宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合DNA 倍體分析在宮頸癌篩查中的應(yīng)用分析

車愛文，陳淑蘋，羅 佳

（深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院病理科，廣東 深圳 518172）

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均有上升趨勢。2022 年國家癌癥中心報(bào)告[1]，我國子宮頸癌新發(fā)病例119 300 例，此病是女性惡性腫瘤中第五位高發(fā)腫瘤；因子宮頸癌死亡病例37 200例；特別是在15 ～44 歲女性中，宮頸癌無論是新發(fā)病例還是死亡病例均為第三位。世界衛(wèi)生組織（WHO）在2020 年11 月提出了消除子宮頸癌的全球戰(zhàn)略。目前，“三階梯篩查法”廣泛應(yīng)用于宮頸疾病的診斷，即人類乳頭瘤病毒（HPV）檢測和/或?qū)m頸細(xì)胞學(xué)檢查、陰道鏡檢查和宮頸活檢病理學(xué)診斷。但宮頸細(xì)胞學(xué)檢查因受細(xì)胞病理診斷醫(yī)師主觀性影響，不同地區(qū)、不同醫(yī)院的細(xì)胞學(xué)診斷水平存在顯著差異。此外，HPV 檢測具有高靈敏度、低特異性。所有這些因素都限制了宮頸癌篩查的有效性。如何在初篩過程中選擇合適、有效的方法，以達(dá)到更高的靈敏度和特異性，減少對細(xì)胞病理學(xué)家的依賴，值得更深入地探討。DNA 倍體分析的出現(xiàn)引起了廣泛關(guān)注。DNA 倍體分析是通過定量檢測和分析樣本中人體細(xì)胞的細(xì)胞核中DNA 含量或染色體倍數(shù)來判斷是否存在癌變或癌前病變的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為腫瘤的惡性程度提供參考依據(jù)。DNA 倍體分析利用Feulgen 染色，其是一種DNA 定量染色、特異性染色，染色液的染料分子可以和酸化水解后的DNA 上的醛基相結(jié)合而顯色，染色強(qiáng)度與DNA 濃度成正比。通過特異性染色對細(xì)胞核內(nèi)DNA進(jìn)行定量，并體現(xiàn)為積分光密度的差異，最后由分析軟件對其進(jìn)行分析和掃描，轉(zhuǎn)化為數(shù)字化DI 值，最終為腫瘤細(xì)胞的早期檢測提供依據(jù)。這可以在不依賴細(xì)胞病理學(xué)家的情況下對宮頸癌進(jìn)行初步篩查。理論上，該技術(shù)可用于機(jī)會(huì)性篩查，也可推廣至中國政府組織的“兩癌篩查”項(xiàng)目。

1 材料和方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析2020 年1 月1 日至2022 年12 月31 日深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院門診患者宮頸薄層液基細(xì)胞學(xué)（TCT）資料共39 530 例和27 843 例DNA 倍體資料。患者所有的信息均匿名。項(xiàng)目執(zhí)行時(shí)間為2020年1 月1日至2022 年12 月31 日。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：（1）存在性行為史；（2）未懷孕；（3）無宮頸癌、CIN 病史及宮頸手術(shù)史；（4）未合并淋病、急性盆腔炎疾病者；（5）事先充分了解研究目的和細(xì)節(jié)，同意接受宮頸癌篩查并自愿參與本研究。本研究經(jīng)深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取樣時(shí)患者采取截石位，由婦科醫(yī)師用擴(kuò)陰器擴(kuò)開陰道，先用棉拭子擦干子宮頸口過多的分泌物。在宮頸口鱗狀上皮交界處，用液基細(xì)胞學(xué)采樣刷順時(shí)針或逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)3 ～5 圈，將樣本采集器刷頭放在標(biāo)本固定液中。

1.2.2 TCT 檢測 將采集的標(biāo)本利用沉降式法制成液基薄層細(xì)胞涂片。由2 位具有3 年以上經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師共同閱片。采用液基細(xì)胞學(xué)TBS 診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類：未見上皮內(nèi)病變或惡性病變（NILM）、意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-US）、不除外高級別鱗狀上皮內(nèi)病變的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASC-H）、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、鱗狀細(xì)胞癌（SCC）、意義不明確非典型腺細(xì)胞、傾向腫瘤的非典型腺細(xì)胞、腺癌。本研究將TCT 診斷中不屬于NILM 者定義為陽性。

1.2.3 DNA倍體檢測 DNA倍體檢測具體過程如下：（1）固定。將標(biāo)本片置入染色缸中加無水乙醇固定15 min，固定細(xì)胞形態(tài)，回收無水乙醇一次（固定細(xì)胞形態(tài)）。（2）以BS 液固定15 min，固定細(xì)胞內(nèi)非特異性物質(zhì)，回收BS液一次（固定細(xì)胞中的非特異性物質(zhì)）。（3）水洗3～5次，盡量控干水分。（4）酸化水解。以5N·HCL 酸解60 min（25C），目的是打開DNA 雙鏈（酸化水解，打開DNA雙鏈，暴露堿基對上的醛基，然后洗去染液）。（5）水洗3 ～5 次，盡量控干水分。（6）行DNA 染液67 min（25C），避光（DNA 染液與暴露的醛基結(jié)合使細(xì)胞核著色）。（7）水洗6 ～8 次，盡量控干水分。（8）脫水。以無水乙醇脫水8 min。（9）吹干、貼條形碼，以中性樹膠封片。將DNA 倍體分析系統(tǒng)用于掃描細(xì)胞載玻片，正常細(xì)胞安裝在載玻片上作為對照。系統(tǒng)根據(jù)核染色體分布、形態(tài)特征、局部特異性特征等參數(shù)對受檢細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分類計(jì)數(shù)。判讀分類標(biāo)準(zhǔn)如下，DNA 倍體異常細(xì)胞指DNA 含量在5C 以上的細(xì)胞。N 指的是DI ＞5.0 的細(xì)胞數(shù)：N=0，未見DNA 倍體異常細(xì)胞；0 ＜N ＜3，可見少量DNA 倍體異常細(xì)胞；3 ≤N ＜15，可見DNA倍體異常細(xì)胞；N ≥15，可見大量DNA 倍體異常細(xì)胞。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT 診斷結(jié)果分析

NILM 占87.68%（34 660/39 530），ASCUS 占9.06%（3583/39 530），ASC-H 占0.51%（203/39 530），LSIL占3.43%（1357/39 530），HSIL 占0.54%（215/39 530），SCC 占0.005%（2/39 530），AGC 占0.20%（79/39 530）。

2.2 DNA 倍體檢測結(jié)果分析

DNA 倍體檢測中，陰性患者占88.71%（24 700/27 843），可疑陽性患者占7.22%（2010/27 843），陽性患者占4.07%（1133/27 843）。

2.3 TCT診斷結(jié)果與DNA 倍體檢測結(jié)果特點(diǎn)分析

對TCT 診斷結(jié)果與DNA 倍體檢測結(jié)果特點(diǎn)進(jìn)行分析。TCT 檢測及DNA 倍體結(jié)果以陰道鏡病理活檢LSIL以上為陽性。LSIL 以上陰道鏡病理診斷一共383 例，TCT 與DNA 倍體檢測相符的陽性病例有258 例，TCT與DNA 倍體檢測相符的陰性病例有73 例，兩者不符的病例分別是39 例和13 例。Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，χ2=13.000，P＜0.01。結(jié)果如表1 所示。

表1 TCT診斷結(jié)果與DNA 倍體檢測的相互關(guān)系

3 討論

發(fā)展中國家女性生殖道惡性腫瘤很普遍。中國每年新增病例約13.15 萬例，占全球?qū)m頸癌新發(fā)病例總數(shù)的26.3%[2]。近年來，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均呈穩(wěn)定上升趨勢，且具有年輕化趨勢。我國普通女性人群HPV 感染的2 個(gè)感染高峰為＜25 歲及41 ～45 歲[3]。

目前，宮頸癌篩查主要的方法是TCT 檢測和HPV檢測，深圳市龍崗區(qū)開展的“兩癌篩查”的項(xiàng)目，先進(jìn)行HPV 檢測，HPV 檢測陽性再進(jìn)行TCT 檢測或組織活檢診斷。HPV 檢測靈敏度高但假陽性率高，增加了初篩的負(fù)擔(dān)，降低了其成本效益。此外，HPV 檢測的費(fèi)用也很高。對于經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，推廣HPV 檢測難度過大。我國人口眾多、地域遼闊，資源分配不均，且不同人群、不同地區(qū)之間的HPV 感染型別分布存在較大差別，這又給宮頸癌篩查標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一帶來了困難。TCT 檢查是目前宮頸癌篩查的主要方法之一，具有特異性高的優(yōu)點(diǎn)。

本研究中對TCT 細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，一共有39 530 例病人進(jìn)行TCT 檢測，NILM 占87.68%（34 660/39 530），ASCUS 占9.06%（3583/39 530），ASC-H占0.51%（203/39 530），LSIL 占3.43%（1357/39 530），HSIL 占0.54%（215/39 530），SCC 占0.005%（2/39 530），AGC 占0.20%（79/39 530）。陽性病例占12.32%，其結(jié)果與以前的研究結(jié)果一致。但TCT 檢測依賴于細(xì)胞病理學(xué)家，不同地區(qū)、不同醫(yī)院的診斷水平參差不齊，其靈敏性波動(dòng)較大，為11.11%～87.00%[4]，可重復(fù)性低，可能漏診，也可能過度診斷。迫切需要尋找一種不依賴細(xì)胞病理學(xué)家、具有可接受的靈敏度和特異性、可用于大規(guī)模人群宮頸癌篩查的篩查方法。

DNA 倍體分析可測量細(xì)胞核的DNA 含量，判斷核DNA 倍性異常[5]。這種檢測方法不需要依賴病理學(xué)家，可以實(shí)現(xiàn)定量和定性分析。

Guo Yulin 等[6]研究團(tuán)隊(duì)利用了較大樣本開展HPV檢測、TCT 細(xì)胞學(xué)檢測及DNA 倍體檢測3 種方法在宮頸癌篩查中應(yīng)用的研究。研究發(fā)現(xiàn)，通過比較3 種方法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值發(fā)現(xiàn)，HPV 檢測的敏感性高于TCT 和DNA 倍體分析，而特異性明顯較低。有研究發(fā)現(xiàn)DNA 倍體分析的特異性很高，優(yōu)于HPV 檢測，且認(rèn)為DNA 倍體分析和TCT的效率沒有區(qū)別。本研究發(fā)現(xiàn)在DNA 倍體檢測中，陰性患者占88.71%（24 700/27 843），可疑陽性患者占7.22%（2010/27 843），陽性患者占4.07%（1133/27 843）。可疑陽性率及陽性率均較高，提示DNA 倍體檢測具有較高的敏感性。發(fā)現(xiàn)DNA 倍體分析敏感性明顯高于TCT，尤其是在生殖道炎癥等的情況下也呈高表達(dá)，這給患者帶來較大的心理負(fù)擔(dān)。Guo Yulin 等[6]研究團(tuán)隊(duì)為了進(jìn)一步評估DNA 倍體分析在宮頸癌初篩中的應(yīng)用，還比較了TCT檢測與DNA 倍體分析聯(lián)合檢測在宮頸癌篩查中的作用，以評估將DNA 倍體分析應(yīng)用于大規(guī)模人群篩查的可行性。認(rèn)為DNA 倍體分析可用于宮頸癌的初步篩查，特別是在細(xì)胞病理學(xué)家缺乏的地區(qū)和政府組織的大規(guī)模人群篩查中。此外，從價(jià)格上看，DNA 倍體分析的成本和成本/效果比均低于細(xì)胞學(xué)檢測，熟悉該方法的工作人員培訓(xùn)周期短，約10 個(gè)工作日，比病理醫(yī)師的培訓(xùn)周期短得多。DNA 倍體分析的檢測速度也很快，平均每套250 個(gè)樣本/天。而且本研究利用LSIL 以上陰道鏡病理診斷一共383 例，發(fā)現(xiàn)TCT 聯(lián)合DNA 倍體檢測，其敏感性及特異性明顯提高，對宮頸癌的篩查及預(yù)防更有效。

本研究回顧性分析了近3 年深圳市龍崗區(qū)婦幼保健院就診的患者宮頸細(xì)胞學(xué)及DNA 倍體特征，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合使用，宮頸癌篩查的敏感性及特異性均提高。但本研究存在一些不足之處。首先，數(shù)據(jù)來源于近3 年的篩查結(jié)果，屬于回顧性分析，缺乏長期的動(dòng)態(tài)觀察。此外，樣本量有限，結(jié)果可能無法準(zhǔn)確反映整個(gè)地區(qū)宮頸癌的篩查情況。因此，在后續(xù)研究中，將擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)監(jiān)測宮頸癌篩查，為宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)及預(yù)防找出更有效的篩查方法。