàn)镸IKCC型，包括12個(gè)亞家族SVP、FLC、TM3、AP1/FUL、SEP、AGL6、AG、AGL12、ANR1、AP3/PI、AGL15、BS[2-3]。MADS-box基因影響植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和各個(gè)器官的形態(tài)建成，如根系、果實(shí)發(fā)育，對(duì)花器官生長(zhǎng)發(fā)育的影響尤為顯著，具體表現(xiàn)為可調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，改變花器官表型和花序形態(tài)等。此外，MADS-box基因家族也會(huì)參與植物抗逆境生理過(guò)程[4-5]。從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變是開(kāi)花植物發(fā)育的關(guān)鍵過(guò)程，SEP亞族成員在調(diào)控花芽分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)在花的發(fā)育過(guò)程中參與到四輪花器官（花萼、花冠、雌蕊、雄蕊）的形態(tài)建成、開(kāi)花時(shí)間等過(guò)程，對(duì)植物的花發(fā)育過(guò)程有重要作用[6-8]。

灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz為忍冬科忍冬屬（Lonicera）植物，以干燥花蕾或者初開(kāi)的花入藥，是中藥山銀花的基源之一。本藥性寒，味甘，歸肺、心、胃經(jīng)，有清熱解毒、疏散風(fēng)熱的功效，用于治療癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、溫病發(fā)熱等疾病[9-10]?，F(xiàn)代研究證明，山銀花具有抗菌抗炎、解熱抗毒、保肝利膽的功效，廣泛用于防治傳染類疾病，如流感、手足口病、病毒性肺炎等[11]。目前，收載山銀花的中成藥有24個(gè)，且山銀花在銀翹傷風(fēng)膠囊、清熱銀花糖漿、風(fēng)熱清口服液等中成藥中均為君藥[12]。山銀花主要在湖南、重慶、貴州等地區(qū)生產(chǎn)，灰氈毛忍冬是山銀花的主要來(lái)源，其中湖南省隆回縣是全國(guó)最大的山銀花生產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量占全國(guó)總產(chǎn)量53%[13]。野生型灰氈毛忍冬的花蕾不整齊，花蕾期短，花冠展開(kāi)后一兩天即凋謝，需分批采收，若采收不及時(shí)易造成藥材品質(zhì)下降和資源浪費(fèi)。20世紀(jì)90年代末，研究者在湖南溆浦發(fā)現(xiàn)灰氈毛忍冬自然突變株，該突變株經(jīng)多代無(wú)性繁殖和篩選，培育出了優(yōu)良的無(wú)性品種，命名為“湘蕾金銀花”Lonicera macranthoides “Xianglei”（LmXL），即湘蕾型灰氈毛忍冬，表現(xiàn)為花冠不展開(kāi)、花蕾整齊和花蕾期長(zhǎng)達(dá)20余天，可一次性采收[14]。研究表明，灰氈毛忍冬中主要成分綠原酸含量隨花冠的展開(kāi)而下降[15-16]，湘蕾型所具有的優(yōu)良表型，為山銀花藥材的采收、加工節(jié)約了成本，保障了藥材品質(zhì)的穩(wěn)定性，有利于資源高效利用。但湘蕾型灰氈毛忍冬優(yōu)良表型形成的分子機(jī)制仍未被揭曉。

目前，本課題組已經(jīng)從灰氈毛忍冬中克隆得到MADS-box家族中AP1[17]、AGL19[18]、AGL15[14]基因，龍麗君等[19]克隆得到SVP基因。然而，尚沒(méi)有研究對(duì)灰氈毛忍冬MADS-box家族基因進(jìn)行系統(tǒng)地挖掘與鑒定，也未見(jiàn)SEP亞族基因在灰氈毛忍冬中報(bào)道。因此，本文以湘蕾型、野生型灰氈毛忍冬的花為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?；赗NA-seq結(jié)果，對(duì)灰氈毛忍冬MADS-box家族基因進(jìn)行鑒定，分析兩個(gè)灰氈毛忍冬品種中MADS-box家族基因的表達(dá)情況，并克隆SEP亞族成員CMB1，以期為進(jìn)一步研究灰氈毛忍冬花發(fā)育奠定研究基礎(chǔ)，為探討湘蕾型灰氈毛忍冬花冠形態(tài)變異機(jī)制提供參考依據(jù)。自SEP亞族基因被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該亞族成員的生物學(xué)功能多于花中體現(xiàn)[20]。因此，本研究只對(duì)CMB1基因在品種間花的相對(duì)表達(dá)量和在品種內(nèi)莖、葉與花的相對(duì)表達(dá)量做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1" 樣品來(lái)源與處理

兩個(gè)灰氈毛忍冬品種均采自湖南省隆回縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)劉湘丹教授鑒定為忍冬科灰氈毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.的野生型和湘蕾型。按課題組前期花期分類標(biāo)準(zhǔn)，將灰氈毛忍冬花樣品分類，即花期1～7[21]，詳見(jiàn)圖1。各個(gè)花期花樣品分裝密封，經(jīng)液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存，送至上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2" 主要試劑

Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司，批號(hào)：BSC65S1）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)ThermoFisher Scientific公司，批號(hào)：K1622）；TranStart[R][○] Green qPCR SuperMix UDG（北京全式金生物科技有限公司，批號(hào)：AQ111）；2×Taq MasterMix（Dye）（康為世紀(jì)科技有限公司，批號(hào)：CW0682）；DNA凝膠回收試劑盒、TreliefTM 5α感受態(tài)細(xì)胞（北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：GE0101、TSC01）；SMARTer[R][○]RACE 5′/3′Kit（美國(guó)Clontech公司，批號(hào)：634858）。

1.3" 方法

1.3.1" 灰氈毛忍冬MADS-box家族基因篩選與鑒定" 在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam-legacy.xfam.org/）下載MADS-box家族基因保守結(jié)構(gòu)域SRF-TF（PF00319）隱馬爾可夫模型（Hidden Markov Model，HMM）文件，以此文件為種子文件利用TBtools軟件在灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選MADS-box家族蛋白序列（E-valuelt;1×10-5）。從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabi?dopsis.org/）下載擬南芥MADS-box家族基因蛋白序列為參考，使用TBtools軟件中的生物大分子序列比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool， BLAST）進(jìn)行比對(duì)。將BLAST與HMM篩選出的蛋白質(zhì)序列結(jié)果取交集，通過(guò)SMART（https：//smart.embl.de/）、NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/index.shtml）、Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩得的序列逐一驗(yàn)證，刪除結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白序列及冗余序列。

1.3.2" 灰氈毛忍冬MADS-box家族基因生物信息學(xué)分析" 通過(guò)ProtParam網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)其蛋白理化性質(zhì)，包括編碼蛋白的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、不穩(wěn)定系數(shù)及等電點(diǎn)等；采用ProtScale網(wǎng)站（https：//web.expasy.org/protscale/）預(yù)測(cè)蛋白親/疏水性；WOLF PSORT網(wǎng)站（https：//wolfp?

sort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位；TMHMM 2.0網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；SignalP 4.1 Server網(wǎng)站（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；運(yùn)用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_server.html）預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL網(wǎng)站（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；MEME網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析灰氈毛忍冬MADS-box家族蛋白保守基序（motif），查找基序數(shù)設(shè)定為10，其他參數(shù)保持默認(rèn)值。通過(guò)TBtools軟件對(duì)motif結(jié)果進(jìn)行可視化分析；擬南芥、灰氈毛忍冬MADS-box家族蛋白序列取合集，通過(guò)TBtools軟件的MUSCLE Wrapper程序進(jìn)行多序列比對(duì)，再經(jīng)過(guò)trimAL Wrapper程序修剪后，以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3" 灰氈毛忍冬MADS-box家族基因表達(dá)分析與驗(yàn)證" 以兩個(gè)灰氈毛忍冬品種MADS-box家族基因在花中的TPM值為變量，通過(guò)TBtools軟件繪制熱圖。選取9個(gè)MADS-box家族表達(dá)差異基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。通過(guò)Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取兩個(gè)灰氈毛忍冬花品種的總RNA，并定量至100 ng/μL；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA為模板；以18S基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各 0.4 μL，2xTansStart[R][○] Green qPCR SuperMix UDG 10 μL，Nuclease-free water 8.2 μL。擴(kuò)增程序：50 ℃ 2 min；94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性5 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s；40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)，2-ΔΔt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4" 灰氈毛忍冬CMB1基因的克隆" 以1.3.3項(xiàng)中cDNA為模板進(jìn)行核心片段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系25 μL：2×Taq MasterMix （Dye） 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，CBM1-F 1 μL，CMB1-R 1 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，循環(huán)40次；72 ℃延伸10 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，目的條帶經(jīng)DNA凝膠回收試劑盒回收并連接至pEASY[R][○]-T1載體，熱激轉(zhuǎn)化至TreliefTM 5α感受態(tài)細(xì)胞并涂布于含有Amp、IPTG、X-gal的LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性菌液過(guò)夜培養(yǎng)后送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。根據(jù)核心片段測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)RACE特異性引物。按照SMARTer[R][○]RACE 5′/3′Kit說(shuō)明書(shū)獲得5′和3′RACE-Ready cDNA并進(jìn)行RACE擴(kuò)增。目的條帶回收和測(cè)序等過(guò)程同前。通過(guò)ContingExpress軟件對(duì)5′端和3′端進(jìn)行序列拼接，得到兩個(gè)灰氈毛忍冬品種的CMB1基因全長(zhǎng)，根據(jù)拼接cDNA全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)驗(yàn)證引物進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證。反應(yīng)體系及條件同核心片段克隆，其中退火溫度調(diào)整至60 ℃。擴(kuò)增目的條帶回收和測(cè)序等過(guò)程同前。引物序列詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果

2.1" 灰氈毛忍冬MADS-box基因鑒定與蛋白理化性質(zhì)

通過(guò)BLAST、HMM分別鑒定出51、35條MADS-box蛋白序列，兩種方法所得結(jié)果取交集，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域檢驗(yàn)和冗余序列刪除后，最終從灰氈毛忍冬轉(zhuǎn)錄組中得到28條MADS-box家族蛋白序列。結(jié)合擬南芥MADS-box蛋白名與NCBI-Blastp結(jié)果對(duì)其命名，詳見(jiàn)表2。通過(guò)Protparam、ProtScale網(wǎng)站在線分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，序列長(zhǎng)度89 aa（LmGLO-2）～359 aa（LmAGL65）；相對(duì)分子質(zhì)量為10 172.82（Lm?GLO-2）～41 162.39（LmAGL65）；等電點(diǎn)為6.21（Lm?AGL65）～10.01（LmSVP），其中酸性蛋白4個(gè)，堿性蛋白24個(gè)，堿性蛋白占比85.7%；蛋白不穩(wěn)定系數(shù)25.01（LmTM6）～73.39（LmSVP），其中穩(wěn)定蛋白1個(gè)（不穩(wěn)定系數(shù)lt;40），不穩(wěn)定蛋白27個(gè)（不穩(wěn)定系數(shù)gt;40），不穩(wěn)定蛋白占比96.4%；脂肪系數(shù)為66.71（LmAGL80-2）～98.5（LmAGL12）。MADS-box蛋白總平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.883（LmTM6）～-0.284（LmAGL12），其中親水性蛋白27個(gè)（GRAVYlt;-0.5），占比96.4%，兩性蛋白1個(gè)（-0.5lt;GRAVYlt;0.5）。

2.2" 灰氈毛忍冬MADS-box蛋白的亞細(xì)胞定位、信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)

WOLF PSORT亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，灰氈毛忍冬MADS-box蛋白均定位于細(xì)胞核中。SignalP 4.1

Server網(wǎng)站預(yù)測(cè)可知MADS-box蛋白不存在含信號(hào)肽序列，為非分泌型蛋白。TMHMM 2.0網(wǎng)站分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明MADS-box蛋白不具跨膜區(qū)域，且所有氨基酸均在膜外。

2.3" 灰氈毛忍冬MADS-box蛋白基序、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)

利用MEME網(wǎng)站在灰氈毛忍冬MADS-box蛋白中共鑒定出10個(gè)Motif，長(zhǎng)度為11～50 aa。28個(gè)MADS-box蛋白分別含有2～7個(gè)Motif。除LmGLO-1外，均含有Motif 1；除LmAGL80-1、LmAGL80-2、LmAGL63-2、LmAGL65外，均含有Motif 3；除LmAGL62-1、LmAG?L62-3、LmAGL62-3、LmSVP、LmSCO1-3、LmGLO2-2外，均含有Motif 2。通過(guò)TBtools軟件對(duì)10個(gè)Motif進(jìn)行可視化，其中Motif 1、Motif 3屬于MADS結(jié)構(gòu)域，Motif 2、Motif 4屬于K-box結(jié)構(gòu)域，表明MEME網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果可信。詳見(jiàn)圖2。

灰氈毛忍冬MADS-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α螺旋占比26.97%（LmGLO-2）～69.32%（LmSCO1-2），均值為54.01%；β轉(zhuǎn)角占比2.24%（LmAGL42-1）～17.98%（LmGLO-2），均值為5.45%；無(wú)規(guī)則卷曲占比7.69%（LmAGL80-1、LmAGL80-2）～30.34%（LmGLO-2），均值為12.77%；延伸鏈占比11.33%（LmAP1-1）～52.37%（LmAGL65），均值為27.77%；α螺旋占比最高，為灰氈毛忍冬MADS-box蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)組成元件，延伸鏈為次要原件，詳見(jiàn)表3。SWISS-MODEL軟件預(yù)測(cè)的灰氈毛忍冬MADS-box蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可見(jiàn)α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈，分布比例與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)相符，詳見(jiàn)圖3。

2.4" 灰氈毛忍冬MADS-box蛋白系統(tǒng)進(jìn)化

將106個(gè)擬南芥MADS-box蛋白和28個(gè)灰氈毛忍冬MADS-box蛋白通過(guò)最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，詳見(jiàn)圖4。28個(gè)灰氈毛忍冬MADS-box蛋白可分為5個(gè)TypeⅠ型與23個(gè)TypeⅡ型。其中，TypeⅠ型中Mα亞族3個(gè)、Mγ亞族2個(gè)、Mβ亞族成員0個(gè)；TypeⅡ型中，MIKC*型只有1個(gè)成員，MIKCC型中除AGL6、FLC亞族外，在其余11個(gè)亞族均有分布：SVP亞族1個(gè)、TM3亞族4個(gè)、AP1/FUL亞族3個(gè)，SEP亞族5個(gè)、AG亞族1個(gè)、AGL12亞族1個(gè)、ANR1亞族1個(gè)、AP3/PI亞族3個(gè)、BS亞族1個(gè)，其中SEP亞族成員最多。

2.5" 灰氈毛忍冬MADS-box家族基因表達(dá)情況

對(duì)兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬花期4轉(zhuǎn)錄組結(jié)果中28個(gè)MADS-box家族基因表達(dá)量做聚類熱圖，詳見(jiàn)圖5。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示，在第4花期，與野生型比較，湘蕾型中有2個(gè)基因（LmAGL80-1、LmAGL65）表達(dá)顯著上調(diào)，3個(gè)基因（LmAP1-1、LmGLO-1、LmSCO1-1）表達(dá)顯著下調(diào)。除此之外，還有8個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量在湘蕾型中高于野生型，15個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量低于野生型。在湘蕾型TypeⅠ型中3個(gè)基因的表達(dá)量高于野生型，2個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量低于野生型；TypeⅡ中MIKC*僅有1個(gè)基因（LmAGL65）表達(dá)量高于野生型；MIKCC中7個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量高于野生型，16個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量低于野生型。湘蕾型中，AP1/FUL亞族3個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量低于野生型，其中LmAP1-1表達(dá)顯著下調(diào)；3個(gè)AP3/PI亞族基因相對(duì)表達(dá)量均高于野生型；SEP亞族基因中LmSEP4相對(duì)表達(dá)量高于野生型，其余4個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量均低于野生型?？傮w而言，與野生型比較，湘蕾型中28個(gè)MADS-box基因有17.86%表達(dá)下調(diào)，MIKCC型基因中有18.75%表達(dá)下調(diào)。

選取9個(gè)代表性基因（LmAGL12、LmAGL65、LmAGL80-1、LmAP1-1、LmAP1-2、LmTM6、LmGLO-1、LmCMB1、LmSCO1-1）通過(guò)qRT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，qRT-PCR結(jié)果與RNA-seq趨勢(shì)一致，湘蕾型中除LmAGL65、LmAGL80-1表達(dá)量高于野生型，其余7個(gè)基因表達(dá)量均低于野生型（Plt;0.05）。詳見(jiàn)圖6。

2.6" 兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1基因的克隆

與野生型花比較，湘蕾型花中CMB1基因表達(dá)量顯著下調(diào)（Plt;0.01）。進(jìn)一步檢測(cè)CMB1基因在野生型和湘蕾型灰氈毛忍冬花、莖、葉相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明。兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1基因在花中的表達(dá)量都顯著高于葉和莖（Plt;0.01），詳見(jiàn)圖7。

基于CMB1在花中高度特異性表達(dá)的特征，及兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬花的極顯著表達(dá)差異，進(jìn)一步對(duì)兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1基因進(jìn)行克隆研究。以灰氈毛忍冬花總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴(kuò)增兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1核心片段，經(jīng)測(cè)序與轉(zhuǎn)錄組Unigene序列匹配后，通過(guò)RACE技術(shù)得到兩個(gè)灰氈毛忍冬品種的CMB1基因的5′、3′端序列。RACE產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后通過(guò)Conting Express拼接，得到兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1基因全長(zhǎng)序列。最終利用全長(zhǎng)驗(yàn)證引物對(duì)兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1基因進(jìn)行全長(zhǎng)驗(yàn)證，凝膠電泳圖，詳見(jiàn)圖8A。測(cè)序顯示，野生型和湘蕾型CMB1基因全長(zhǎng)分別為1 064 bp、1 062 bp，通過(guò)DNAMAN比對(duì)分析，PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與拼接結(jié)果一致，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別命名為L(zhǎng)mCMB1（GenBank： OR 687631.1）、LmXLCMB1（GenBank： OR 687632.1）。

LmCMB1與LmXLCMB1均包含一個(gè)738 bp的ORF，堿基無(wú)差異，編碼245個(gè)氨基酸，翻譯蛋白無(wú)差異，與黃石斛Dendrobium catenatum（XP 020679397.1）、番茄Solanum lycopersicum（NP 001362848.1）、牽牛Ipomoea nil（XP 019199885.1）CMB1基因編碼蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示總相似性達(dá)77.51%。詳見(jiàn)圖8B。

3 討論

MADS-box家族基因與植物生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系密切，尤其在花器官發(fā)育過(guò)程中起重要作用。一般情況下，花萼由A類基因調(diào)控，花冠由B類和A類基因調(diào)控，雄蕊由B類和C類基因調(diào)控，雌蕊由C類基因調(diào)控，胚珠由D類和部分C類基因調(diào)控，以上四輪花器官發(fā)育均有E類基因參與，即調(diào)控花器官發(fā)育有ABCDE類模型[22]。目前，研究者已從部分藥用植物中挖掘得到MADS-box家族基因信息，如甘松[23]（轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，20個(gè)）、當(dāng)歸[24]（轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，29個(gè)）、忍冬[25]（基因組數(shù)據(jù)，48個(gè)）。本研究從灰氈毛忍冬中共鑒定出28個(gè)MADS-box基因家族成員，其中A類基因3個(gè)、B類基因3個(gè)、C類基因2個(gè)、E類基因5個(gè)，并克隆了湘蕾型與野生型灰氈毛忍冬E類基因CMB1的全長(zhǎng)序列。E類基因是植物花器官發(fā)育過(guò)程的協(xié)同因子，貫穿于整個(gè)花器官的發(fā)育過(guò)程。紫薇LiCMB1基因在花芽分化、花萼分化中起關(guān)鍵作用[26]，桃PpCMB1基因抑制PpDAM5基因?qū)ㄑ棵劝l(fā)的抑制作用，正調(diào)控花芽萌發(fā)，并在桃花雄蕊和萼片的發(fā)育中期起積極的調(diào)控作用[27]。關(guān)鍵多序列比對(duì)結(jié)果總相似達(dá)77.51%，推測(cè)灰氈毛忍冬CMB1基因可能與其同源基因功能相似，參與了花芽分化、花器官形態(tài)建成等過(guò)程。兩個(gè)品種的灰氈毛忍冬CMB1蛋白雖然在理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)上并無(wú)差異，但在花的表達(dá)量上存在顯著差異（Plt;0.01）。因此，可能在基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與PPI網(wǎng)絡(luò)中功能相同但作用存在差異，進(jìn)而影響花器官的表型。

灰氈毛忍冬以花蕾或初開(kāi)的花入藥，因此，本研究對(duì)灰氈毛忍冬花冠展開(kāi)前1個(gè)花期，即花期4的MADS-box基因表達(dá)量進(jìn)行分析。湘蕾型中，28個(gè)MADS-box家族基因的相對(duì)表達(dá)量總體上有64.3%低于野生型，有17.86%較野生型表達(dá)下調(diào)，MIKCC型中72.7%的基因相對(duì)表達(dá)量低于野生型，有18.75%較野生型表達(dá)下調(diào)?；贏BCDE類模型，經(jīng)過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證，直接調(diào)控花冠發(fā)育的B類基因中，LmGLO-1表達(dá)下調(diào)，參與花冠發(fā)育的A類基因LmAP1-1表達(dá)下調(diào)，E類基因中LmCMB1基因表達(dá)下調(diào)。已有研究表明，山茶B類基因CjDEF在煙草中過(guò)表達(dá)后，部分轉(zhuǎn)基因植株的花瓣出現(xiàn)湘蕾型灰氈毛忍冬類似表型，即花瓣在發(fā)育過(guò)程中始終無(wú)法展開(kāi)[28]。在煙草中過(guò)表達(dá)水稻AP1基因可使煙草花期延長(zhǎng)[29]。紫蘇PfAP1基因過(guò)表達(dá)擬南芥植株在表型上表現(xiàn)出早花、株高增加、生長(zhǎng)加快的特點(diǎn)[30]。因此，推測(cè)LmGLO-1、LmTM6、LmAP1-1、LmCMB1和灰氈毛忍冬的花冠發(fā)育與蕾期長(zhǎng)短有關(guān)。此外，ABCDE類模型上游基因開(kāi)花整合因子LmSCO1在湘蕾型灰氈毛忍冬表達(dá)下調(diào)。SCO1可直接整合植物開(kāi)花啟動(dòng)中的年齡途徑、赤霉素途徑信號(hào)控制開(kāi)花時(shí)間[31-32]。據(jù)此推測(cè)，灰氈毛忍冬LmSOC1在調(diào)控花蕾長(zhǎng)短時(shí)可能也起到重要作用。目前，有關(guān)AGL12、AGL80、AGL65基因研究較少，AGL12為少數(shù)優(yōu)先在植物根部組織中表達(dá)的MADS-box基因，調(diào)控根系發(fā)育，AGL80主要調(diào)控中心細(xì)胞和胚乳發(fā)育，AGL65與花粉管發(fā)育有關(guān)[33-35]。灰氈毛忍冬LmAGL12、LmAGL80、LmAGL65基因的功能有待進(jìn)一步研究。

MADS-box基因家族與植物的藥用價(jià)值緊密相關(guān)。例如，菊FUL同源基因CmFL1參與菊花開(kāi)花時(shí)間和小花形成的調(diào)控過(guò)程[36]，紅花A類基因CtMADS24可直接影響紅花花期長(zhǎng)短、花萼的發(fā)育[37]。除直接影響中藥材外觀性狀外，MADS-box家族基因?qū)λ幱弥参飪?nèi)含活性成分含量和抵抗逆境生長(zhǎng)也具有調(diào)控作用，如人參PgMADS17-04基因既促進(jìn)人參皂苷的生物合成，又能響應(yīng)冷脅迫[38]。黃花蒿AaSEP1調(diào)控分泌型腺毛的發(fā)育進(jìn)而影響青蒿藥材中青蒿素的含量[39]?；覛置潭ǖ陌l(fā)育對(duì)山銀花的產(chǎn)量、品質(zhì)有至關(guān)重要的影響。湘蕾型灰氈毛忍冬花冠不展開(kāi)、花蕾整齊、蕾期長(zhǎng)的優(yōu)良表型的產(chǎn)生，明顯提高了灰氈毛忍冬農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。灰氈毛忍冬MADS-box基因家族中LmAGL15已證實(shí)與蕾期延長(zhǎng)有關(guān)[14]，同家族LmAP1[17]、LmAGL19[18]基因均可能與湘蕾灰氈毛忍冬優(yōu)良表型的變異有關(guān)。植物花器官的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，ABCDE類模型各個(gè)基因之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，單個(gè)基因表達(dá)變化往往能夠引起連鎖反應(yīng)，湘蕾型灰氈毛忍冬優(yōu)良表型產(chǎn)生的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。探究湘蕾型灰氈毛忍冬花冠優(yōu)良表型的分子機(jī)制對(duì)山銀花藥材的產(chǎn)業(yè)發(fā)展有重要意義，通過(guò)基因編輯技術(shù)應(yīng)用到其他花類藥材或園藝植物，對(duì)后續(xù)創(chuàng)新表型優(yōu)良的種質(zhì)具有指導(dǎo)意義與產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

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