石榴籽油不同極性部位的分離、納米乳制備及生物學活性

摘要：目的 將石榴籽油（pomegranate seed oil， PSO）分離為不同極性部位，并比較生物活性。方法 采用硅膠柱層析法分離出PSO甘油三酯（pomegranate seed oil triglyceride， PSO-TG）和甘油二酯（pomegranate seed oil diglycerides， PSO-DG），用無水乙醇提取PSO，制得富含多酚的PSO（polyphenol enriched pomegranate seed oil， P-PSO）；用自由基清除法考察各油的抗氧化活性；采用濾紙片法檢測油的抗菌能力；將4種油制成納米乳，考察各納米乳對α-糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性。結果 PSO、PSO-DG、PSO-TG和P-PSO的極性順序為P-PSOgt;PSO-DGgt;PSOgt;PSO-TG；對DPPH自由基清除率為P-PSOgt;PSO-TGgt;PSOgt;PSO-DG；PSO-DG對枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）的抑制活性顯著高于其余3種油（Plt;0.05），PSO對少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua）有最強的抗菌作用；納米乳對α-糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用為PSO-DGgt;PSOgt;P-PSOgt;PSO-TG。結論 油的極性影響著其對細菌質膜和細胞壁的穿透能力，以及與酶的親和作用，是油發揮生物活性的關鍵因素。

關鍵詞：石榴籽油；甘油二酯；甘油三酯；多酚油；生物活性

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Isolation， nanoemulsion preparation and biological activity of pomegranate seed oil with different polarity

Luo Jinhua1， Yu Jianqiao1， Liu Hui1， Liang Li1， Zhang Ying1， Xie Hua2， and Yao Qian1

（Key Laboratory for Exploitation of Medicinal and Edible Plant Resources in Sichuan Province， Chengdu University， Chengdu 610106;

2 Sichuan Provincial Institute for Drug Control/NMPA Key Laboratory for Technical Research

on Drug Products In Vitro and In Vivo Correlation， Chengdu 611731）

Abstract Objective The pomegranate seed oil （PSO） into fractions with different polarities was isolated to compare their biological activities. Methods PSO triglyceride （PSO TG） and PSO diglyceride （PSO DG） were isolated by silica gel column chromatography， respectively. Polyphenol-enriched PSO （P-PSO） was prepared by extracting PSO with anhydrous ethanol. The antioxidant activity of the oils was estimated by the radical-scavenging method. The antibacterial capacity was assessed using the filter paper approach. The four oils were formulated into nanoemulsions， and the inhibitory effects of nanoemulsions against α-glucoside and α-amylase were examined， respectively. Results The polarity order was P-PSOgt;PSO-DGgt;PSOgt;PSO-TG. The scavenging rate against DPPH radicals was P-PSOgt;PSO-TGgt;PSOgt;PSO-DG. PSO-DG had a significantly higher inhibitory effect than the other oils against Bacillus subtilis （Plt;0.05）， while PSO possessed the strongest antibacterial activity against yeast （Kazachstania exigua）. The inhibitory strength of nanoemulsions on α-glucoside and α-amylase was PSO-DGgt;PSOgt;P-PSOgt;PSO-TG. Conclusion The polarity of oil could influence its capacity to penetrate through the plasma membrane and cell wall of bacteria， as well as its affinity with enzymes. It is a key factor in the biological activity of oil.

Key words Pomegranate seed oil; Triglyceride; Diglyceride; Polyphenol-enriched oil; Biological activity

石榴（Punica granatum L.）為石榴科多年生落葉灌木或喬木植物。目前，石榴的藥用價值主要是石榴皮，關于石榴籽的認識和使用并不充分。石榴籽約占石榴總重11%，由石榴籽提取而得的石榴籽油（pomegranate seed oil， PSO）富含不飽和脂肪酸，含量為石榴籽重量的7.6%～20%[1]；其中，石榴酸為PSO最主要的不飽和脂肪酸，在脂肪酸中的占比超過60%[2]；PSO中的脂肪酸多以甘油酯的形式存在。此外，PSO富含多酚[3]。研究表明，PSO具有抗氧化，抗菌，降血糖以及抗腫瘤等作用[4-5]，有極大的藥用價值。弄清PSO發揮作用的影響因素對開發利用PSO具有重要的現實意義。

本文采用硅膠柱對PSO進行分離洗脫，得到PSO甘油三酯（triglycerides， TG）和甘油二酯（diglycerides， DG）；以無水乙醇為溶劑提取PSO制得富含多酚的PSO（polyphenolenriched PSO， P-PSO）；以PSO為對照，考察3種油的體外抗氧化、抗菌和降糖活性，以闡明PSO不同極性部位對其藥理作用的貢獻，為PSO物質基礎研究及相關高效低毒產品的開發提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7890B氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；WAY-2WAJ阿貝折光儀（上海易測儀器設備有限公司）；DNM-9602G全自動酶標儀（北京普朗有限公司）；DHP060型恒溫培養箱（上海實驗儀器廠有限公司）；SHZ-B水浴恒溫振蕩器（上海博訊實業有限公司）；RE5203型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；CT14RD臺式高速冷凍離心機（上海天美生化儀器設備工程有限工程）；UV5100B型紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；KQ-400KDE型高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ZEN3600型激光粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司）。

1.2 材料與試劑

石榴籽（批號010170101，中藥世家中藥材有限公司）；石榴酸對照品（實驗室自制，經GC分析純度大于95%）；癸酸甲酯、1.1-二苯基-2-苦肼基（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl， DPPH）（上海麥克林生化科技有限公司）；1-（4-硝基苯基）-1，2，3-丙三醇（p-nitrophenyl-glycerol， pNPG）、α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶（上海源葉生物科技有限公司）；聚氧乙烯蓖麻油植物油（上海阿拉丁公司）。大腸埃希菌（Escherichia coli）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）和少孢哈薩克斯坦酵母（Kazachstania exigua，簡稱少孢酵母）由成都大學生物實驗中心提供。

2 實驗方法

2.1 PSO的提取

取石榴籽，粉碎，過80目篩，稱取一定量的粉末，按1：10的比例加入石油醚，在40 ℃下以400 W功率超聲提取35 min，抽濾，40 ℃下旋轉蒸發除去石油醚，制得PSO[6]。

2.2 PSO-TG和PSO-DG的分離

以硅膠為填充劑裝柱，按硅膠重量的10%將PSO添加至柱頭，使用二氯甲烷-正己烷（2：3）、二氯甲烷、二氯甲烷-乙醚（35：1）、二氯甲烷-乙醚（9：1）、二氯甲烷-甲醇（10：1）及二氯甲烷-甲醇（1：1至1：20）進行洗脫[7]，洗脫量為2倍柱體積，以每管3 mL收集洗脫液，濃縮，進行TLC分析，展開劑為正己烷-乙醚-醋酸（45：25：1），碘蒸氣顯色。由斑點位置確定洗脫物組成[7]，合并PSO-TG和PSO-DG，旋轉蒸發除去溶劑，稱重，與上樣量作比較，計算TG和DG在PSO中的含量。

2.3 P-PSO的制備

取PSO 5 mL，加入25 mL無水乙醇，混勻，于40 ℃下超聲提取40 min，取醇層；平行操作3次，合并提取液，于50 ℃下減壓蒸發除去乙醇，得P-PSO；稱重，計算P-PSO在PSO中的比例。

2.4 介電常數與折光率測定

取不同極性部位的PSO，用自制電容板測定介電常數；用阿貝折光儀測定樣品折光率。

2.5 含量測定

2.5.1 脂肪酸組成

取PSO、PSO-TG、PSO-DG及P-PSO各15 mg，置具塞試管中，加入4 mL濃度為0.5 mol/L的甲醇-氫氧化鈉溶液，在70 ℃水浴下加熱5 min進行甲酯化反應，冷卻至室溫，甲醇定容至4 mL，用濃HCl調pH至4～5，加入癸酸甲酯內標，用正己烷提取3次，每次2 mL，合并提取液，濾過，取續濾液1 μL，注入GC儀。

GC測定條件為：載氣為高純氮氣，柱流量

1.2 mL/min，進樣口溫度270 ℃，分流比20：1；FID溫度310 ℃。柱溫采用程序升溫，初始溫度90 ℃，保持3 min，以15 ℃/min升至180 ℃，保持10 min，以2.5 ℃/min升至250 ℃。以峰面積歸一化法計算各脂肪酸百分含量[8]。

2.5.2 多酚含量測定

分別取0.5 mL PSO及P-PSO，依次加入3.5 mL稀釋10倍的Folin酚溶液，混勻，靜置5 min，加7.5%碳酸鈉溶液（W/V）2.5 mL，混勻，30 ℃下反應30 min，用蒸餾水稀釋至10 mL，搖勻，于760 nm波長處測定吸光度值[9]。以沒食子酸標準曲線計算多酚含量。

2.6 PSO不同極性部位的抗氧化活性

用無水乙醇配制濃度為0.02 mg/mL的DPPH自由基溶液。取不同體積PSO、PSO-TG、PSO-DG及P-PSO，分別置于試管中，加入200 μL異丙醇使溶解，用無水乙醇補充至1 mL，混勻，加DPPH溶液2 mL，搖勻，室溫暗處放置30 min，于517 nm處測定吸光度值A。以無水乙醇作空白對照，同前操作，測得的吸光度值記為Ao。按照公式（1）計算DPPH清除率[10]；維生素E（VE）為陽性對照。

清除率（%）=（A0-A）/A0×100% （1）

2.7 PSO不同極性部位的抗菌活性

大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌使用牛肉膏蛋白胨培養，少孢酵母使用酵母浸出粉胨-葡萄糖培養。以DMSO為溶劑分別稀釋各油得到濃度為60%、30%和15%的系列稀釋液。吸取10 μL樣品溶液，加至直徑約為7 mm的濾紙片上；各細菌用培養液稀釋至密度為105 CFU/mL，取100 μL，平鋪于培養基上，待上層液體膠凝后，將紙片放入其中，于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑。以溶劑DMSO為陰性對照，以3 mg/mL頭孢噻肟鈉為大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的陽性對照；少孢酵母的陽性對照為10 mg/mL水楊酸。每個濃度水平重復測定3次[10]。

2.8 PSO不同極性部位的降糖活性

2.8.1 納米乳的制備

分別以PSO、PSO-TG、PSO-DG及P-PSO為油相，聚乙二醇400為助乳化劑，聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑，按植物油-乳化劑-助乳化劑（V：V：V，1：4：4）將3者混合均勻，在40 ℃攪拌下滴加3倍體積的蒸餾水，加畢，繼續攪拌30 min，制得呈藍色乳光、油濃度為1 mg/mL的納米乳[6]。用蒸餾水稀釋納米乳，使得油濃度為0.0625～1 mg/mL。同時按處方制備僅含聚乙二醇400和聚氧乙烯蓖麻油的對照溶液，并同法稀釋。

2.8.2 粒徑與Zeta電位

采用馬爾文激光粒度測定儀測定各納米乳的粒徑及Zeta電位。

2.8.3 對α-糖苷酶的抑制活性

取96孔板，分別加入不同濃度樣品液50 μL，

0.1 U/mL的α-葡萄糖苷酶100 μL，混勻，37 ℃下水浴加熱15 min，加1 mmol/L的底物pNPG 50 μL，37 ℃下繼續反應15 min，加0.2 mmol/L碳酸鈉溶液50 μL終止反應，冷卻，于405 nm波長處用酶標儀測定吸光值（A1）；分別以0.1 mmol/L PBS溶液（pH6.8）和各對照溶液50 μL代替pNPG及樣品溶液，同法操作，測得的吸光度值分別記為Ab（背景值）和A0，按公式（2）計算對α-糖苷酶的抑制率[11]；以阿卡波糖為陽性對照。

抑制率（%）=（A1-Ab）/A0×100%（2）

2.8.4 對α-淀粉酶的抑制活性

取96孔板，分別加入pH6.8 PBS溶液50 μL，各樣品溶液25 μL和0.27 mg/mL的α-淀粉酶溶液25 μL，于37 ℃下孵育10 min；加1%淀粉溶液（W/V）50 μL，繼續37 ℃下孵育30 min。加3，5-二硝基水楊酸試液100 μL，85～90 ℃下水浴加熱10 min，冷至室溫，在540 nm波長處測定吸光度值（A1）；分別以PBS緩沖液及各對照溶液代替二硝基水楊酸試液和樣品溶液，同法操作，測得Ab和A0，按公式（2）計算對α-淀粉酶的抑制率[12]。

3 結果

3.1 PSO-TG、PSO-DG和P-PSO的制備

PSO-TG與PSO-DG的薄層鑒別見圖1。由圖可知，TG與DG的分離較為完全。PSO-TG、PSO-DG和P-PSO在PSO中的占比分別為76.16%、6.77%及29.25% ，可見，PSO中的脂肪酸主要以甘油三酯的形式存在，與文獻報道一致[7]。

3.2 介電常數和折光率

結果見表1。由表1可知，4種油的極性順序為P-PSOgt;PSO-DGgt;PSOgt;PSO-TG，折光率與油的極性也有較好的相關性。

3.3 含量測定

3.3.1 脂肪酸組成

對PSO、PSO-DG、PSO-TG及P-PSO重復測定6次，各脂肪酸相對百分含量的RSD均小于3%，說明方法有較好的重復性。4種油的脂肪酸組成見表2。由表可知，石榴酸在4種油中占比都在78%以上，其中在PSO及PSO-TG中達到85%以上，此外，極性油PSO-DG和P-PSO中油酸和亞油酸比例較大。

3.3.2 多酚含量

多酚測定的標準曲線方程為：Y=0.0138X+0.0274 （R2=0.9995），沒食子酸在1.25～40 μg/mL范圍內，濃度與吸光度值的線性關系良好。P-PSO與PSO的多酚含量測定結果分別為（1471.2±3.82）及（138.24±1.70） μg/mL?？梢奝-PSO較原油多酚含量提高了9.6倍。

3.4 不同極性PSO的抗氧化活性

結果見圖2。在濃度0.3%時4種油對DPPH自由基的清除能力為P-PSOgt;PSO-TGgt;PSOgt;PSO-DG，PSO-DG清除率顯著低于另外3種油。在濃度小于0.8%時，4種PSO的清除率均顯著高于VE油（Plt;0.05）；濃度達0.8%時，除P-PSO清除率較高外，其余3種油的抗氧化活性與VE油類似（P＞0.05）。這是因為4種油在濃度為0.4%時清除率即達平衡，此后繼續增大油濃度，清除率無明顯變化；VE油在含量0.8%以下清除率隨濃度增加而直線增大，在0.8%時達平衡，各油平衡狀態的最大清除率差異較小。

3.5 PSO不同極性部位的抗菌活性

不同極性PSO對3種菌的抑菌活性如圖3所示。油的抑菌活性隨濃度增大而增強；各PSO對不同細菌的抗菌活性有較大差異；對大腸埃希菌，對照頭孢噻肟鈉的抑菌作用顯著高于各植物油（Plt;0.05）；濃度為15%時不同PSO的抑菌活性相當；濃度30%時，PSO-TG對大腸埃希菌的抑制作用顯著低于另外3種油（Plt;0.05）；濃度60%時抑菌順序為PSO DGgt;PSO， P-PSOgt;PSO TG（Plt;0.05），TG表現出了最弱的抑菌能力。

對革蘭陽性菌枯草芽胞桿菌，頭孢噻肟鈉的抑菌作用顯著高于各植物油（Plt;0.05）；各PSO不同濃度下的抑菌活性均為PSO DGgt;PSO， P-PSOgt;PSO TG（Plt;0.05），DG作用最強，TG活性最弱。

對少孢酵母，水楊酸的抑菌活性顯著高于各植物油（Plt;0.05）；在各濃度下，PSO具有最強的抑菌作用，其次為PSO-DG。

3.6 PSO不同極性部位對糖苷酶的抑制作用

3.6.1粒徑與Zeta電位

PSO不同極性部位制備的納米乳的粒徑與Zeta電位如表3所示。各納米乳粒徑均在30 nm以下，PDI在0.2左右，說明粒徑較均勻；PSO與PSO-DG納米乳基本不帶電，PSO-TG與P-PSO納米乳荷少量負電。

3.6.2 對α-糖苷酶的抑制活性

PSO不同極性部位納米乳對α-糖苷酶的抑制作用如圖4A所示。在濃度低于0.25 mg/mL時，隨著油濃度的增加，納米乳對糖苷酶的抑制活性增大；當濃度達0.25 mg/mL，抑制率達平衡，此后繼續增大油濃度，抑制率基本保持不變。阿卡波糖的抑制率顯著高于不同極性的PSO納米乳（Plt;0.05），各納米乳的抑制率順序為PSO-DGgt;PSOgt;P-PSOgt;PSO-TG。

3.6.3 對淀粉酶的抑制活性

PSO不同極性部位納米乳對α-淀粉酶的抑制作用如圖4B所示。不同極性的PSO納米乳對淀粉酶的抑制作用也呈現濃度依賴性，隨濃度增加而增大，當濃度升至0.5 mg/mL 時，抑制率達穩態，繼續增大油濃度，抑制率基本保持不變。阿卡波糖對淀粉酶的抑制活性顯著高于不同極性的PSO納米乳（Plt;0.05），各納米乳的抑制作用為PSO-DGgt;PSOgt;P-PSOgt;PSO-TG。

4 討論

甘油酯的極性順序為甘油一脂gt;DGgt;TG，因此在硅膠薄層板上Rf值為TGgt;DGgt;甘油一酯；隨著洗脫液極性逐漸增大，依次洗脫下蠟質、TG、DG和甘油一酯，根據斑點位置可對甘油酯的種類進行判斷，合并同一類型的洗脫液，減壓蒸餾除去溶劑，制得PSO-TG和PSO-DG；由于甘油一酯含量過低，而未對其進行分析。

介電常數主要反映分子的偶極矩，偶極矩越大，分子的極性越大；折光率為光線在空氣與介質中的傳播速率比；介質澄清度越高，折光率越大，根據此性質，可以檢測PSO中的油和蠟質含量[13]；折光率還與油中的不飽和脂肪酸含量相關，不飽和脂肪酸含量越大，折光率越高[14]。PSO與PSO-TG折光率近似，但介電常數相差較大，說明介電常數能更準確地反映油的極性；P-PSO與PSO-DG均具有較大的折光率，表明極性大的油澄清度較高。

4種油對DPPH自由基的清除能力為P-PSOgt;PSO-TGgt;PSOgt;PSO-DG，P-PSO中富含多酚，PSO-TG和PSO-DG的石榴酸含量分別為最高和最低，顯示不同PSO的抗氧化活性與多酚和石榴酸含量有較大的相關性，實驗同時發現，不同極性PSO的抗氧化活性均顯著高于VE油，這可能與PSO的主成分石榴酸有關，石榴酸為含3個共軛雙鍵的C18酸，極易氧化，對自由基有很強的清除能力[15]。

此外，石榴酸能夠抑制不同類型細菌的生長，其在高濃度下對革蘭陰性菌的抑制作用可與頭孢噻肟鈉媲美[8]。PSO-DG石榴酸含量相對較低，但其對大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌的抗菌活性顯著高于其余3種油（Plt;0.05）；PSO-TG石榴酸含量為最高，而抑制3種菌的作用為最弱，顯示了油的極性對抗菌活性的重要性。適宜的極性利于油穿過細菌細胞壁和細胞膜，發揮抗菌作用，引起細菌死亡；PSO-TG極性過小，而P-PSO極性太大，均不利于與細菌的相互作用，導致其抑菌活性弱于PSO-DG和PSO。

董葛等[16]采用濾紙片法考察了艾油與枸杞提取液聯合使用對不同菌株的抗菌活性，發現對單一菌株，抑菌順序為艾油gt;聯合應用gt;枸杞提取液。彭燕等[17]的研究結果顯示，香草根油對金黃色葡萄球菌和枯草芽胞桿菌有很強的抑制作用，對大腸埃希菌無作用；梁青等[18]考察了山蒼子油對白假絲酵母的抗菌活性，發現山蒼子油可能通過破壞細菌細胞壁和細胞膜，使其大分子外泄，引起細菌死亡。細菌對不同植物油的敏感性有較大差異，植物油破壞細菌細胞壁的能力與油的哪些性質相關，值得深入探討；本實驗顯示，油的極性將影響油與細菌細胞壁和細胞膜的相互作用，是其發揮藥效的關鍵因素，為開發以植物油為基礎的藥物與保健食品提供了重要指導。

由于油不溶于水相介質，加入糖苷酶和淀粉酶體系引起溶液渾濁，而無法進行定量分析。因此將PSO的不同極性部位制成納米乳，再加至酶測定體系，并以不含油、僅含乳化劑和助乳化劑的溶液為對照。納米乳在水中溶解度好，體系澄清，可采用比色法進行定量分析。PSO-DG納米乳對α-糖苷酶和α-淀粉酶有最強的抑制作用，其次為PSO納米乳，PSO-TG納米乳抑制能力最弱，表明適宜的極性也是PSO系列納米乳抑制酶活性的關鍵，PSO-TG脂溶性過大，P-PSO極性過大，均降低了與酶的親和力，引起抑制力減弱。此外，PSO-TG與P-PSO荷少量負電荷，可能也影響了與酶的結合。PSO系列納米乳對二種酶均顯示了抑制活性，可作為包載降糖藥的載體，發揮協同降糖的作用。

綜上，4種油的極性順序為P-PSOgt;PSO-DGgt;PSOgt;PSO-TG，抗氧化活性為P-PSOgt;PSO-TGgt;PSOgt;PSO-DG，表明多酚和石榴酸是PSO抗氧化的主要成分；PSO-DG對枯草芽胞桿菌有最強的抑制作用，PSO對少孢酵母抑制活性最強，PSO-TG的抗菌作用最弱，表明油的抑菌效果與其極性密切相關；納米乳對α-糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用為PSO-DGgt;PSOgt;P-PSOgt;PSO-TG，說明油的極性也是影響納米乳抑酶作用的關鍵因素。本實驗顯示PSO的多種生物活性與其極性密切相關。

參 考 文 獻

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