不同ELISA檢測方法在檢測出殼雛雞禽白血病病毒感染中的應用

崔慧珍 , 張亞文 , 王一新 , 常 爽 , 趙 鵬

(山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院 , 山東 泰安 271018)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)感染引起的一種家禽腫瘤性疾病。根據(jù)病毒的宿主范圍、病毒間的干擾作用和病毒囊膜蛋白抗原特性,ALV可被分為A～K不同亞群(ALV-A～ALV-K)[1-3],其中ALV-E屬于內源性ALV,沒有致病性或致病性很弱,但可以干擾外源性ALV的檢測。大量流行病學報道均顯示,ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K是我國廣泛流行或曾報道過相關病例的主要代表亞群[4-7],感染不同品種的雞都可以引發(fā)不同程度的臨床癥狀[8-10],其中ALV-K是首先從我國特有的地方品系雞中分離得到的新亞群[4]。AL給我國家禽養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟損失,所以被列為我國種禽場必須要實現(xiàn)凈化的主要禽病之一。

垂直傳播是ALV主要傳播途徑,多數(shù)ALV病例是經(jīng)垂直傳播或早期水平傳播感染引起的,經(jīng)垂直傳播感染ALV的雛雞出殼后免疫系統(tǒng)通常發(fā)育不完全[11]。在實施AL凈化過程中,對出殼雛雞的檢測和淘汰對于最大程度降低垂直傳播及其帶來的早期水平傳播危害極為重要,目前ALV凈化檢測方法中最簡單快速的就是采集出殼雛雞胎糞進行ALV群特異性衣殼蛋白27(Protein 27,p27)抗原檢測,在盡可能短的時間內檢出陽性雞進而淘汰。p27抗原ELISA檢測是目前實施AL凈化用途最廣泛的檢測試劑盒,目前市場上多種商品化ALV-p27抗原ELISA試劑盒的特異性和靈敏度不盡相同[12]。如果養(yǎng)殖場使用了特異性和靈敏度存在問題的試劑盒,造成檢測過程中的假陽性或假陰性,無疑會影響AL凈化進程。本試驗通過雞胚卵黃囊分別接種ALV-A、ALV-B、ALV-K和ALV-J四個亞群的ALV毒株,構建雞胚垂直感染攜帶ALV模型,以盡可能模擬生產(chǎn)中的垂直傳播過程,胎糞樣品直接應用4家公司的ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒進行檢測,將血漿和肝臟樣品病毒分離作為確定感染陽性的參考標準,同時并以實時熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)進行平行檢測,通過上述不同ELISA試劑盒與不同檢測方法的對比評價試劑盒的靈敏度,以期為評價不同ELISA試劑盒和不同檢測方法在凈化AL中的價值提供參考評估模型。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞 ALV-A野毒株SDAU14A1(GenBank 登錄號:KU375453.1)于2014年由本實驗室從我國特有地方品系龍勝鳳雞某保種雞群種蛋中分離鑒定和保存;ALV-B野毒株SDAU09C2(GenBank 登錄號:HM446005.1)于2009年由本實驗室從山東省某蘆花雞場中分離鑒定和保存;ALV-J野毒株NX0101(GenBank 登錄號:DQ115805.1)于2001年由本實驗室從寧夏回族自治區(qū)某父母代種雞場中分離鑒定和保存;ALV-K野毒株JS11C1(GenBank 登錄號:KF746200.1)于2012年由本實驗室從江蘇省某地方品系保種雞群中分離鑒定和保存。用于病毒增殖的雞胚成纖維細胞系(Douglas foster-1,DF-1),購自美國生物資源中心(American Type Culture Collection,ATCC),由山東農(nóng)業(yè)大學家禽腫瘤病實驗室保存。無特定病原(Specific pathogen free,SPF)雞胚,購自濟南賽斯家禽有限公司。4種亞群ALV毒株在DF-1細胞上增殖后,按照Reed-Muench法測定其組織半數(shù)感染量(50% Tissue culture infective dose,TCID50)。

1.2 主要儀器和試劑 Biotek Synergy H1 酶標儀,購自廣州達瑞生物技術股份有限公司;ABI Quant Studio 5實時熒光定量PCR系統(tǒng),購自美國Thermo Fisher Scientific公司。RNA提取試劑盒,購自美國Omega Bio-Tek公司;ALV-p27抗原ELISA試劑盒均為市場上在售商品化試劑盒,根據(jù)企業(yè)要求分別編號為 A、B、C和D;

1.3 病毒接種和樣本采集 將100枚SPF雞胚隨機分為5個組,ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K感染組每組20枚,每組分別在8胚齡時通過卵黃囊以500 TCID50/枚的劑量接種4種亞群ALV毒株,20枚SPF雞胚經(jīng)卵黃囊接種等體積無菌生理鹽水作為對照組。待雞出殼后逐一編號,采集各組雛雞胎糞樣品和血漿樣品,死亡雞胚肝臟樣品,死亡雛雞胎糞樣品、血漿樣品和肝臟樣品。胎糞樣品與樣品稀釋液充分混勻后放于-20 ℃冰箱保存。無菌抗凝血樣品3 000 r/min離心5 min取上層血漿樣品放于-80 ℃冰箱保存。肝臟樣品加入無菌PBS研磨,12 000 r/min離心3 min取上清,用0.22 μm無菌濾器過濾后放于-80 ℃冰箱保存。

1.4 胎糞樣品直接ELISA檢測 所有胎糞樣品檢測前反復凍融3次,將樣品恢復至室溫,渦旋振蕩后以12 000 r/min離心2 min,取100 μL上清進行ALV-p27抗原檢測,分別以4家公司ALV-p27抗原ELISA檢測試劑盒對胎糞進行檢測,操作方法按各試劑盒說明書進行,讀取樣品光密度(Optical density,OD)值,按照說明書方法計算得出樣品與陽性對照比值(Sample/Positive,S/P),S/P≥0.2,判定樣品為陽性;S/P<0.2,則判定樣品為陰性。

1.5 血漿和肝臟病毒分離樣品ELSA檢測 取1.3中處理的無菌血漿樣品和肝臟過濾液樣品接種于已長成單層的DF-1細胞,37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育2 h后棄上清液,無菌PBS清洗3遍,換為含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)7 d;取100 μL細胞培養(yǎng)上清液反復凍融3次,按1.4方法以4家公司ALV-p27抗原ELISA試劑盒對細胞上清液進行檢測。

1.6 RT-qPCR擴增 取1.3中處理的胎糞樣品、血漿樣品和肝臟過濾液樣品各150 μL,按照RNA提取試劑盒說明書操作提取RNA。根據(jù)GenBank中不同亞群ALV代表株的囊膜糖蛋白(Glycoprotein 85,gp85)基因序列,使用Lasergene 7.0軟件比對并尋找亞群特異性的保守區(qū)域,應用Primer 5.0軟件設計針對ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-Kgp85基因的引物(表1),引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。RT-qPCR反應體系:RT-qPCR預混液20 μL,酶混合物1 μL,上、下游引物各1 μL和 RNA樣品500 ng;反應程序:42 ℃ 15 min,95 ℃ 3 min,40×(95 ℃ 15 s,53 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s)。在每個60 ℃熒光擴增循環(huán)反應時進行不同波段熒光信號的收集和檢測。

表1 4種亞群ALV的RT-qPCR檢測引物

2 結果

2.1 ALV-A感染組不同檢測方法結果對比 ALV-A感染組20枚雞胚共有14只雛雞孵化出殼,每只雛雞胎糞和血漿病毒分離樣品通過ELISA和RT-qPCR檢測,結果如表2所示,大部分樣品陰陽性判定結果基本一致,只有部分樣品存在不一致的情況。例如:A-04血漿病毒分離樣品僅D公司ELISA和RT-qPCR結果均為陽性,其余3家公司ELISA結果接近判定為陽性的臨界值,胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均判為陰性;A-03、A-12和A-13胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果為陰性,但血漿病毒分離樣品ELISA和血漿樣品RT-qPCR結果均呈陽性;A-08胎糞樣品直接ELISA結果僅B公司為陽性,血漿病毒分離樣品ELISA和RT-qPCR結果均為陽性。結果表明,僅胎糞樣品直接ELISA檢測并非100%可以將陽性雞只檢出,血漿病毒分離樣品ELISA檢測具有更高的靈敏度,可以檢出更多的感染雞只。

表2 ALV-A感染組不同類型樣品利用不同檢測方法檢測的結果對比

2.2 ALV-B感染組不同檢測方法結果對比 ALV-B感染組20枚雞胚共有16只雛雞孵化出殼,每只雛雞胎糞和血漿病毒分離樣品通過ELISA和RT-qPCR檢測,結果如表3所示,大部分樣品陰陽性判定結果基本一致,只有部分樣品存在不一致的情況。例如:B-01胎糞樣品直接ELISA結果雖判定為陰性,但接近判定為陽性的臨界值,RT-qPCR結果為陽性,而血漿病毒分離樣品ELISA和血漿樣品RT-qPCR結果均為陰性;B-03胎糞樣品B公司ELISA結果、血漿病毒分離樣品ELISA結果和血漿樣品RT-qPCR結果均為陽性,其余3家公司胎糞樣品直接ELISA結果為陰性,表明不同試劑盒的靈敏度存在差異;B-08胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均為陰性,而血漿病毒分離樣品ELISA和RT-qPCR結果均為陽性,表明血漿病毒分離樣品ELISA檢測靈敏度更高;B-09胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均為陰性,血漿病毒分離樣品A公司和B公司ELISA結果為陰性,但接近判定為陽性的臨界值,C公司和D公司ELISA結果和血漿樣品RT-qPCR檢測結果為陽性,表明不同ELISA試劑盒對同一樣品檢測的靈敏度不同。

表3 ALV-B感染組不同類型樣品利用不同檢測方法檢測的結果對比

2.3 ALV-J感染組不同檢測方法結果對比 ALV-J感染組20枚雞胚共有14只雛雞孵化出殼,每只雛雞胎糞和血漿病毒分離樣品通過ELISA和RT-qPCR檢測,結果如表4所示,大部分樣品陰陽性判定結果基本一致,只有部分樣品存在不一致的情況。例如:J-02胎糞樣品直接ELISA 檢測A公司和C公司判定結果為陰性,B公司和D公司判定結果與血漿病毒分離樣品ELISA和RT-qPCR結果一致,均為陽性;J-05和J-06胎糞樣品直接ELISA檢測分別僅有A公司和D公司判定結果為陽性,與RT-qPCR結果一致,血漿病毒分離樣品ELISA和血漿樣品RT-qPCR結果均為陽性;J-07胎糞樣品直接ELISA檢測C公司和D公司判定結果為陰性,其他檢測結果均為陽性。

表4 ALV-J感染組不同類型樣品利用不同檢測方法檢測的結果對比

2.4 ALV-K感染組不同檢測方法結果對比 ALV-K感染組20枚雞胚共有11只雛雞孵化出殼,每只雛雞胎糞和血漿病毒分離樣品通過ELISA和RT-qPCR檢測,結果如表5所示,大部分樣品陰陽性判定結果基本一致,只有部分樣品存在不一致的情況。例如:K-03胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均為陰性,而血漿病毒分離樣品結果均為陽性;K-09胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均為陰性,血漿病毒分離樣品ELISA檢測僅B公司判定結果為陰性,但接近判定為陽性的臨界值。

表5 ALV-K感染組不同類型樣品利用不同檢測方法檢測的結果對比

2.5 死亡雞胚肝臟樣品不同檢測方法結果對比 肝臟過濾液樣品進行RT-qPCR檢測,肝臟病毒分離樣品進行ELISA檢測,結果如表6所示,ALV-A和ALV-J感染組各有1份肝臟過濾液樣品,ELISA和RT-qPCR結果均為陽性,即雞胚肝臟中檢出相應病毒;而ALV-K感染組4份肝臟過濾液樣品中,ALV-K1和ALV-K2的ELISA和RT-qPCR結果均為陰性;ALV-K3經(jīng)C公司ELISA試劑盒檢測結果為陽性,其余3家公司ELISA和RT-qPCR結果均為陰性;ALV-K4的RT-qPCR結果為陽性,而ELISA結果為陰性。

表6 死亡雞胚肝臟病毒分離樣品ELISA與RT-qPCR檢測的結果對比

2.6 死亡雛雞不同樣品的不同檢測方法結果對比 部分死亡雛雞的胎糞、血漿和肝臟樣品分別進行RT-qPCR檢測,血漿和肝臟病毒分離樣品進行ELISA檢測。結果如表7～9所示,ALV-A3胎糞樣品直接ELISA檢測結果為陰性,RT-qPCR檢測結果為陽性,血漿和肝臟病毒分離樣品ELISA和RT-qPCR結果也均為陽性;ALV-B3胎糞樣品僅B公司直接ELISA結果和RT-qPCR結果為陽性;ALV-A4胎糞樣品直接ELISA和RT-qPCR結果均為陰性,血漿和肝臟病毒分離樣品ELISA結果僅有D公司結果為陽性,其余3家公司ELISA結果接近判定為陽性的臨界值,RT-qPCR檢測結果為陽性;ALV-A5和ALV-B1肝臟病毒分離樣品僅有1家公司ELISA結果為陽性,而胎糞樣品、血漿樣品和肝臟樣品的RT-qPCR結果均為陽性,表明不同試劑盒的靈敏度差異較大。

表7 死亡雛雞胎糞樣品ELISA與RT-qPCR檢測的結果對比

表8 死亡雛雞血漿樣品ELISA與RT-qPCR檢測的結果對比

表9 死亡雛雞肝臟樣品ELISA與RT-qPCR檢測的結果對比

3 討論

ALV通過種源垂直傳播的放大效應給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失,會導致雞產(chǎn)生腫瘤、免疫抑制、生產(chǎn)性能下降甚至死亡等[13-15],還可能造成感染雞產(chǎn)生免疫耐受。因此,疫苗對AL防治的意義不大,目前尚無針對AL的有效疫苗和藥物,種源凈化是控制AL最有效的手段。現(xiàn)有的AL凈化程序主要采用胎糞p27抗原檢測、蛋清p27抗原檢測和病毒分離等不同檢測方法,其中針對ALV-p27的ELISA試劑盒檢測一直是針對批量樣品檢測的首選,特別是在數(shù)量龐大的出殼雛雞胎糞檢測方面發(fā)揮了關鍵作用[16-18]。樣品直接進行p27抗原ELISA檢測無法區(qū)分內源性ALV和外源性ALV,需要通過接種DF-1細胞進行病毒分離的方式確診。病毒分離被認為是檢測ALV感染的金標準,除了對細胞操作水平有較高的要求外,也要確保所使用的禽白血病抗原檢測試劑盒既要有較好的特異性,更要有極高的靈敏度。

本試驗通過SPF雞胚卵黃囊分別感染ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K毒株,人工獲取了雞胚垂直感染不同亞群ALV的樣品,包括出殼雛雞胎糞和血漿、死亡雞胚肝臟以及死亡雛雞胎糞、血漿和肝臟樣品。通過胎糞樣品直接ELISA和血漿病毒分離樣品ELISA檢測,證實多數(shù)接種雞均成功感染ALV,表明通過卵黃囊接種可使較高比例的雛雞感染ALV。4個ALV感染組的胎糞樣品直接ELISA檢測與雛雞血漿病毒分離后進行ELISA檢測的結果總體上具有較好的吻合性,且4家公司ELISA試劑盒判定結果高度一致,這表明胎糞直接ELISA檢測能及時檢出大部分陽性樣品,在水平傳播比較嚴重的出殼初期及時將感染ALV的雞檢出并淘汰,有助于降低ALV的水平傳播效率。

胎糞樣品直接ELISA檢測與血漿病毒分離樣品ELISA檢測的陽性檢出率均存在差異,血漿病毒分離樣品ELISA檢測與RT-qPCR檢測結果差異較小,表明血漿病毒分離樣品ELISA檢測結果準確性要高于胎糞直接ELISA檢測。例如:A-03、A-12、A-13、B-08和K-03的胎糞樣品直接ELISA檢測結果均判定為陰性,血漿病毒分離樣品ELISA檢測結果均判定為陽性。相對而言,ALV-J感染組出殼雛雞的胎糞樣品直接ELISA檢測結果和雛雞血漿病毒分離樣品ELISA檢測結果基本一致,大部分判定結果為陽性,這很可能與雞胚感染不同亞群ALV后出殼雛雞的胎糞排毒能力有關,也切合臨床上ALV-J水平傳播能力較強的真實狀態(tài)。

本試驗還隨機選取了部分死亡雞胚和雛雞的肝臟樣品進行病毒分離,ALV-A和ALV-B感染組肝臟病毒分離和血漿病毒分離樣品ELISA檢測結果具有較高的吻合性。ALV-K感染組死亡雞胚肝臟中病毒檢出率較低,推測可能是在操作過程中對雞胚造成了損傷,或者是ALV-K毒株在雞胚內復制能力較弱,故未能形成高效感染。

本試驗通過RT-qPCR對所有樣品進行平行檢測,RT-qPCR檢出陽性率要高于ALV-p27抗原ELISA試劑盒,顯示了分子生物學檢測的靈敏度優(yōu)勢。需要強調的是,雖然本試驗以期盡可能降低內源性ALV核酸對檢測的干擾,但不能完全避免內源性ALV核酸的檢出,如所有對照組SPF雞胚肝臟樣品的RT-qPCR檢測結果平均CT值為24.98,1日齡SPF雛雞肝臟樣品和胎糞樣品的RT-qPCR檢測結果平均CT值分別為24.62和25.60,與各感染組的平均CT值差異較小。因本試驗是對確定感染樣品進行檢測,其目的是通過RT-qPCR對ELISA結果進行復核和比較,但在對臨床樣品進行檢測時,為避免內源性ALV核酸干擾引起假陽性,仍應以病毒分離樣品ALV-p27抗原ELISA檢測結果為標準。

此前,將不同滴度ALV感染細胞維持7 d后取上清進行ELISA檢測,是對比不同ALV-p27抗原ELISA試劑盒的主要方法[19-21],其優(yōu)點是樣品陰陽性明確,容易判定和比較試劑盒的靈敏度,缺點是樣品過于完美化,難于反映出胎糞和蛋清等不同樣品對于檢測過程的干擾。本試驗以雞胚感染ALV-A、ALV-B、ALV-J和ALV-K模擬生產(chǎn)中的ALV垂直傳播,以確定的ALV毒株感染樣品構建了樣品盤,能夠相對較好的彌補單純細胞樣品評估方式的缺點。需要強調的是,我國品質繁多的雞品系中,內源性ALV的p27蛋白表達規(guī)律是非常復雜的,比SPF雞中p27蛋白的表達規(guī)律要復雜得多,因此本次對比試驗也僅能作為對特定批次試劑盒的一次單品系對比。建議對不同檢測試劑盒和不同檢測方法在我國更多品系的臨床雞品種中開展更多的對比檢測,為不斷優(yōu)化試劑盒和凈化檢測方法提供參考依據(jù)。