內蒙古不同地區蜱類鑒定及其空間分布

崔夢宇 , 蘇 思 , 邢麗麗 , 木 蘭 , 高瑞娟 , 郭棋棋 , 任 洪 , 祁冬冬 , 于晶峰

(1.內蒙古醫科大學公共衛生學院 , 內蒙古 呼和浩特 010100 ; 2. 內蒙古醫科大學基礎醫學院 , 內蒙古 呼和浩特 010100 ;3. 內蒙古醫科大學第二附屬醫院 , 內蒙古 呼和浩特 010090 ; 4. 內蒙古醫科大學第一臨床醫學院 , 內蒙古 呼和浩特 010100 ;5. 呼倫貝爾市第三人民醫院精神疾病基礎與臨床實驗室 , 內蒙古 呼倫貝爾 022150)

蜱是一種吸血寄生蟲,可以傳播原生動物、立克次體、螺旋體和病毒等,被認為是僅次于蚊子的疾病傳播媒介。蜱可以寄生在家畜、野生動物和人類等脊椎動物身上[1-2],大多數蜱在飽血后脫離宿主,落到地面,受精的雌蜱脫離宿主后,在棲息地產卵繁殖[3]。蜱的一生中大部分時間脫離宿主,因此植被中有大量游離蜱存在。蜱分布廣泛但不均勻,以樹林、灌木叢和草地居多,放牧區域更是蜱類疾病的多發地帶[4]。因此,開展對寄生蜱和游離蜱的調查,對蜱傳疾病的預警和控制具有十分重要的意義。

內蒙古自治區位于我國北部邊疆,東西狹長,占地面積118.3萬平方公里,是我國第三大省區。毗鄰我國多個省份,并與蒙古國和俄羅斯接壤。內蒙古自治區生態環境差異較大,從極端的干旱區跨越到溫帶濕潤區,生態系統包括森林生態系統、草地生態系統、荒漠生態系統和農田生態系統等[5],但總體來說,內蒙古自治區屬高原草原型氣候,擁有我國豐富的草原牧區和重要的森林基地,得天獨厚的地理生態環境不僅為蜱的生長和繁殖提供了條件,也使得該地區成為我國蜱傳疾病的重要疫區之一[6-8]。由于蜱傳疾病具有自然疫源性,蜱標本的采集多在人跡罕至的森林和牧場,加上蜱的生活史特點,研究者們受采樣時間和地理位置所限,只能對內蒙古自治區的部分地區和部分蜱種分布進行研究,整體全局分布還不清楚。本試驗為了解內蒙古自治區蜱種類的分布情況,于2021—2023年首次在內蒙古自治區全境東部和西部選擇森林、草地、荒漠和農田等不同的生態環境開展蜱的調查。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 2×TaqPCR Mix預混液,購自生工生物工程(上海)股份有限公司;DL5 000 DNA Marker,購自寶日醫生物技術(北京)有限公司;CelRed核酸染料,購自蘭博利德生物技術有限公司(北京);Invitrogen瓊脂糖,購自Thermo Fisher Scientific公司(美國);血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、PGM-T Vector產物克隆試劑盒和TOP 10感受態細胞,均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器 凝膠成像系統ChampGel 5 000,北京賽智創業科技有限公司產品;NANODROP2000c,基因科技(上海)股份有限公司產品;瓊脂糖水平電泳槽,北京六一生物科技有限公司產品;SZ 680連續變倍體視顯微鏡,重慶奧特光學儀器有限責任公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 調查地點和時間 2021年4月—2023年7月對內蒙古自治區全境以分層隨機方式,對呼倫貝爾市新巴爾虎右旗、阿龍山鎮、牙克石市和大楊樹鎮,興安盟阿爾山市,赤峰市天山鎮,錫林郭勒盟蘇尼特右旗,鄂爾多斯市成川鎮,巴彥淖爾市烏拉特前旗、烏拉特中旗、烏拉特后旗和磴口縣共12個地區進行采樣。因巴彥淖爾市磴口縣緊靠阿拉善右旗,阿拉善盟為典型的荒漠區,已在巴彥淖爾市的荒漠生態系統采樣,故而并未在阿拉善盟采樣。具體采樣地點見圖1。

圖1 蜱樣本采樣地圖

1.3.2 調查方法 于2021—2023年蜱活躍期結合牧民參與調查的意愿,采用拖旗法和人工采集法

(使用鑷子輕輕將宿主體表寄生的蜱夾取并放入收集管中)對內蒙古自治區中12個調查地點進行采樣。

1.3.3 蜱形態學鑒定 在體視顯微鏡下觀察蜱的假頭、氣門板、生殖孔、盾板、須肢有無背刺或腹刺、哈式器、有無幾丁質增厚部等形態學特點,根據《蜱類學》[9]和《常見病媒生物分類鑒定手冊》[10]進行蜱形態學屬、種鑒定。

1.3.4 蜱DNA提取 將經形態學鑒定的蜱用75%酒精浸泡1 min消毒體表,用PBS清洗3遍,置于濾紙上將水分充分吸干。研缽、研磨杵和鑷子等提前高溫滅菌,使用前用液氮預冷,對調查地點的每個蜱種取1～2只蜱,單只一組充分研磨3遍。將研磨的蜱組織按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA。

1.3.5 引物合成 參考GenBank中軟蜱和硬蜱的18S rRNA、16S rRNA和細胞色素C氧化酶亞基Ⅰ(Cytochrome C oxidase subunit Ⅰ,COI)基因的序列,應用Oligo 7.0設計簡并引物(表1),引物序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 PCR引物信息

1.3.6 PCR擴增和測序 應用18S rRNA、16S rRNA和COI基因引物,以提取的DNA為模板,進行聚合

酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)擴增。PCR反應體系為20 μL:DNA模板1 μL,上、下游引物各0.5 μL,2×TaqMaster Mix 11 μL,ddH2O 7 μL。反應結束后,取5 μL PCR產物加入到1.5%瓊脂糖凝膠中,110 V、30 min條件下電泳,在凝膠成像系統中將目的片段的特異性條帶切下,用通用型DNA純化回收試劑盒回收目的片段。膠回收產物在16 ℃條件下與PGM-T Vector過夜連接,轉化至TOP 10感受態細胞中,并在含氨芐西林的LB固體培養基上進行陽性克隆篩選。挑取可疑菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養基擴大培養,將陽性菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.7 系統進化分析 將成功測序的18S rRNA、16S rRNA和COI基因序列與美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中GenBank數據庫序列進行同源性對比分析。使用MEGA 7軟件,采用最大似然(Maximum likelihood,ML)法[11],以微小扇頭蜱作為外群,經過1 000次的Bootstrap計算,分別構建3個基因的系統進化樹。

1.3.8 統計學分析 試驗得到的計數資料應用SPSS 22.0軟件對數據進行分析,使用χ2檢驗進行差異性顯著檢驗,P<0.05表示差異顯著。統計在不同宿主中采集的蜱種。按照公式(1)計算Jaccard相似性系數[12],分析不同生態環境中蜱群落相似性。

q=c/(a+b-c)

(1)

式中:a和b分別為2個群落各自所擁有的物種數目,c為2個群落共有的物種數目。當0≤q<0.25,2個群落間極不相似;當0.25≤q<0.50,2個群落間中等不相似;當0.50≤q<0.75,2個群落間中等相似;當0.75≤q≤1.00,2個群落間極相似。

2 結果

2.1 蜱形態學鑒定 共采集5 029只皆處于成蟲階段的蜱(表2),其中包括1 719只游離蜱和3 310只寄生蜱,于顯微鏡下進行形態結構觀察,結果顯示,所采集的蜱隸屬于2科5屬5種,分別為硬蜱科的草原革蜱(Dermacentornuttalli)、全溝硬蜱(Ixodespersulcatus)、邊緣璃眼蜱(Hyalommamarginatum)和嗜群血蜱(Haemaphysalisconcinna)以及軟蜱科的波斯銳緣蜱(Argaspersicus)。因未采集到雄性波斯銳緣蜱,故本試驗無法提供其參考照片。以上5種蜱的假頭基形狀、盾板、生殖孔和氣門板等有一定的區別(表3和圖2)。

表3 顯微鏡觀察不同品種蜱的主要鑒定特征

圖2 蜱的形態結構

2.2 PCR擴增 草原革蜱、全溝硬蜱、邊緣璃眼蜱、嗜群血蜱和波斯銳緣蜱的18S rRNA基因PCR擴增產物片段為756 bp,16S rRNA基因PCR擴增產物片段為420 bp,COI基因PCR擴增產物片段為557 bp(圖3),與預期大小相符。

圖3 蜱的18S rRNA(A)、16S rRNA(B)和COI(C)基因的PCR擴增

2.3 序列和系統發育分析 將成功測序的18S rRNA(GenBank序列號:OR 039313～OR 039324、OR 936234)、16S rRNA(GenBank序列號:OR 039050～OR 039061、OR 936207)和COI(GenBank序列號:OR 039519～OR 039530、OR 936649)基因序列與GenBank中的序列進行同源性對比分析,結果如圖4所示,本調查的草原革蜱、全溝硬蜱、邊緣璃眼蜱、嗜群血蜱和波斯銳緣蜱基因序列分別與GenBank中同種類蜱的基因序列同源性達96.0%以上,與同屬蜱種的基因序列在同一大支上,不同屬蜱種的基因序列在不同分支上;6個地理種群的草原革蜱混合分布,不存在地理隔離。18S rRNA基因系統發育樹顯示,同種類蜱的基因序列與GenBank中同屬種的參考基因序列自展值僅大于76.0%,無法鑒定到種水平;16S rRNA和COI基因序列與GenBank中同種類的參考基因序列比對,自展值均大于96.0%。

圖4 不同蜱種18S rRNA(A)、16S rRNA(B)和COI(C)基因的系統進化分析

2.4 不同生態壞境中蜱的構成 由表4可知,草原革蜱存在于除森林生態系統外的3種生態環境中,全溝硬蜱存在于森林生態系統和草地生態系統2種生態環境中,邊緣璃眼蜱和波斯銳緣蜱均只存在于荒漠生態系統,嗜群血蜱只存在于森林生態系統。不同的生態環境中分布的蜱種存在統計學差異(χ2=6 734.068,P<0.001)。在草地生態系統中存在的蜱較多(2 963只),占蜱總數的58.92%;其次是森林生態系統(1 721只),占蜱總數的34.22%。

表4 內蒙古自治區不同生態環境中采獲蜱的數量

2.5 不同生態環境中蜱群落相似性 由表5可知,森林生態系統與荒漠生態系統和農田生態系統均沒有相似性,相似性系數為0;草地生態系統與農田生態系統中等相似,相似性系數為0.50;草地生態系統與森林生態系統中等不相似,相似性系數為0.33;荒漠生態系統與農田生態系統和草地生態系統中等不相似,相似性系數分別為0.33和0.25。

表5 內蒙古自治區不同生態環境蜱群落Jaccard相似性系數

2.6 不同宿主采集的蜱種 由表6可知,山羊宿主所攜帶的蜱數量(2 202只,43.79%)最多,種類最豐富。采集的全溝硬蜱均為野外游離蜱,故未在表中呈現該蜱種的宿主情況。

表6 不同宿主采獲蜱情況

3 討論

本調查發現,草原革蜱是內蒙古自治區地區優勢蜱種,占此次采獲蜱總數的58.32%,這與黃天鵬[13]的研究結果一致。全溝硬蜱和嗜群血蜱主要分布在東北的黑龍江省和遼寧省,孳生地的溫度變化大是蜱種分布的主要影響因素,針闊混交林的覆蓋率越大越適合這2種蜱的生存。這2種成蜱的活動期均在4～8月,高峰在5月至6月初;其可以攜帶立克次體、森林腦炎病毒和發熱伴血小板減少綜合征病毒等[14-16]。草原革蜱主要分布在北方,包括內蒙古自治區等省份,該蜱一般在3月底至6月中旬積極活動,成蜱高峰為4月和5月,灌叢草地的覆蓋率越高越適合草原革蜱的生存;其可以攜帶斑點熱群立克次體、無形體、布魯氏菌和巴貝西蟲等蜱傳病原體[17]。璃眼蜱主要分布在新疆維吾爾自治區、內蒙古自治區和遼寧省等地區,荒漠草地的覆蓋率越高越適合該蜱的生存[18]。內蒙古自治區全區狹長,蜱種豐富,因地形各異可以形成各種獨特的小氣候,為不同蜱的生存提供了條件。因此,開展蜱媒的監測對蜱傳疾病的預防和控制具有重要意義。

本調查采用傳統形態學與分子生物學結合的方法對采集到的硬蜱和軟蜱進行蜱種鑒定,并總結了在國內分布較廣泛的硬蜱和軟蜱的形態學特征,可為后續研究提供參考。系統發育分析顯示,本調查的蜱種與GenBank中同屬蜱種的基因序列在同一大支上,不同屬蜱種的基因序列在不同分支上,表明分子生物學鑒定較為可靠,且可避免因幼蜱、樣本殘缺等無法進行蜱種鑒定的問題。基于16S rRNA和COI基因的系統發育結果顯示,草原革蜱與森林革蜱親緣關系較近,且在內蒙古自治區不同地區采集的草原革蜱在系統發育樹中混雜分布,并未出現地理隔離;但18S rRNA基因無法鑒定到物種水平,這與此前報道結果一致[11]。本調查尚有一定的不足:首先,此次采集樣本中未采獲雄性波斯銳緣蜱;其次,調查的宿主除牧區山羊和綿羊外,野生動物尚未涉及。后續可以擴大樣本的種類和來源,進一步開展蜱類空間分布特征等調查。

本調查對不同的生態環境中分布的蜱種差異進行卡方分析,以及對不同生態環境蜱群落進行相似性分析,均發現內蒙古自治區的森林、草地、農田和荒漠不同生態環境中蜱種分布有所差異,可能與蜱的分布受到空氣中濕度、溫度、植被類型和年度溫差變化等的影響有關,本調查在不同的生態系統中采集的蜱類與趙國平[19]的蜱類區系分布特點一致。同時,本調查對蜱蟲侵染的宿主進行分析,發現不同宿主中山羊感染的蜱蟲數量較多,以草原革蜱為主,可能與草原革蜱在內蒙古自治區分布廣泛有關,在本次采樣中也證實草原革蜱除大量存在于草原外,也存在于荒漠。全溝硬蜱僅在蒙東地區的森林生態環境中采集到游離蜱,未采集到寄生蜱,可能與蒙東地區溫差變化較大和植被類型豐富等因素有關。在對蜱蟲預防和控制過程中可針對不同生態環境、不同宿主采取更加有針對性的措施。

本調查于2021—2023年首次對內蒙古自治區全境不同生態環境中采集的蜱類進行生態環境差異分析和蜱種鑒定。內蒙古自治區畜牧業發達且擁有眾多林區和牧場,農牧民與蜱接觸較為密切,對該地區進行蜱的空間分布調查具有重要的醫學意義,本調查結果為內蒙古自治區蜱的防治工作提供了科學參考依據。