豬鏈球菌靶向DC重組蛋白DC3pep-SDZ對斑馬魚的免疫保護性分析

于恩遠 , 榮睿璠 , 曾 君 , 趙瑞利 , 郭海悅 , 張東超 , 胡 燁 , 李 穎 , 王心如

(1. 天津農學院動物科學與動物醫學學院 天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室 , 天津 西青 300392 ;2. 天津市動物疫病預防控制中心 , 天津 北辰 300402)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,SS)主要致病血清型為2型(SS2)、3型(SS3)、7型(SS7)和9型(SS9)等[1-3]。為了開發具有型間交叉保護效果的SS亞單位疫苗,本課題組前期選取了SS2、SS3和SS9中高度保守的分泌型DNA核酸酶A(Secretory DNA nuclease A,SsnA)、二氫硫辛酰胺脫氫酶(Dihydrolipoamide dehydrogenase,DLDH)和高親和力鋅攝取系統蛋白(High-affinity zinc uptake system protein,ZnuA)3種毒力因子作為保護性抗原,利用生物信息學軟件篩選得到了優勢的B細胞和輔助T(Helper T,Th)細胞表位,將這些優勢表位與樹突狀細胞靶向肽(Dendritic cell targeting peptide,DC3pep)氨基酸序列串聯,構建并制備了靶向樹突狀細胞(Dendritic cells,DC)的多表位重組蛋白DC3pep-SDZ[1]。

斑馬魚(Daniorerio,Zebrafish)是目前SS相關研究中常用的模式生物之一[4],由于斑馬魚與哺乳動物基因同源性較高,有著完整特異性的先天性免疫和獲得性免疫系統,當魚體感染細菌、病毒和寄生蟲等病原體后可以釋放一系列炎性細胞因子[5]。Pressley等[6]報道了用遲緩愛德華菌感染斑馬魚后,魚體IL-1β和TNF-a基因的表達量顯著上調。Rodríguez等[7]檢測顯示,被嗜水氣單胞菌感染的斑馬魚腎臟中TNF-α和IFN-γ基因的表達量上調。

為了探究本課題組前期構建的SS多細胞表位靶向DC重組蛋白DC3pep-SDZ對致病型SS感染斑馬魚的免疫保護效果,本試驗采用了與構建重組蛋白DC3pep-SDZ相同的方法構建了不含DC3pep的對照重組蛋白SDZ,將制備的2種重組蛋白分別免疫斑馬魚,攻擊致病型SS2、SS3和SS9,計算存活率,采用蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色法探究重組蛋白DC3pep-SDZ對斑馬魚感染SS后產生的免疫保護效果,采用實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測SS3攻擊斑馬魚后的炎性細胞因子表達量,以期為后續SS重組亞單位疫苗的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Todd-Hewitt肉湯(Todd-Hewitt broth,THB)粉末,購自青島海博生物技術有限公司;異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),購自翌圣生物科技(上海)有限公司;二甲苯,購自天津市風船化學試劑科技有限公司;間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(3-Aminobenzoic acid ethyl ester methanesulfonate,MS-222),購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;2×ExTaqMix,購自上海聯碩生物科技有限公司;伊紅、蘇木精、焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)水和磷酸鹽緩沖液等,均購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol總RNA提取試劑,購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 熒光倒置顯微鏡,Nikon尼康精機(上海)有限公司產品;JXFSTPRP-CL-24冷凍研磨儀,上海凈信實業發展有限公司產品;瓊脂糖電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;超微量分光光度計,賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品;iMax酶標儀、凝膠成像分析儀和熒光定量PCR儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司產品。

1.3 菌株和實驗動物 SS2(ZY05719)、SS3(TJ1806)和SS9(TJ0102)分離株,由天津農學院獸醫學實驗室保存;原核表達載體pET28a-SDZ和感受態細胞E.coliBL21(DE3),由上海捷瑞生物工程有限公司構建。健康成年AB系野生型斑馬魚(體長2.5～3.5 cm),由天津農學院獸醫學實驗室繁殖飼養,本試驗經天津農學院動物實驗倫理委員會批準(批準號:2021LLSC07)。

1.4 試驗方法

1.4.1 重組質粒pET28a-SDZ的構建 將重組蛋白DC3pep-SDZ氨基酸序列[1]中N端的DC3pep和與之相連的首個GGGG柔性短肽序列刪除,即獲得重組蛋白SDZ的氨基酸序列。采用參考文獻[1]中的方法,用ProtParam在線分析重組蛋白SDZ氨基酸序列理化性質后將氨基酸序列轉化為核苷酸序列并優化,構建原核表達載體pET28a-SDZ并轉化感受態細胞E.coliBL21(DE3)。

1.4.2 免疫原的制備 采用參考文獻[1]中的方法制備重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ。將pET28a-DC3pep-SDZ/BL21(DE3)和pET28a-SDZ/BL21(DE3)擴大培養,于600 nm波長處檢測菌液的吸光度(Optical density,OD)約為0.5時,加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導,6 h時采用SDS-PAGE分析誘導產物表達情況,Western blot鑒定誘導產物可溶性[封閉:5%脫脂奶粉4 ℃過夜;一抗:小鼠抗6×His單克隆抗體(1∶5 000),孵育90 min;二抗:山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶3 000),孵育60 min]。將上清中的產物利用親和層析鎳柱純化和超濾濃縮,采用SDS-PAGE鑒定純化產物,超微量分光光度計測定重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ濃度并分別調整至1 mg/mL,置于4 ℃待用。

1.4.3 SS的復壯和鑒定 取復蘇的SS ZY05719、TJ1806和TJ0102接種于THB培養基常規培養后收集菌體,調整菌液濃度(ZY05719:3.5×1010CFU/mL、TJ1806:4.2×109CFU/mL、TJ0102:4.4×109CFU/mL)。隨機選取15尾斑馬魚,使用MS-222(55 μg/L)麻醉后隨機分為3個組:第1組、第2組和第3組,每組5尾,每尾分別腹腔注射10 μL ZY05719、TJ1806和TJ0102菌液,注射后12～24 h觀察斑馬魚發病情況,從瀕死斑馬魚腦內分離細菌接種于THB平板并擴大培養。取菌懸液利用PCR擴增SS特異性莢膜基因cps,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。PCR反應體系(20 μL):cDNA 1 μL,2×ExTaqMix 10 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 7 μL;反應程序:95 ℃預變性5 min;30個循環(94 ℃ 1 min,55 ℃ 90 s,72 ℃ 1 min);72 ℃延伸 10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定。

表1 SS cps基因引物信息

1.4.4 斑馬魚半數致死量(Median lethal dose,LD50)的測定 選取190尾斑馬魚隨機分為4個大組,包括3個試驗組(ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組)和PBS對照組,3個試驗組每組各60尾魚,PBS對照組10尾魚。每個試驗組再根據菌液稀釋梯度將斑馬魚隨機分為100、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5組共6個小組,每小組10尾,麻醉后每尾腹腔接種10 μL與組名對應的稀釋度的菌液(100組每尾斑馬魚接種ZY05719、TJ1806和TJ0102細菌數分別為1.9×109CFU、1.1×109CFU和1.4×109CFU);PBS對照組每尾腹腔接種10 μL PBS,按照Reed-Muench法[8]計算LD50。

1.4.5 重組蛋白免疫保護效果評價 選取180尾斑馬魚隨機分為3個大組,分別為重組蛋白DC3pep-SDZ組、重組蛋白SDZ組和PBS對照組,每組60尾。麻醉后3個大組斑馬魚每尾分別腹腔注射10 μL(500 mg/mL)重組蛋白DC3pep-SDZ、10 μL(500 mg/mL)重組蛋白SDZ和10 μL PBS。一共進行3次免疫,每次免疫間隔10 d。在第3次免疫后10 d,每個大組隨機分為3個小組(ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組),每個小組20尾魚,分別取5倍LD50劑量的ZY05719、TJ1806和TJ0102菌懸液以每尾10 μL的劑量分別腹腔注射攻擊3個小組,攻擊后連續觀察7 d,每日觀察斑馬魚存活情況,計算存活率。

1.4.6 斑馬魚腦組織病理學檢查 在ZY05719、TJ1806和TJ0102攻擊后24 h,隨機選取重組蛋白SDZ組、重組蛋白DC3pep-SDZ組和PBS對照組中被ZY05719、TJ1806和TJ0102攻擊的斑馬魚各2尾,取出腦組織置于4 %多聚甲醛溶液中固定24 h以上,參考Yang等[9]方法制作病理切片,H.E.染色后鏡檢觀察。

1.4.7 斑馬魚腦組織炎性細胞因子相對表達量檢測 在TJ1806攻擊后24 h,取重組蛋白SDZ組、重組蛋白DC3pep-SDZ組和PBS對照組斑馬魚腦組織,放入無RNase的EP管中,利用TRIzol法提取RNA,合成cDNA,RT-qPCR檢測白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)、干擾素γ(Interferon gamma,IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和轉化生長因子β1(Transforming growth factor-beta1,TGF-β1)mRNA的相對表達量。各炎性細胞因子基因序列參照參考文獻[10],引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息見表2。

表2 斑馬魚炎性細胞因子基因引物信息

RT-qPCR反應體系(25 μL):2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,添加RNase-free ddH2O至25 μL;反應程序:95 ℃預變性10 min;39個循環(95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s);60 ℃ 60 s,95 ℃ 30 s,60 ℃ 15 s。

1.4.8 統計分析 使用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行統計分析,采用方差分析和卡方檢驗進行數據比較分析,數據用“平均值±標準差”表示,P<0.05為差異性顯著,P<0.01為差異性極顯著,P<0.001為差異性極其顯著。

2 結果

2.1 免疫原的制備 本課題組前期構建的重組蛋白DC3pep-SDZ分子式為C1429H2209N429O517S2,分子質量為44 kDa,理論等電點(Isoelectric point,pI)為4.65,親水性總平均數(Grand average of hydropathicity,GRAVY)為-0.462,屬于親水性蛋白[1]。重組蛋白SDZ氨基酸序列理化性質分析結果顯示,分子式為C1360H2116N410O500S2,分子質量為42 kDa,pI為4.5,GRAVY為-0.4436,同樣屬于親水性蛋白。pET28a-SDZ/BL21(DE3)、pET28a-DC3pep-SDZ/BL21(DE3)誘導后蛋白大量表達(圖1A),重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ主要以可溶性蛋白表達于上清液中(圖1B和1C),將上清液純化后得到了高純度重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ(圖1D)。

圖1 重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ的表達、可溶性分析和純化鑒定

2.2 SS的復壯和鑒定 從瀕死斑馬魚腦內分離的3株SS的PCR鑒定結果顯示,分別擴增出了SS2、SS3和SS9對應的特異性cps基因,陽性條帶大小分別為557、1 273和300 bp(圖2)。

圖2 cps基因的PCR擴增

2.3 斑馬魚LD50的測定 結果顯示,ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組的最小菌液稀釋度的100組斑馬魚在感染SS 24 h內已出現發病和死亡,死亡數在36 h內達到高峰,10-1、10-2、10-3、10-4和10-5組斑馬魚則在96 h內均陸續出現病變和死亡,PBS對照組斑馬魚無病變和死亡情況出現(表3),計算得出ZY05719、TJ1806和TJ0102對斑馬魚的LD50分別為8.71×104、1.1×106和4.47×105CFU。

表3 斑馬魚LD50測定結果

2.4 重組蛋白免疫保護效果評價 攻毒后7 d重組蛋白DC3pep-SDZ組、重組蛋白SDZ組和PBS對照組的斑馬魚存活率結果如圖3所示,PBS對照組所有斑馬魚48 h內全部感染死亡,重組蛋白DC3pep-SDZ組和重組蛋白SDZ組中ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組3個小組存活率分別為50.0%、65.0%和60.0%,45.0%、47.3%和45.0%。重組蛋白DC3pep-SDZ組和重組蛋白SDZ組之間無顯著差異(P>0.05),但與PBS對照組相比較均差異極其顯著(P<0.001)。結果表明,重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ對SS2、SS3和SS9攻擊可以產生一定的交叉免疫保護力。

圖3 斑馬魚存活率

2.5 斑馬魚腦組織病理學檢查 PBS對照組(圖4A)被3株SS攻擊后腦組織均有紅細胞壞死、溶解并形成了不同程度的微血栓,且顆粒細胞層水腫,胞質出現空泡化,特別是ZY05719攻擊組的顆粒細胞層損傷較為嚴重,空泡數量明顯增多,TJ1806攻擊組的腦組織分子層明顯水腫、結構松散紊亂,水平細胞和星形細胞數量減少;重組蛋白SDZ組(圖4B)中的ZY05719攻擊組的腦外顆粒層出現少量空泡;而重組蛋白DC3pep-SDZ組(圖4C)的ZY05719攻擊組、TJ1806攻擊組和TJ0102攻擊組3個小組腦顆粒細胞層的細胞均沒有產生明顯的病變,細胞形態正常且顆粒層邊界清晰。結果表明,重組蛋白SDZ組對SS3和SS9攻擊產生了保護效果,重組蛋白DC3pep-SDZ對SS2、SS3和SS9攻擊均產生了一定的保護效果。

圖4 斑馬魚腦組織病理學檢測(H.E.染色,200×)

2.6 斑馬魚腦組織炎性因子相對表達量檢測 TJ1806攻擊后24 h,重組蛋白DC3pep-SDZ組促炎性細胞因子與PBS對照組相比較,IL-6、TNF-α和IFN-γmRNA表達量分別極顯著(P<0.01)、極其顯著(P<0.001)和極顯著(P<0.01)下調,與重組蛋白SDZ組相比較,IL-6和TNF-αmRNA表達量分別極顯著(P<0.01)和顯著下調(P<0.05)(圖5A);重組蛋白DC3pep-SDZ組抗炎性細胞因子與PBS對照組相比較,IL-10和TGF-β1 mRNA表達量分別極顯著(P<0.01)和極其顯著(P<0.001)上調,與重組蛋白SDZ組相比較,IL-10和TGF-β1 mRNA表達量分別不顯著(P>0.05)和顯著上調(P<0.05)(圖5B)。結果表明,免疫重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ都能夠減輕斑馬魚感染SS3后的腦部炎癥反應,但重組蛋白DC3pep-SDZ減輕感染癥狀和緩解炎癥反應的效果更好。

圖5 斑馬魚腦組織炎性細胞因子mRNA相對表達量

4 討論

斑馬魚是研究遺傳學、發育生物學、血管生物學和疾病建模方面常用的模式動物,具有體型小、飼養成本較低、遺傳操作簡便、胚胎透明、發育周期全透明、繁殖周期短、產卵量大、發育迅速和易于管理操作等優點[11-12]。由于斑馬魚對SS易感,Neely等[13]早先建立了SS斑馬魚感染模型,后來我國陸承平等[14]也采用單一純系AB斑馬魚作為動物模型研究SS的致病性并進行溶菌酶釋放蛋白(Muramidase-released protein,MRP)對斑馬魚的免疫試驗。近年來,孔里程[15]將SS的三磷酸甘油醛脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、MRP和DLDH三個毒力因子的B細胞表位進行串聯,原核表達后免疫斑馬魚,證實了多B細胞表位蛋白可以對斑馬魚機體產生有效的免疫應答,具有一定的保護作用。基于此,本試驗將構建了含有B和Th細胞表位的靶向DC細胞重組蛋白DC3pep-SDZ免疫斑馬魚,評價重組蛋白DC3pep-SDZ對SS2、SS3和SS9的免疫保護效果。

在重組蛋白免疫保護效果評價試驗中,重組蛋白DC3pep-SDZ和SDZ對3種分型SS的感染都能表現出一定的交叉保護力,這驗證了本課題組前期篩選的保護性抗原SsnA、DLDH和ZnuA的B和Th細胞表位的有效性。在存活率計算和H.E染色試驗后,礙于對斑馬魚采血等技術操作限制,本試驗沒有檢測魚體相關抗體水平的變化,后續研究將把重組蛋白DC3pep-SDZ和佐劑混合制備亞單位疫苗,免疫小鼠和仔豬,采用計算存活率、檢測血清中特異性抗體水平、細胞因子濃度以及臟器和血液載菌量等方法全面評價亞單位疫苗DC3pep-SDZ的保護效果。

SS的細胞壁成分屬于病原體相關分子模式(Pathogen-associated molecular patterns,PAMP)之一,能被Toll樣受體2(Toll-like receptor 2,TLR2)識別[16],激活DC信號傳導的同時觸發IL-6的分泌,從而引發機體炎癥[10]。在檢測SS3感染斑馬魚腦組織炎性細胞因子試驗中,重組蛋白DC3pep-SDZ組促炎性細胞因子IL-6和TNF-αmRNA表達量顯著低于重組蛋白SDZ組,表明了免疫靶向DC策略的重組蛋白相較于純表位重組蛋白可以更有效地緩解炎癥,此結果符合設想,但機制目前還不清楚。研究表明,斑馬魚感染SS2后可以通過刺激TLR2和髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)信號通路觸發促炎性細胞因子IL-6等的分泌,進而加深腦膜炎的炎癥反應[10],因此后續研究還將檢測這些觸發炎性細胞因子表達的相關信號通路的變化,分析免疫靶向DC重組蛋白較非靶向DC重組蛋白更有效緩解炎癥反應的相關機制。