云南省部分地方品種雞禽白血病病毒感染情況調查及南澗烏骨雞種雞禽白血病凈化效果評估

嚴紅亞 , 陳 月,2 , 王國君,2 , 李 珂 , 趙 博 , 元正菊 , 張 剛 , 信愛國 , 趙 蓉

(1.云南省畜牧獸醫科學院養禽與禽病研究所 , 云南 昆明 650224 ; 2.云南農業大學動物醫學院 , 云南 昆明 650201 ; 3. 云南綠盛美地畜牧科技有限公司 , 云南 宜良 652100)

禽白血病(Avian leucosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leucosis virus,ALV)引起的一種腫瘤性疾病。能導致雞群發病的主要是外源性ALV,包括A～D、J亞群和新發現的K亞群[1-2],ALV可造成雞群生長發育遲緩,成活率、產蛋率、受精率和孵化率等生產性能降低,同時可導致被感染雞的免疫抑制,引發疾病[3-4]。AL屬于垂直傳播性疾病,亦可通過水平傳播,目前尚無有效的疫苗和治療方法,加強種雞核心群外源性ALV凈化和淘汰病雞是防控AL最有效的方法[5-6]。在我國,幾乎所有商品雞和地方品種雞都存在ALV感染,個別地方品種雞的ALV感染甚至已威脅到種質資源的保護[7],因此,在原種場和保種場開展AL疫病凈化工作勢在必行。

云南省擁有豐富的家禽遺傳資源,優質地方雞品種較多。然而,由于養殖條件和養殖水平相對落后,云南省地方品種雞ALV 感染情況嚴重[8]。本試驗對云南省部分地方品種雞開展ALV感染情況調查,了解ALV在不同雞群的感染情況,選擇在南澗烏骨雞種雞場開展了3個世代的AL凈化工作并評估凈化效果,為云南省地方品種雞AL凈化和防控提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 普查樣品采集 于2019—2021年從云南省滇東(文山、昭通)、滇南(綠春)、滇中(昆明、楚雄)、滇西(大理)和滇北(麗江、迪慶)5 個地區選取12種地方品種雞,翅靜脈無菌采集血漿,分離血清,進行禽白血病病毒J亞群(ALV-J)抗體和ALV p27抗原檢測。所有種雞場均未進行過AL凈化,散養或籠養且同一只母禽所產全同胞均未同袋孵化。采樣時,參考云南省ALV感染情況調查報告[9]和本實驗室前期對云南省部分地方品種雞血清樣本ALV-J抗體抽樣調查結果,采用估計流行率方法進行采樣,置信水平為90%,可接受誤差為5%,預期流行率為50%,對照統計學的大群體估計患病率樣品抽樣表[10],確定最少抽樣樣品數為68份。3年期間在各原種雞場采取隨機抽樣方式,共無菌采集血清1 707份、血漿1 614份,其中公雞血清和血漿樣本共1 327份,母雞血清和血漿樣本共1 994份。樣品采集詳細信息見表1。

表1 普查樣品信息

1.1.2 南澗烏骨雞種雞場樣品采集 于2020—2022年對1.1.1中滇西南澗烏骨雞種雞場進行連續3個世代AL凈化,無菌采集各世代種雞血漿、蛋清和精液樣本,-80 ℃保存。樣品數量信息見表2。

表2 南澗烏骨雞種雞場采集樣品信息

1.2 主要試劑 ALV-J抗體檢測試劑盒(產品批號:DR283)和ALV p27抗原檢測試劑盒(產品批號:DS919),均購自美國IDEXX公司;胎牛血清和0.25%胰酶,均購自GIBCO公司;DMEM高糖培養基,購自武漢塞維爾生物科技有限公司;雞胚胎成纖維細胞系(Douglas foster-1,DF-1)由本實驗室傳代保存。

1.3 主要耗材和儀器 普通真空采血管和肝素鈉真空采血管,江西眾杰醫療器械有限公司產品;低速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司產品;CO2恒溫培養箱和酶標讀板儀,賽默飛世爾(上海)儀器有限公司產品;微量移液器,Eppendorf 公司產品。

1.4 樣品處理和檢測方法

1.4.1 血清樣品處理 普通真空采血管翅靜脈采血約3 mL,室溫靜置沉淀,1 000 r/min離心5 min,分離血清,進行ALV-J抗體檢測。

1.4.2 血漿樣品處理 肝素鈉真空采血管翅靜脈采血約3 mL,室溫靜置沉淀,1 000 r/min離心5 min,取100 μL血漿接種于48孔板中的DF-1細胞,37 ℃、5% CO2培養箱作用2 h,PBS潤洗1遍,加入含1%胎牛血清的DMEM培養基,37 ℃、5% CO2培養箱培養8 d,-20 ℃反復凍融3次,取細胞上清進行ALV p27抗原檢測。

1.4.3 蛋清樣品處理 每只母雞收集3枚初產蛋,每枚初產蛋各吸取500 μL蛋清于2 mL滅菌離心管中混勻,-20 ℃反復凍融3次,進行ALV p27抗原檢測。

1.4.4 精液樣品處理 每只種公雞采集精液2 mL于滅菌離心管中,將精液按1∶6在含青霉素和鏈霉素的DMEM培養基中稀釋,10 000 r/min離心10 min,取上清進行ALV p27抗原檢測。

1.4.5 檢測方法 將處理好的血清樣本按照ALV-J抗體檢測試劑盒說明書進行檢測,將處理好的血漿、蛋清和精液樣本按ALV p27抗原檢測試劑盒說明書進行檢測。

1.5 凈化方案 在本實驗室前期對云南省部分地方品種雞ALV感染情況調查結果以及地方品種雞帶毒和排毒研究[11]的基礎上,結合南澗種雞場的實際飼養管理情況和經濟狀況,最終確定適用于該雞場的AL凈化方案。

建立核心種群飼養區,完善保種場基礎設施,生物安全和生產管理等方面嚴格按照獸醫衛生防疫要求進行。核心種群使用獨立的孵化車間,設置專門的育雛籠、育成籠和產蛋籠。陽性雞淘汰后,應用2種以上消毒劑對籠位進行徹底清洗消毒,對所要用到的場所和用具提前進行清潔消毒,飼養員每次進出欄舍嚴格消毒,阻斷一切可能造成水平傳播的途徑。

種蛋逐枚編號,同一只母禽所產全同胞均同袋孵化,檢出ALV陽性則淘汰種雞及其所有后代。育雛后期6周齡,采集雞群血漿,同1.4.2分離血漿病毒并檢測ALV p27抗原,淘汰陽性雞;開產前23周齡,采集母雞初產蛋蛋清和公雞精液,同1.4.3和1.4.4檢測ALV p27抗原,淘汰陽性雞;純繁前40周齡,采集雞群血漿,同1.4.2分離血漿病毒并檢測ALV p27抗原,淘汰陽性雞,其后每個世代的培育均依此程序循環,本試驗共進行了3個世代凈化。

1.6 生產性能和繁殖性能評估 采用同樣的采樣日齡和檢測方法,記錄各世代商品雞育雛期前7 天病死數、出欄日齡、飼料用量和藥品金額,測定出欄體重,計算前7天死淘率、成活上市率、平均每只雞出欄體重、藥用成本和料肉比。記錄開產后21～43周齡每只母雞每天的產蛋數,統計161 d內總產蛋數并計算平均產蛋數和產蛋率;種群孵化時登記入孵蛋總數,7 d后照蛋并記錄未受精蛋和死精蛋,21 d出殼后記錄死雛和健雛數,計算受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率和健雛率。

1.7 數據分析 試驗結果按照試劑盒說明書進行判定。運用Excel對地方品種雞不同地區、不同品種、不用性別和不同養殖方式ALV-J抗體和ALV p27抗原陽性率、1～3世代商品肉雞生產性能和繁殖性能數據進行整理分析,運用SPSS 19.0軟件對南澗烏骨雞種雞場3個世代ALV p27抗原凈化數據進行卡方(χ2)檢驗,運用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖,P<0.05定義為統計學差異顯著,P<0.01定義為統計學差異極顯著。

2 結果

2.1 云南省部分地方品種雞ALV感染狀況分析

2.1.1 不同地區分析 檢測結果見表3,云南省5個地區的1 707份血清樣本經ALV-J抗體檢測皆存在不同水平的ALV感染,不同地區雞群ALV-J抗體陽性率差異明顯,其中滇南地區ALV-J抗體群體陽性率最高,達65.00%,滇北地區ALV-J抗體群體陽性率最低,為32.91%;5個地區的1 614 份血漿樣本經ALV p27抗原檢測,滇西地區群體陽性率最高,為25.71%,滇東地區群體陽性率最低,為12.04%,滇南地區未檢出;各地區ALV群體總平均陽性率為29.87%。結果表明,云南省不同地區地方品種雞均存在ALV感染。

表3 云南省不同地區地方品種雞ALV陽性率

2.1.2 不同品種和不同性別分析 對不同品種地方雞采集的血清和血漿樣品進行ALV-J抗體檢測和ALV p27抗原檢測,結果如表4所示,云南省部分地方品種雞ALV-J抗體和ALV p27抗原檢測群體陽性率為29.87%,其中綠春黃連雞ALV陽性率最高,達65.00%;石林土雞和玉溪土雞2個地方品種雞呈現ALV-J抗體和ALV p27抗原陰性,可能是檢測樣本數量太少、檢測日齡太小等原因,并不說明雞群沒有感染ALV。在采集的樣品中,公雞樣本1 327份,ALV-J抗體和ALV p27抗原群體陽性率為30.52%;母雞樣本1 994份,ALV-J抗體和ALV p27抗原群體陽性率為29.44%,公雞群體陽性率高于母雞群體陽性率。結果表明,云南省各地方品種雞ALV-J抗體和ALV p27抗原陽性率差異明顯,且公雞ALV群體陽性率高于母雞。

表4 不同品種和不同性別地方品種雞ALV陽性率

2.1.3 不同養殖方式分析 共檢測種雞場血清樣品1 026份,散養戶血清樣品681份,檢測結果見表5,種雞場ALV-J抗體群體陽性率為42.88%,散養戶ALV-J抗體群體陽性率為47.72%,散養戶ALV-J抗體群體陽性率高于種雞場。

表5 不同養殖方式地方品種雞ALV-J抗體陽性率

2.2 南澗烏骨雞種雞場3個世代AL凈化效果

2.2.1 南澗烏骨雞種雞場AL凈化趨勢 南澗烏骨雞種雞場AL凈化進程和凈化效果見表6和圖1,種雞場經過2020—2022年3個世代的檢測凈化,血漿、蛋清和精液樣本ALV p27 抗原陽性率均明顯下降;精液樣本ALV p27抗原陽性率由1世代的58.33%極顯著下降到3世代的16.87%(χ2=503.87,P<0.01);蛋清樣本ALV p27抗原陽性率由1世代33.71%極顯著下降到3世代的14.56%(χ2=151.22,P<0.01);40周齡公雞血漿樣本ALV p27抗原陽性率由1世代的22.54%極顯著下降到3世代的0.85%(χ2=199.549,P<0.01);40周齡母雞血漿樣本ALV p27抗原陽性率由1世代的18.71%極顯著下降到3世代的0.66%(χ2=254.65,P<0.01)。

圖1 南澗烏骨雞種雞場3個世代雞群ALV p27抗原陽性率

表6 南澗烏骨雞種雞場AL凈化過程中ALV p27抗原陽性率

2.2.2 種雞AL凈化對商品雞生產性能的影響 如表7所示,隨著AL凈化實施,商品雞生產性能各指標均明顯提升,與凈化初期原雞群(1世代)相比,3世代商品雞群前7 天死淘率下降了3.3%,出欄日齡提前了19 d,成活上市率提高了5.1%,商品公雞平均每只雞出欄體重增重了0.49 kg,商品母雞平均每只雞出欄體重增重了0.34 kg,平均每只雞藥用成本降低了0.26元,生產1 kg毛雞飼料耗用量下降0.8 kg。

表7 1～3世代商品雞生產性能

2.2.3 種雞AL凈化對種雞繁殖性能的影響 如表8所示,隨著AL凈化實施,種雞繁殖性能各指標均明顯提升,與凈化初期原雞群(1世代)相比,3世代種雞開產后21～43周共161 d內平均每只雞多產蛋29.8枚,產蛋率提高了11.30%,受精率提升了5.02%,受精蛋孵化率提升了8.35%,入孵蛋孵化率提升了12.00%,健雛率提升了12.21%。經過3個世代的凈化,南澗烏骨雞種雞育雛期、育成期和產蛋期死亡率相比1世代明顯下降,產蛋性能顯著提高,種蛋品質和產蛋數量進一步提高,南澗種雞場經濟效益增長顯著。

表8 1～3世代種雞繁殖性能

3 討論

3.1 云南部分地方品種雞感染狀況調查 近年來,地方品種雞群中AL的發病率逐漸上升,且混合感染情況愈發嚴重,宿主范圍也在不斷擴大,給種雞場造成嚴重的經濟損失。俞燕[12]對全國26種地方品種雞進行AL流行病學調查,發現有22種地方品種雞ALV-J抗體呈陽性,各品種雞群對ALV均易感。本試驗對2019—2021年云南省部分地方品種雞ALV-J抗體和ALV p27抗原檢測發現,云南省ALV凈化形勢嚴峻,種雞場和散養戶均存在不同程度的ALV感染,云南省5個地區12種地方品種雞ALV-J抗體群體陽性率為44.82%,與張倩[13]于2011—2016 年對全國19個省、市、自治區的60個祖代場調查的ALV-J抗體群體陽性率(26.3%～64.71%)相近,高于趙勝杰等[14]于2021年調查的河南省39個規模雞場的ALV-J抗體群體陽性率(10.40%)。結果表明,云南省部分地方品種雞ALV感染情況嚴重,對種雞場開展AL監測和凈化,對AL防控具有重要意義。

本試驗通過對云南省12種地方品種雞進行ALV-J抗體和ALV p27抗原陽性率調查,發現不同地方品種雞ALV-J抗體和ALV p27抗原群體陽性率為29.87%,低于白馬偉等[9]調查的云南省昆明地區規模化種雞場ALV-J抗體群體陽性率(62.68%)。陳海燕[15]對鄭州市地方雞群和蛋雞群進行 ALV p27抗原檢測,總陽性率分別為 16.4%和16.6%,與本試驗中不同地區地方品種雞ALV p27抗原陽性率為14.06%調查結果相近。這些結果表明,我國不同地方品種雞群普遍存在ALV感染,且不同品種間感染情況存在一定差異,部分種雞場未開展AL監測和凈化工作。本試驗根據不同品種和不同性別調查發現,不同品種雞群中公雞ALV-J抗體和ALV p27抗原群體陽性率(30.52%)高于母雞(29.44%),與白馬偉等[9]調查的云南省昆明地區規模化種雞場公雞泄殖腔ALV-J抗體群體陽性率(80.75%)高于母雞蛋清ALV-J抗體群體陽性率(37.39%)的結果一致。本試驗根據不同養殖方式的調查發現,云南省種雞場ALV-J抗體群體陽性率(42.88%)和散養戶ALV-J抗體群體陽性率(47.72%)明顯高于盧海英[16]報道的種雞場AL群體陽性率(7.86%)和散養戶AL群體陽性率(14.83%),由于遺傳背景、養殖條件、飼養管理模式、免疫程序和專業技術等諸多因素,散養戶雞群感染風險大于養殖場雞群,故散養戶雞群AL感染率更高,同時表明云南省部分地方品種雞ALV感染更加普遍,防疫工作不到位,垂直和水平傳播嚴重,養殖場/戶長期未對ALV的檢測和凈化足夠重視。

3.2 南澗烏骨雞種雞AL示范性凈化效果 目前尚無切實可行的AL控制方法,種雞場疫病凈化是控制病毒傳播的有效方法[17]。AL的凈化需要通過了解待凈化雞群ALV的感染情況、父母代雞和商品代雞的感染和發病情況以及ALV的排毒規律,然后根據種雞場經濟狀況和飼養管理模式進行綜合分析,制定適宜的凈化方案,才能提高陽性檢出率,縮短凈化時間,降低凈化成本。由于不同雞群之間存在差異,因此凈化方案不是一成不變的,不能僅僅通過單次檢測就完全淘汰所有感染ALV的雞群[18-19]。王培坤等[20]經過6 個世代的凈化,三黃雞育種三系配套系群體ALV p27 抗原陽性率下降明顯。胡杰等[21]在廣西11 家重點種雞場經過8年的凈化,雞群ALV總平均陽性率從12.16%下降到0.30%。晏志勛等[22]對北京油雞開展AL凈化,結果顯示,蛋清、公雞精液、肛拭和雛雞胎糞的p27抗原陽性率均顯著下降。本試驗結合多種檢測方法,通過3個世代檢測淘汰陽性個體制定適合南澗種雞場的凈化方案,經過3個世代的凈化,蛋清、精液、公雞血漿和母雞血漿樣本的ALV p27 抗原陽性率都極顯著下降。雖然下降幅度與文獻報道[20-21]存在差異,但這主要是由于統計雞群數量、品種和凈化世代的差異所致。該種雞場還將繼續進行多個世代的AL凈化工作,以進一步降低ALV感染率。

ALV感染會對雞群增重、產蛋性能和繁殖性能造成不利影響[23]。本試驗南澗烏骨雞種雞經過3個世代AL凈化后,從生產性能看,3世代商品雞群前7天死淘率、藥用成本和料肉比明顯下降,同時出欄日齡提前了19 d,成活上市率和平均每只雞出欄體重均明顯提高;從繁殖性能看,161 d內平均每只種雞產蛋數、產蛋率、受精率、受精蛋孵化率、入孵蛋孵化率和健雛率都明顯提高,說明AL凈化對提高雞場實際生產和經濟效益有顯著的作用。這與胡杰[21]和常棖等[23]提到的養雞場實施AL凈化后凈收益有了明顯提升的研究結果一致。進一步證明本試驗中針對南澗烏骨雞種雞制定的ALV檢測技術和AL凈化方案切實可行,成效顯著。

本試驗調查結果顯示,云南省部分地方品種雞中普遍存在ALV感染,并且情況復雜。自繁自養的地方品種雞群中,大部分雞群未進行AL監測和凈化工作,由于水平傳播和垂直傳播等原因,地方品種雞的ALV感染率呈上升趨勢。針對云南省部分地方品種雞群中ALV感染嚴重的問題,應該繼續研究不同地方品種雞群的帶毒和排毒情況以及ALV的遺傳變異特點,制定適合地方品種雞群的凈化方案,以降低ALV對地方品種雞群的威脅,最終實現疫病凈化。本試驗提供的凈化方案對云南省地方品種雞AL的凈化起到一定的指導作用,可進一步在其他雞群推廣應用,加快云南省地方品種雞AL凈化,保護豐富的地方種質資源。