基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證探究生血通便顆粒治療慢傳輸型便秘的作用機(jī)制

〔摘要〕 目的 采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測生血通便顆粒治療慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）的潛在作用機(jī)制，并進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫篩選生血通便顆粒的活性成分及作用靶點(diǎn)，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選STC疾病相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，使用R語言對交集基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。大鼠采用鹽酸洛哌丁胺混懸液[3 mg/（kg·d）]灌胃建立STC模型。將大鼠分為正常組（等體積蒸餾水）、模型組（等體積蒸餾水）、莫沙比利組[1.35 mg/（kg·d）]、生血通便顆粒低劑量組[1.44 g/（kg·d）]、生血通便顆粒高劑量組[2.88 g/（kg·d）]，每組8只，每日灌胃1次，連續(xù)治療14 d。記錄治療后腸道推進(jìn)率；HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變；免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸組織酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor， c-Kit）表達(dá)；TUNEL染色檢測結(jié)腸組織Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal， ICC）凋亡情況；Western blot檢測結(jié)腸組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein， CHOP）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）、活化型胱天蛋白酶-3（cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3， cleaved Caspase-3）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 篩選出生血通便顆粒活性成分74個，對應(yīng)的作用靶點(diǎn)為492個，CASP3（Caspase-3）、Bcl-2、Bax凋亡基因是STC的核心靶點(diǎn)之一，其相關(guān)的作用通路為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組比較，模型組大鼠腸道推進(jìn)率降低（Plt;0.01）；結(jié)腸黏膜萎縮、變薄，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體缺損破壞明顯，可見炎性改變；結(jié)腸組織中c-Kit表達(dá)降低（Plt;0.01）；凋亡細(xì)胞綠色熒光增加、c-Kit紅色熒光減少，ICC凋亡指數(shù)升高（Plt;0.01）；結(jié)腸組織GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.01）。與模型組相比，莫沙必利組及生血通便顆粒低、高劑量組大鼠腸道推進(jìn)率提高（Plt;0.01）；結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，炎性情況有所恢復(fù)，腺體排列較整齊；結(jié)腸組織中c-Kit表達(dá)升高（Plt;0.01）；凋亡細(xì)胞綠色熒光減少、c-Kit紅色熒光增加，ICC凋亡指數(shù)降低（Plt;0.01）；結(jié)腸組織GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.01）。與莫沙必利組相比，生血通便顆粒高劑量組腸道推進(jìn)率提高（Plt;0.05）、c-Kit表達(dá)升高（Plt;0.05）、ICC凋亡指數(shù)降低（Plt;0.05）；生血通便顆粒低、高劑量組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.01），生血通便顆粒高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0.01）。結(jié)論 生血通便顆粒可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/CHOP信號通路，調(diào)控Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)，從而抑制ICC凋亡以達(dá)到治療STC的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 生血通便顆粒；慢傳輸型便秘；Cajal間質(zhì)細(xì)胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.03.009

Mechanism of Shengxue Tongbian Granules in treating slow transit constipation based on network pharmacology and experimental validation

LUO Wenpeng1，2， WANG Zhenquan1， ZHOU Jiamin2， XIAO Limin2， WANG Shi1，

LU Wenhong1， WANG Junwen1，2*

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China;

2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To predict the potential mechanism of action of Shengxue Tongbian Granules （SXTBG） in treating slow transit constipation （STC） by network pharmacology and to verify it by animal experiments. Methods TCMSP and BATMAN-TCM databases were used to screen out the active ingredients and targets of SXTBG， and GeneCards and OMIM databases were used to screen out STC disease-related targets， then an \"active ingredient-disease target\" network was established. GO and KEGG enrichment analyses were performed on intersection genes through R language. A STC rat model was established by gavage with loperamide hydrochloride suspension [3 mg/（kg·d）]. Rats were randomized into normal group （equal volume of distilled water）， model group （equal volume of distilled water）， mosapride group [1.35 mg/（kg·d）]， low-dose SXTBG group [1.44 g/（kg·d）]， and high-dose SXTBG group [2.88 g/（kg·d）]， with eight rats in each group. All the groups were treated by gavage once a day for 14 consecutive days. Intestinal propulsion rate of the rats after treatment was recorded. In the rat colon tissue， HE staining was used to observe its pathological changes， immunohistochemical staining to check the expression level of tyrosine kinase receptor （c-Kit）， TUNEL staining to examine the apoptosis of interstitial cells of Cajal （ICC）， and Western blot to test expressions of glucose regulated protein 78 （GRP78）， C/EBP homologous protein （CHOP）， Bcl-2 associated X protein （Bax）， B-cell lymphoma-2 （Bcl-2）， and cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3 （cleaved Caspase-3）. Results A total of 74 active ingredients of SXTBG were screened out， with 492 corresponding targets. CASP3 （Caspase-3）， Bcl-2， and Bax apoptosis genes were one of the core targets of STC， and their related pathways of action were endoplasmic reticulum stress signaling pathways. Animal experiment results showed that compared with normal group， the intestinal propulsion rate of model group decreased （Plt;0.01）; the colonic mucosa atrophied and became thinner， with loss of mucosal epithelial layer， severe damage to the glandular tissue in the lamina propria， and visible inflammatory changes; the expression of c-Kit in the colon tissue decreased （Plt;0.01）; the green fluorescence of apoptotic cells increased， the red fluorescence of c-Kit decreased， and the ICC apoptosis index increased （Plt;0.01）; the protein expression levels of GRP78， CHOP， Bax， and cleaved Caspase-3 in the colon tissue increased （Plt;0.01）， while that of Bcl-2 decreased （Plt;0.01）. Compared with model group， the intestinal propulsion rates of mosapride group and low- and high-dose SXTBG groups increased （Plt;0.01）; the colonic mucosal structure was relatively intact， and the inflammation was alleviated， and the glandular arrangement was relatively neat; the expression of c-Kit in the colon tissue increased （Plt;0.01）; the green fluorescence of apoptotic cells decreased， the red fluorescence of c-Kit increased， and the ICC apoptosis index decreased （Plt;0.01）; the protein expression levels of GRP78， CHOP， Bax， and cleaved Caspase-3 in the colon tissue decreased （Plt;0.01）， while that of Bcl-2 increased （Plt;0.01）. Compared with mosapride group， high-dose SXTBG group showed an increase in the intestinal propulsion rate （Plt;0.05） and c-Kit expression （Plt;0.05）， and a decrease in the ICC apoptosis index （Plt;0.05）; the protein expression levels of GRP78， CHOP， Bax， and cleaved Caspase-3 in the colon tissue of low- and high-dose SXTBG groups decreased （Plt;0.01）， while that of Bcl-2 increased in high-dose SXTBG group （Plt;0.01）. Conclusion SXTBG can inhibit ICC apoptosis and exert therapeutic effects on STC by inhibiting the endoplasmic reticulum stress GRP78/CHOP signaling pathway and regulating the expressions of Bax， Bcl-2， and cleaved Caspase-3 apoptotic proteins.

〔Keywords〕 Shengxue Tongbian Granules; slow transit constipation; interstitial cells of Cajal; endoplasmic reticulum stress; apoptosis; network pharmacology

慢傳輸型便秘（slow transit constipation， STC）是一種臨床常見的功能性胃腸疾病，以腸道動力障礙、傳輸功能減弱為特征，臨床上主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、周期延長、糞質(zhì)干硬等[1]。最新流行病學(xué)調(diào)查顯示，STC的患病人數(shù)在慢性便秘人群中占15%～42%[2]。長期便秘給患者帶來極大的心理負(fù)擔(dān)及經(jīng)濟(jì)壓力，甚至可引起相關(guān)心腦血管疾病、結(jié)直腸癌等。目前，西醫(yī)治療STC不斷完善和規(guī)范，但療效尚不理想，而中醫(yī)藥因遠(yuǎn)期療效滿意和不良反應(yīng)少，已成為近年來治療STC藥物研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，便秘病位在大腸，與心、肝、脾、肺、腎關(guān)系密切，其病機(jī)多為虛實(shí)夾雜，與氣血津液、寒熱虛實(shí)相關(guān)。生血通便顆粒是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院的院內(nèi)自制劑，方藥組成包括白芍、生地黃、大黃、瓜蔞皮、瓜蔞子、當(dāng)歸、枳殼、何首烏、決明子、桃仁、白術(shù)，全方補(bǔ)中有通、通中有補(bǔ)、攻補(bǔ)兼施，具有滋陰養(yǎng)血、益氣潤腸之功，多年來用于臨床，療效滿意[3-5]。

中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，但其藥效物質(zhì)以及療效機(jī)制尚不明確，還需要進(jìn)一步探索。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性和系統(tǒng)性，與中醫(yī)學(xué)的整體觀和辨證論治等理論相契合[6-8]。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測生血通便顆粒治療STC的相關(guān)靶點(diǎn)及機(jī)制，并通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)和相關(guān)蛋白，為本課題組后期基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1" 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.1.1" 數(shù)據(jù)庫及軟件" TCMSP數(shù)據(jù)庫（http：//tcmspw.com/index.php）；BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）；UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）；GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）；OMIM數(shù)據(jù)庫（https：//www.omim.org/）；STRING數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/；Bioconductor平臺（http：//www.bioconductor.org/）；R軟件；Perl軟件；Cytoscape軟件。

1.1.2" 生血通便顆粒的活性成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫收集生血通便顆粒的活性成分及對應(yīng)的作用靶點(diǎn)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中設(shè)置篩選條件口服生物利用度（oral bioavailability， OB）≥30%、類藥性（drug-likeness， DL）≥0.18，收集白芍、瓜蔞、大黃、當(dāng)歸、枳殼、決明子、桃仁和白術(shù)的活性成分；在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中設(shè)置Score≥20且Plt;0.05為篩選條件，收集生地黃和何首烏的活性成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索中藥成分對應(yīng)的靶點(diǎn)（即生血通便顆粒的藥物靶點(diǎn)）。運(yùn)用Perl軟件結(jié)合UniProt數(shù)據(jù)庫對藥物靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化。

1.1.3" 疾病相關(guān)靶點(diǎn)及交集靶點(diǎn)獲取" 以“slow transit constipation”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后整理成STC靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.1.4" “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析" 利用R語言對藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，即兩者取交集。運(yùn)用Perl語言映射出交集靶點(diǎn)所對應(yīng)的中藥活性成分，建立生血通便顆粒中藥活性成分干預(yù)STC的相關(guān)靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫。借助Cytoscape軟件的最大集團(tuán)中心性（maximal clique centrality， MCC）算法提取前30個節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建“活性成分-疾病靶點(diǎn)”可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5" PPI網(wǎng)絡(luò)篩選核心基因" 將上述得到的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)MCC算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，篩選出疾病核心基因。

1.1.6" 富集分析" 運(yùn)用R語言對得到的交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析。在GO富集分析中，對靶點(diǎn)生物過程（biological process， BP）、細(xì)胞組成（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）3個方面進(jìn)行作用機(jī)制注釋，并根據(jù)P值選取每個部分排名前10位的條目進(jìn)行進(jìn)一步分析。在KEGG富集分析中，對靶點(diǎn)所參與的信號通路進(jìn)行注釋，并根據(jù)P值選取排名前30位的條目進(jìn)行深入研究。

1.2" 動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1" 實(shí)驗(yàn)動物" 44只SPF級健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20） g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心代購并飼養(yǎng)，許可證號SYXK（湘）2019-0009。所有大鼠在清潔、安靜、通風(fēng)良好的環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度為24～26 ℃，相對濕度為40%～60%，均自由進(jìn)食、飲水。本動物實(shí)驗(yàn)研究獲得湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核通過（批準(zhǔn)號：LL2022110820）。

1.2.2" 藥物" 生血通便顆粒由白芍、生地黃、大黃、瓜蔞皮、瓜蔞子、當(dāng)歸、枳殼、何首烏、決明子、桃仁、白術(shù)組成，配制單位：湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（湖南省中醫(yī)院），湘藥制備字：Z20210440000，批號：20210920，規(guī)格：8 g/包。枸櫞酸莫沙必利分散片（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字：H20031110，批號：20220113，規(guī)格：5 mg/片）；鹽酸洛哌丁胺膠囊（易蒙停）（西安楊森制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：H10910085，批號：20220302，規(guī)格：2 mg/片）。

1.2.3" 主要試劑與儀器" TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（瑞士Roche公司，批號：11684817910）；HE染色試劑盒（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA4041）；酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor， c-Kit）（美國Santa公司，批號：SC-365504）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein， CHOP）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）、活化型胱天蛋白酶-3（cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3， cleaved Caspase-3）、β-actin、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（美國Santa公司，批號：SC7455、SC7532、SC7382、SC7480、SC7272、SC47778、SC2748）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAPI染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0009、C1002）。

脫水機(jī)、石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號：JT-12S、JB-P7）；病理切片機(jī)（德國Leica儀器有限公司，型號：RM 2016）；正置熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse Ti-SR、Nikon DS-U3）；酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號：muLISKANMK3]；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、電泳槽（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-40、DYCZ-24DN）；脫色搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）；冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，型號：neofuge 15R）。

1.2.4" 動物造模" 按照隨機(jī)數(shù)字表法將44只大鼠分為正常組10只、造模組34只。除正常組外，其余大鼠采用洛哌丁胺灌胃制備STC大鼠模型[9]：每日予鹽酸洛哌丁胺混懸液灌胃，劑量為3 mg/（kg·d），使用無菌生理鹽水配制藥物濃度為0.3 mg/mL的鹽酸洛哌丁胺混懸液，給藥體積為10 mL/kg；正常組灌胃等量蒸餾水，均連續(xù)灌胃12 d。隨后正常組與造模組每組隨機(jī)取2只大鼠用于模型驗(yàn)證，造模組糞便干結(jié)、量少粒細(xì)，腸道推進(jìn)率明顯下降，表示模型建立成功[10]。

1.2.5" 分組與給藥" 模型判定成功后，正常組剩余8只、造模組剩余32只大鼠，再將造模組隨機(jī)分為模型組、莫沙比利組和生血通便顆粒低、高劑量組，每組8只大鼠。生血通便顆粒人臨床日用量為16 g生藥顆粒，根據(jù)臨床推薦成人每日劑量以及人與動物按體表面積折算的等效劑量（人與大鼠的換算比為0.018）[11]，計算得出大鼠生血通便顆粒低、高劑量分別為1.44、2.88 g/kg（相當(dāng)于臨床成人等效劑量的1、2倍）。將生血通便顆粒用蒸餾水完全溶解以灌胃，莫沙比利組給予枸櫞酸莫沙必利分散片，同樣用蒸餾水溶解成混懸液灌胃，給藥劑量為1.35 mg/kg。正常組與模型組予等體積蒸餾水灌胃。給藥體積均為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)14 d。

1.2.6" 樣本采集與處理" 第14日灌胃結(jié)束后，所有大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射麻醉，脫頸處死大鼠，取出幽門至直腸末端腸管，計算腸道推進(jìn)率；測量后剪取結(jié)腸組織，擠出腸腔內(nèi)的殘留物，PBS緩沖液沖洗。一部分用4%多聚甲醛固定，以備切片制備；另一部分置于-80 ℃保存，用于Western blot檢測。

1.2.7" 指標(biāo)檢測" （1）腸道推進(jìn)率。末次給藥結(jié)束后，各組大鼠禁食過夜以排空腸道內(nèi)容物，每只大鼠按照體質(zhì)量10 mL/kg經(jīng)口灌入10%活性炭懸液。40 min后用3%戊巴比妥鈉，按30 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，并脫頸處死大鼠。立即剖取幽門至直腸末端腸管，在無張力狀況下測量幽門至直腸末端總長度和幽門至炭末前沿的距離，腸道推進(jìn)率=活性炭懸液前沿至幽門的距離/腸道總長度×100%[12]。（2）HE染色觀察結(jié)腸組織病理學(xué)改變。將4%多聚甲醛固定后的結(jié)腸組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，HE染色法制備病理切片，顯微鏡下觀察。（3）免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸c-Kit表達(dá)水平。取大鼠結(jié)腸組織切片，撈片，60 ℃烤片2 h。高壓熱抗原修復(fù)，滴加5% BSA封閉液，室溫封閉20 min，PBS洗3次，2 min/次；滴加c-Kit一抗（1∶200），4 ℃ 過夜，PBS 洗3次，2 min/次；滴加二抗，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，2 min/次；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，透明后封膠觀察。每張切片隨機(jī)選取3個高倍視野（400倍），使用Image J軟件進(jìn)行c-Kit平均光密度（average optical density， AOD）測定。（4）TUNEL染色檢測結(jié)腸Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal， ICC）凋亡情況。取包埋好的組織切片、脫蠟、水化，蛋白酶k孵育10～20 min，PBS洗3次，5 min/次。滴入TUNEL液（45 μL酶溶液和45 μL標(biāo)記液），37 ℃避光孵育1.2 h，PBS洗3次，5 min/次，加入兔抗大鼠c-Kit多克隆抗體，4 ℃過夜，PBS洗3次，5 min/次，加入熒光二抗CY3標(biāo)記山羊抗兔TgG抗體，同時加入DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫孵育60 min，PBS洗3次，5 min/次，熒光顯微鏡下觀察。使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行細(xì)胞凋亡指數(shù)測定。凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。（5）Western blot檢測大鼠結(jié)腸GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平。取出結(jié)腸組織，研磨粉碎，加入裂解液后勻漿、離心取上清液，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，加緩沖液使蛋白變性，制備SDS-PAGE凝膠。通過電泳法分離總蛋白（電壓：80 V）。轉(zhuǎn)膜，搖床上常溫使用封閉液封閉1 h，洗膜3次，每次10 min。孵育一抗：GRP78（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、cleaved Caspase-3（1∶1 000）、β-actin（1∶10 000），4 ℃冰箱過夜，洗膜3次，每次10 min。加入二抗（1：10 000），室溫?fù)u床孵育2 h，洗膜3次，每次10 min。顯色，采集數(shù)據(jù)，使用Image J軟件分析數(shù)據(jù)，以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值，得出目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.8" 統(tǒng)計學(xué)方法" 以Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 28.0、GraphPad Prism 9軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及作圖。計量資料以“x±s”表示，組間計量資料先檢驗(yàn)正態(tài)性和方差齊性，符合正態(tài)分布且方差齊者采用單因素方差分析（組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)），符合正態(tài)分布但方差不齊者采用校正方差分析，不服從正態(tài)分布者用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1" 藥物活性成分及潛在靶點(diǎn)

經(jīng)過篩選，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得56個活性成分；在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫中獲得20個活性成分。剔除2個重復(fù)后，獲得活性成分共計74個，共對應(yīng)492個作用靶點(diǎn)。

2.2" 疾病靶點(diǎn)的篩選

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索得到STC相關(guān)靶點(diǎn)4 317個，通過OMIM數(shù)據(jù)庫檢索得到STC相關(guān)靶點(diǎn)200個，刪除重復(fù)項后得到4 405個疾病相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3" “活性成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

利用R語言將492個藥物作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)的4 405個靶點(diǎn)取交集，得到294個共同靶點(diǎn)。利用Perl語言映射出294個共同靶點(diǎn)的有效成分，借助Cytoscape軟件MCC算法提取前30個節(jié)點(diǎn)構(gòu)建生血通便顆粒“中藥活性成分-STC相關(guān)靶點(diǎn)”可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。由于活性成分名稱較長而不利于繪圖，故本研究在繪圖時以ID代替成分名稱。由圖1可知，MOL000388（γ-氨基丁酸）、MOL000422（山柰酚）、MOL012744（白藜蘆醇）等在生血通便顆粒治療STC中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.4" PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選核心基因

將294個交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，物種選擇人類（Homo sapiens），其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，根據(jù)MCC算法提取前30個基因（圖2）。由圖2可知，CASP3（Caspase-3）、Bcl-2、Bax是STC的核心靶點(diǎn)。同時，Caspase-3、Bcl-2、Bax也是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，說明生血通便顆粒可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡對STC發(fā)揮治療作用。

2.5" 富集分析結(jié)果

運(yùn)用R語言對藥物作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)的294個交集基因進(jìn)行富集分析，設(shè)置Plt;0.05，得到GO富集條目3 297條，其中BP條目2 877條、CC條目171條、MF條目249條。KEGG通路富集條目193條。

2.5.1" GO富集分析" BP注釋主要與對外源性刺激的反應(yīng)、對營養(yǎng)水平的反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等有關(guān)；CC注釋提示相關(guān)作用機(jī)制主要發(fā)生在膜筏、膜微區(qū)、突觸膜等；MF主要包括神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性等。詳見圖3。

2.5.2" KEGG通路富集分析" 在193條KEGG通路中，涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、化學(xué)致癌-受體激活、神經(jīng)活性配體-受體相互作用等方面（圖4）。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選Caspase-3、Bcl-2和Bax凋亡相關(guān)蛋白為STC的核心靶點(diǎn)。結(jié)合富集分析，進(jìn)一步運(yùn)用R語言提取出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工信號通路機(jī)制圖（圖5），可知內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激BiP（又稱GRP78）/CHOP信號通路所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在STC中發(fā)揮重要作用。

2.6" 生血通便顆粒對STC大鼠腸道推進(jìn)率的影響

與正常組相比，模型組大鼠腸道推進(jìn)率明顯降低（Plt;0.01）；與模型組相比，莫沙必利組及生血通便顆粒低、高劑量組大鼠腸道推進(jìn)率顯著提高（Plt;0.01）；與莫沙必利組相比，生血通便顆粒高劑量組腸道推進(jìn)率提高（Plt;0.05）。詳見表1。

2.7" 生血通便顆粒對STC大鼠結(jié)腸組織病理的影響

正常組大鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)清晰，腺體排列規(guī)整，黏膜層未觀察到明顯炎性改變；模型組大鼠結(jié)腸黏膜萎縮、黏膜層變薄，黏膜上皮層有缺失，固有層腺體缺損破壞且數(shù)目明顯減少，黏膜可見炎性改變；與模型組比較，莫沙必利組和生血通便顆粒低、高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較完整，炎性情況有所恢復(fù)，腺體排列較整齊。隨著生血通便顆粒劑量增加，結(jié)腸的病理特征逐漸減弱。詳見圖6。

2.8" 生血通便顆粒對STC大鼠結(jié)腸c-Kit表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織c-Kit表達(dá)顯著降低（Plt;0.01）；與模型組相比，莫沙必利組和生血通便顆粒低、高劑量組大鼠結(jié)腸組織c-Kit表達(dá)顯著升高（Plt;0.01）；與莫沙必利組相比，生血通便顆粒高劑量組c-Kit表達(dá)升高（Plt;0.05）。詳見圖7、表2。

2.9" 生血通便顆粒對STC大鼠結(jié)腸組織ICC細(xì)胞凋亡的影響

正常組可見少許綠色熒光，提示僅有少量ICC凋亡；與正常組相比，模型組大鼠結(jié)腸組織凋亡細(xì)胞綠色熒光增加、c-Kit紅色熒光減少，且ICC凋亡指數(shù)明顯升高（Plt;0.01）；與模型組相比，莫沙必利組和生血通便顆粒低、高劑量組大鼠結(jié)腸組織凋亡細(xì)胞綠色熒光減少、c-Kit紅色熒光增加，ICC凋亡指數(shù)明顯降低（Plt;0.01）；與莫沙必利組相比，生血通便顆粒高劑量組凋亡指數(shù)降低（Plt;0.05）。詳見表3、圖8。

2.10" 生血通便顆粒對STC大鼠結(jié)腸組織GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比，模型組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（Plt;0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.01）；與模型組相比，莫沙必利組及生血通便顆粒低、高劑量組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.01）；與莫沙必利組相比，生血通便顆粒低、高劑量組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01），生血通便顆粒高劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.01）；與生血通便顆粒低劑量組相比，生血通便顆粒高劑量組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見圖9、表4。

3 討論

STC是一種腸道動力障礙性疾病。ICC是一種腸道運(yùn)動的起搏細(xì)胞，廣泛分布于機(jī)體整個消化道的平滑肌細(xì)胞間，目前被廣泛用于STC治療藥物及手段的研究[13]。c-Kit是ICC的特異性蛋白，常被用在鑒定腸道ICC的研究中。近年來大量研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境變化可導(dǎo)致腸道ICC啟動程序性死亡，ICC凋亡是STC發(fā)生的主要機(jī)制之一[14-16]。中藥復(fù)方在治療STC中具有獨(dú)特優(yōu)勢，可修復(fù)ICC超微結(jié)構(gòu)，干預(yù)ICC凋亡，對于腸道傳輸功能具有顯著改善效果[17-18]。經(jīng)本次動物實(shí)驗(yàn)觀察，生血通便顆粒可明顯提高腸道推進(jìn)率、顯著增加結(jié)腸c-Kit陽性表達(dá)、抑制ICC凋亡，但生血通便顆粒高、低劑量組之間作用差異不明顯，濃度梯度的依賴性不強(qiáng)。

本研究中，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在TCMSP數(shù)據(jù)庫與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫分別篩選出生血通便顆粒56個活性成分和20個活性成分，去重后得到共74個活性成分、492個作用靶點(diǎn)。再利用R語言將藥物作用靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到294個共同靶點(diǎn)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)Caspase-3、Bcl-2、BAX等基因是STC的核心靶點(diǎn)。Bcl-2家族通過促凋亡和抑凋亡分子相互作用來控制細(xì)胞的凋亡和存活，是細(xì)胞凋亡研究中最深入廣泛的一類分子[19]。Bax和Bcl-2均屬Bcl-2家族中的成員，Bax參與促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2家族通過促進(jìn)線粒體外膜通透性控制凋亡途徑，使促凋亡因子釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)[20]。Caspase蛋白酶位于細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路的核心位置，直接或間接引起細(xì)胞凋亡結(jié)構(gòu)特征的出現(xiàn)[21]。Caspase-3的活化被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)中不可或缺的一環(huán)[22]。本研究實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠結(jié)腸組織Bax、cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)水平均較正常組升高，Bcl-2較正常組降低，生血通便顆粒可降低Bax、cleaved Caspase-3表達(dá)，增加Bcl-2表達(dá)，其中生血通便顆粒高、低劑量組比較，僅cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)有差異。以上結(jié)果說明生血通便顆粒可能通過調(diào)控凋亡蛋白基因而發(fā)揮作用，且高劑量組對部分凋亡基因的調(diào)控作用相對較強(qiáng)。

KEGG通路富集分析結(jié)果提示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工信號通路涵蓋于生血通便顆粒治療STC的靶向通路中。為進(jìn)一步分析相關(guān)機(jī)制，運(yùn)用R語言提取了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工信號通路機(jī)制圖，發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵靶點(diǎn)中的GRP78、CHOP等均在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路上富集。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年來才被發(fā)現(xiàn)并了解的一種新凋亡途徑[23]。有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的ICC凋亡與胃腸動力障礙密切相關(guān)[24]。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)標(biāo)志著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動，在調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)信號網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用[25]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡的下游關(guān)鍵信號分子[26]。據(jù)報道，內(nèi)質(zhì)應(yīng)激狀態(tài)下，CHOP表達(dá)顯著升高，阻斷細(xì)胞增殖，通過調(diào)節(jié)其下游基因Caspase等誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的細(xì)胞凋亡，也可通過抑制抗凋亡基因Bcl-2和上調(diào)促凋亡基因Bax表達(dá)水平介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。本研究結(jié)果表明，生血通便顆粒顯著抑制了STC大鼠模型結(jié)腸組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路相關(guān)蛋白GRP78、CHOP的表達(dá)，且生血通便顆粒高劑量組抑制作用更明顯，提示生血通便顆粒可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/CHOP通路在細(xì)胞凋亡上對ICC產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，生血通便顆粒可以抑制ICC凋亡，其機(jī)制可能與抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激GRP78/CHOP信號通路，調(diào)控Bax、Bcl-2、cleaved Caspase-3凋亡蛋白表達(dá)有關(guān)。然而，本研究仍存在不足之處，實(shí)驗(yàn)只驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的部分通路以及對應(yīng)的核心靶點(diǎn)，且中藥劑量組梯度分組較少，今后課題組將更加深入地開展動物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步挖掘作用機(jī)制，為生血通便顆粒的臨床應(yīng)用提供更加堅實(shí)的理論依據(jù)。

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