皮膚真菌檢查中熒光染色法與KOH 法的應用比較分析

孫 偉

（臨沂市皮膚病醫院，山東 臨沂 276004）

真菌在自然界中分布非常廣泛，大部分對人類有益或間接有益，但是也存在少部分致病性真菌[1]。對于因致病性真菌造成的感染可按照侵犯位置的不同將其分成淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病是指致病真菌或條件感染皮膚、毛發等淺表組織而引發的疾病；深部真菌病是指致病真菌或條件侵犯皮下組織、內臟、黏膜，從而造成器官感染，如白色念珠菌。真菌感染容易傳播和交叉感染，因此需要臨床快速診斷并開展治療[2]。濕片法和染色法是快速檢測淺部真菌感染的主要方法，其中又以KOH 濕片法、熒光染色法更為常見。KOH 濕片法步驟簡單、經濟成本低，但是在常規顯微鏡下無法識別真菌與角質細胞等雜質，且查找相對費事，對操作人員的水平要求也相對較高，容易造成漏診或誤診。真菌熒光染色法近些年來被廣泛地應用于皮膚淺部真菌檢測中[3]。本次研究將兩種方式的檢測結果進行對比分析，旨在為尋找效果更理想的檢測方法提供參考，現將結果做出如下報告：

1 資料與方法

1.1 一般資料

將我院2021 年1 月至2023 年6 月皮膚科門診接收的高度疑似真菌感染的605 例患者收取標本進行研究，其中男性患者325 例、女性患者280 例，年齡4 ～70 歲，平均年齡（35.78±6.89）歲。取材位置：頭面部136 例、體股部164例、手足部179例、外陰48例、甲屑標本78例。

1.2 納入和排除標準

納入標準：（1）患者自愿加入研究且能夠配合；（2）檢查前12 ～24 h 避免洗澡，7 天內未使用潤膚劑、抗菌肥皂、洗滌劑。

排除標準：（1）4 周內有抗真菌藥物或含有抗真菌成分藥物使用史；（2）患有局部嚴重細菌感染；（3）長期使用免疫抑制劑、糖皮質激素的患者。

1.3 研究方法

收取研究對象605 例患者的標本，分別采用熒光檢測法和KOH 濕片法檢測，對比檢測結果。同時對比兩組患者的相關炎性因子和T 淋巴細胞亞群水平。

（1）試劑材料：KOH 濕片法使用的真菌熒光染色試液試劑（生產廠家：南京漢瑞生物科技有限公司，規格：10 mL）的主要成分：氫氧化鉀（KOH）、氫氧化鈉、氯化鈉、水溶性熒光增白劑、純化水。（2）取材：將無菌棉簽蘸取75%乙醇浸潤及消毒皮損處，每處取兩份標本。①皮膚癬部可先用帶柄刮刀將皮疹的邊緣刮掉，如果患處涂有藥物需要先擦掉，獲取下層皮屑，敏感部位可粘貼透明膠帶獲得，將獲取的標本隨機放在玻璃片上；②頭部病變使用帶柄刮刀刮取獲得或斷發；③指甲（趾甲）使用帶柄刮刀獲得病變位置的甲屑或甲溝內的分泌物；④面部病變使用帶柄刮刀收取紅色丘疹內容物或使用透明膠紙粘取皮屑。（3）檢測步驟：①熒光檢測法。將裝有皮損標本的載玻片置于水平位置，滴入1 滴染色液，需覆蓋或淹沒整個樣品，染色液與樣品充分融合后蓋好蓋玻片，吸去多余的染液，使用250 ～400 nm 濾鏡的熒光顯微鏡觀察。②KOH 濕片檢測法。將載玻片放置水平位置后滴入1 滴15%的KOH，需覆蓋或淹沒整個樣品，蓋好蓋玻片，使用酒精燈稍稍加熱至溶解，使用顯微鏡觀察。

1.4 結果判讀

熒光染色法：顯微鏡下呈現強熒光細胞組織可高度懷疑存在真菌成分，若可以觀察到菌體結構，呈現弱熒光則可能為細菌或者其他組織。

KOH 濕片法：使用15%KOH 浸泡皮損樣本后，顯微鏡下觀察有明顯透亮或淺綠色，有孢子或者菌絲形態的則可判定為陽性。

1.5 統計學方法

本次研究使用的統計學軟件為SPSS 28.0，以n（%）表示計數資料，使用χ2檢驗，以±s表示計量資料，采用t檢驗，以P＜0.05 表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法的效果對比

熒光染色法檢測效果見圖1，鏡下可清晰觀察真菌的輪廓與菌絲，真菌輪廓呈現亮藍色，菌絲與周圍的背景容易分辨；KOH 濕片法檢測效果見圖2，背景昏暗并且較為雜亂，反差比較小，真菌的結構與雜質之間無法清晰鑒別。

圖1 真菌熒光鏡檢（×400）

圖2 KOH鏡檢（×400）

2.2 兩種檢測方法不同位置的檢測情況對比

熒光染色法的總陽性率為42.48%（257/605），明顯高于KOH 檢測法的22.81%（138/605），數據對比差異有統計學意義（χ2=53.2261，P＜0.05），不同部位的檢測結果中熒光染色法的陽性率均高于KOH 法（P＜0.05），見表1。

表1 兩種方法不同位置的檢測情況對比

2.3 兩種檢測方法在不同疾病檢測中的結果對比

熒光染色法對于不同感染的檢出率均高于KOH 濕片法，數據對比具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩種檢測方法在不同疾病檢測中的結果對比

3 討論

3.1 檢測結果討論

隨著近些年來真菌感染病例的逐漸增加，臨床對于真菌檢測的準確性要求也逐漸增高。真菌涂片鏡檢及真菌培養是判斷真菌感染的金標準，也是檢驗基礎。10%～20%的KOH 浮載液是真菌直接鏡檢中最常用的，KOH 可以溶解標本的人體細胞，但是對真菌無著色效果，在檢驗淺部的標本（如甲屑和毛發標本）時，由于其中含有多種纖維、皮屑以及細胞等雜質，鏡下的視野背景多雜亂不清，不容易分辨真菌結構[4]。有報道顯示[5]，KOH 鏡檢法的檢測陽性率約在22%～77%之間。本次實驗的結果顯示KOH 濕片鏡檢陽性率為22.81%，與他人研究結果相似。KOH 的鏡檢準確率非常依賴樣本的數量以及操作人員的技術水平，若標本中含有與真菌或孢子結構類似的氣泡、纖維、脂肪等干擾物，會極大增加分辨的難度。此外，KOH 對甲屑的溶解率比較低，鏡下能見度不高也是造成該方法檢出率低的重要因素之一[6]。真菌熒光染色檢測法隨時通過特殊的熒光染料與真菌細胞壁的幾丁質及葡聚糖特異性結合，僅需十秒鐘的反應時間，具有較高的親和力。通過顯微鏡特定激光波段觀察，經過熒光染色的真菌具有明亮的輪廓，與黑暗的背景有鮮明的反差，且菌絲或孢子會呈現藍綠色的熒光，形態結構非常清晰，便于操作人員尋找和觀察。本次研究中熒光染色法的檢測陽性率為42.47%，明顯高于KOH 檢測法（P＜0.05），進一步證明了其優勢。此外，熒光染色的原理也讓其具有廣闊的應用范圍，無論是淺部真菌或是深部真菌病都可以檢測。與KOH 檢測相比，熒光染色法在滴加染液后等待1 min 左右即可觀察，而KOH 需要使用酒精燈加熱；熒光染料對于脂肪、氣泡不會著色，所以不會產生干擾，且與KOH 鏡下存在多種雜質的背景相比，熒光染色鏡下背景多為黑色，更容易分辨真菌結果。此外，真菌熒光染色法對技術人員的操作度與熟練度要求相對較低，操作簡單、快速，可以極大提高檢測人員的工作效率。本次研究中熒光染色法在馬拉色毛囊炎中的檢出率高達77.00%，正是因為熒光染色法能夠快速的辨認孢子菌，在濕疹、皮炎等非真菌感染的疾病中，由于同樣存在馬拉色孢子菌聚集感染的情況，所以熒光染色法的檢出率也均高于KOH 檢測法。

3.2 檢測意義分析

皮膚作為人體最大的器官，總重量約占個體體重的16%。皮膚是由上皮部分和結締組織組成的，上皮部分是由外胚層分化而來，稱為表皮，而結締組織是由中皮層分化，可以分為真皮及皮下組織[7]。皮膚作為人體與環境間重要的屏障，不僅可以保護體內器官與組織免受外界有害因素的侵襲，還可以阻止組織內的營養物質、水分以及電解質等物質流失。此外，人體皮膚寄居著大量的微生物群落，有細菌、病毒、真菌等，這些微生物群落不具有致病性，同時還可以抵御外界病原微生物的侵入和防止水分丟失[8]。真菌是真核領域的普遍微生物，種類約有五萬種，僅有200 種是人類的病原體，12 種真菌能夠造成人類90%的真菌病。大部分的真菌感染都相對較為頑固，短時間內治好后還會反復發作，且容易傳播和交叉感染，因此臨床需要快速診斷，盡早治療。

皮膚癬菌是臨床常見的真菌感染性皮膚病，其形態有菌絲與孢子兩種，通過鏡檢可見菌絲或孢子即可高度懷疑真菌感染。KOH 濕片法是早期檢測皮膚真菌感染的主要方式，不僅試劑容易獲得，且價格低廉、操作簡單，無需使用特殊的儀器輔助檢查。但是其缺點也較為明顯，對于甲屑等難溶解的標本需要很長檢測時間，顏色與背景中的角質細胞較難區分，顯微鏡下的清晰度也不夠，因此需要檢驗人員的主觀判斷。熒光染色法需要使用熒光劑染色，其價格與KOH 試劑相比更高，但是檢查結果更精準，在顯微鏡下可以快速找到菌絲或標本，同時可以觀察結構，減少了很多主觀誤差，極大提高了孢子類真菌感染的檢出率。值得注意的是，通過真菌培養結果證實[9]，人類的正常皮膚中存在假絲酵母菌、馬拉色菌屬等多種真菌，其中馬拉色菌屬是最常見的正常寄生菌，具有很強到親脂性，它的生長需要脂質化合物，因此在前額、前臂、腹股溝、肘窩等位置含量最多。因此，在這些位置發現孢子也無法直接作為病原菌，是否致病也需要醫生結合檢查結果與臨床癥狀進行綜合判斷，而熒光染色結果圖文并茂，這對于輔助醫生判斷真菌的形態與感染數量有重要幫助，能夠有效降低誤診與漏診。此外，本次研究仍有不足之處，在使用KOH 濕片法檢測時，發現少數假陰性病例，主要原因是檢查面部馬拉色毛囊炎患者，特別是女性患者，大部分為使用化妝品后獲得的標本，這無形增加了顯微鏡下辨別孢子的難度，這也提醒臨床工作人員在檢驗時應盡量排除各種因素，才能進一步提高檢測結果的準確性。

綜上所述，熒光染色法在皮膚真菌檢測中更具優勢，不僅檢出率高，且操作簡單，能夠降低因主觀判斷帶來的誤差，其結果可以為臨床醫生提供幫助，值得廣泛推廣。