堆型艾美耳球蟲裂殖子外分泌蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用

葛玉杰 , 王黎霞 , 王詩琪 , 石夢(mèng)云 , 陳玲玲 , 王夢(mèng)琦 , 于 慧 , 張建軍 , 安 健

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 北京 昌平 102206 ; 2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 , 北京 房山 102442)

雞球蟲病是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲病,主要損害雞的腸道部位,在家禽養(yǎng)殖業(yè)中時(shí)常出現(xiàn),尤其是在集約化養(yǎng)殖場中最易暴發(fā),發(fā)病率可達(dá)50%～70%[1],嚴(yán)重影響了養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)收益。細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,在面對(duì)病原體感染時(shí),宿主細(xì)胞為了抑制病原體在體內(nèi)的增殖會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡,以此保護(hù)正常的細(xì)胞[2-3]。胞內(nèi)寄生蟲會(huì)通過一些途徑和機(jī)制來抑制宿主細(xì)胞的凋亡,逃避宿主細(xì)胞防御系統(tǒng)的殺傷作用,為自身在宿主細(xì)胞的生存和增殖提供有利的條件[4-5]。目前的研究表明,弓形蟲可通過干擾半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子κB(Nuclear transcription factor κB,NF-κB)活化、抑制線粒體細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放等途徑抑制宿主細(xì)胞的凋亡[4]。柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)裂殖子在入侵馬-達(dá)氏牛腎(Madin-Darby bovine kidney,MDBK)細(xì)胞早期可通過線粒體通路和NF-κB信號(hào)通路抑制宿主細(xì)胞凋亡[6],堆型艾美耳球蟲(Eimeriaacervulina)裂殖子在入侵MDBK細(xì)胞早期也有類似于柔嫩艾美耳球蟲裂殖子抑制MDBK細(xì)胞凋亡的機(jī)制[7]。然而,關(guān)于堆型艾美耳球蟲裂殖子與細(xì)胞在不直接接觸的情況下,對(duì)細(xì)胞凋亡影響的研究罕有報(bào)道。因此,本試驗(yàn)使用Transwell小室將堆型艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細(xì)胞相互隔開,共培養(yǎng)不同的時(shí)間點(diǎn),檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況,并對(duì)共培養(yǎng)6 h的細(xì)胞上清液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析鑒定,初步確定堆型艾美耳球蟲裂殖子是否會(huì)釋放外分泌蛋白抑制細(xì)胞凋亡,為進(jìn)一步探究球蟲外分泌蛋白調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基,購自北京愛普銳晟科技有限公司;胎牛血清(Fetal bovin serum,FBS),購自賽默飛世爾科學(xué)(美國)科技有限公司;胰蛋白酶粉、雙抗和PBS,均購自索萊寶生物科技有限公司;層析柱,購自思拓凡公司;DEAE-52纖維素、0.1 moL/L氯化氫(HCl)和0.1 mol /L氫氧化鈉(NaOH),均購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.2 主要儀器 100和200目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩,均購自紹興市上虞區(qū)豪泉篩具廠;勻漿機(jī),購自九陽股份有限公司;血球計(jì)數(shù)板,購自上海求精生化試劑儀器有限公司;Transwell小室(孔徑0.4 μm),購自美國Corning公司;倒置顯微鏡,購自美國Scilogex公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱,購自三洋公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞株和蟲株 1日齡白羽肉雞,購自北京市華都峪口禽業(yè)有限公司,在經(jīng)高溫滅菌后的房間內(nèi)飼養(yǎng)至14日齡。MDBK細(xì)胞,由北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。堆型艾美耳球蟲蟲株,由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)寄生蟲實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 堆型艾美耳球蟲裂殖子的分離純化 參照參考文獻(xiàn)[8]的方法,取14日齡的雛雞,每只雞感染2×105個(gè)堆型艾美耳球蟲孢子化卵囊,感染74 h后脫頸致死雛雞,取十二指腸,在預(yù)冷的洗脫液中刮取腸道黏膜,勻漿3 min,依次使用100和200目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩過濾。濾液于1 500 r/min離心10 min,棄去上清液;用預(yù)熱的洗脫液重懸沉淀,于600 r/min離心8 min,收集上清以去除紅細(xì)胞等雜質(zhì);最后于1 500 r/min離心10 min,收集沉淀,用預(yù)熱的洗脫液重懸。提前活化的DEAE-52纖維素加入適量預(yù)熱的洗脫液混勻倒入直徑1 cm、高約30 cm的層析柱中,纖維層析柱高約14 cm。將裂殖子重懸液緩慢均勻的沿著玻璃棒加入纖維層析柱中,用試管收集游過層析柱的裂殖子,用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.2 試驗(yàn)分組和處理 取出液氮中凍存的MDBK細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)蘇傳代,傳至第3代后以每孔3.5×105個(gè)/mL的密度均勻鋪至6孔板,培養(yǎng)24 h后,6孔板中架設(shè)Transwell小室,6孔板每孔被分為上室和下室兩部分。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)時(shí)間點(diǎn),分別為共培養(yǎng)1.5、3和6 h,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為2個(gè)組,共培養(yǎng)組(Co-culture group,上室加入0.5 mL約含有1.4×106個(gè)堆型艾美耳球蟲裂殖子的洗脫液)和對(duì)照組(Control group,上室加入0.5 mL洗脫液)。以上所有試驗(yàn)均設(shè)3組重復(fù)。

1.4.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別在共培養(yǎng)1.5、3和6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集共培養(yǎng)組和對(duì)照組的細(xì)胞,于1 000 r/min離心5 min,將各組的細(xì)胞收集至1.5 mL離心管,重懸至Binding Buffer中,加入PI和Annexin-V-FITC溶液,避光室溫孵育15 min,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。

1.4.4 LC-MS/MS分析 MDBK細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,將舊的細(xì)胞培養(yǎng)基換成不含雙抗和血清的高糖DMEM,架設(shè)Transwell小室,上室加入同1.4.2等量的堆型艾美耳球蟲裂殖子。共培養(yǎng)6 h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè),質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MaxQuant(V1.6.6)軟件進(jìn)行檢索,采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是Andromeda;通過與Uniprot數(shù)據(jù)庫中堆型艾美耳球蟲的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),鑒定樣品液中的蛋白質(zhì)成分。

1.4.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 利用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖,SPASS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 結(jié)果顯示,1.5 h對(duì)照組總細(xì)胞凋亡率為(6.70±0.13)%,1.5 h共培養(yǎng)組總細(xì)胞凋亡率為(5.92±0.19)%;3 h對(duì)照組總細(xì)胞凋亡率為(10.10±0.32)%,3 h共培養(yǎng)組總細(xì)胞凋亡率為(8.13±0.32)%;6 h對(duì)照組總細(xì)胞凋亡率為(13.33±0.13)%,6 h共培養(yǎng)組總細(xì)胞凋亡率為(11.57±0.37)%(表1)。在共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn),共培養(yǎng)組的總細(xì)胞凋亡率均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(圖1)。

圖1 對(duì)照組與共培養(yǎng)組在不同時(shí)間點(diǎn)的總細(xì)胞凋亡率

表1 各組細(xì)胞凋亡情況

2.2 LC-MS/MS分析 細(xì)胞培養(yǎng)液上清通過LC-MS/MS檢測(cè),與Uniprot數(shù)據(jù)庫中堆型艾美耳球蟲的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),共鑒定到65個(gè)外分泌蛋白,其中23個(gè)蛋白具有定量信息(圖2)。定量蛋白包括3個(gè)熱休克蛋白、1個(gè)微線蛋白、3個(gè)生化代謝酶相關(guān)蛋白、2個(gè)能量合成蛋白、1個(gè)蛋白磷酸酶、1個(gè)14-3-3蛋白、1個(gè)組蛋白、1個(gè)肌動(dòng)蛋白、1個(gè)延伸因子、1個(gè)真核翻譯起始因子和4個(gè)假定蛋白等(表2)。

圖2 LC-MS/MS分析鑒定結(jié)果

表2 定量蛋白的鑒定結(jié)果

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)具有分析細(xì)胞量大、操作簡捷和敏感性好等優(yōu)點(diǎn),成為了研究細(xì)胞凋亡的重要方法之一,可準(zhǔn)確檢測(cè)出細(xì)胞凋亡過程中各階段的情況[9]。Transwell小室可用于建立細(xì)胞共培養(yǎng)體系,研究細(xì)胞培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長和運(yùn)動(dòng)等的影響[10]。雞球蟲體外入侵試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲裂殖子均可以抑制凋亡誘導(dǎo)劑(6%乙醇)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[7,11]。鄭新楓等[12]將柔嫩艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細(xì)胞共培養(yǎng)12 h,發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞的Caspase2、3、6、8和9酶活性與對(duì)照組相比均顯著降低,細(xì)胞凋亡受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,堆型艾美耳球蟲裂殖子與MDBK細(xì)胞間接共培養(yǎng)6 h內(nèi)均可極顯著抑制細(xì)胞凋亡。以上試驗(yàn)結(jié)果說明堆型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲可通過相似的作用方式調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡,為自身在宿主體內(nèi)進(jìn)行長期且持續(xù)的慢性感染提供保障。

王騰[13]使用Transwell小室將弓形蟲與神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)弓形蟲排泄分泌抗原(Excretory/secretory antigens,ESA)可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)途徑誘導(dǎo)NSCs發(fā)生凋亡。毒害艾美耳球蟲外泌體(Exosome,Exo)能抑制雞胚成纖維(Chicken UMNSAH/DF-1,DF-1)細(xì)胞發(fā)生凋亡,此外,Exo中的鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)能促進(jìn)DF-1細(xì)胞的增殖,抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。本試驗(yàn)使用Transwell小室建立間接共培養(yǎng)體系,堆型艾美耳球蟲裂殖子未直接接觸MDBK細(xì)胞,鑒定的外分泌蛋白包括熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)、微線蛋白(Microneme protein,MIC)、14-3-3蛋白和假定蛋白(Hypothetical protein,HP)等,推測(cè)堆型艾美耳球蟲可能通過釋放外分泌蛋白抑制細(xì)胞凋亡。

外分泌蛋白在胞內(nèi)寄生蟲與宿主細(xì)胞相互作用中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。弓形蟲外分泌蛋白棒狀體蛋白18(Rhoptry protein 18,ROP18)可通過線粒體通路抑制宿主細(xì)胞凋亡[16];柔嫩艾美耳球蟲外分泌蛋白HP可以誘導(dǎo)雞巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡,尤其是早期的細(xì)胞凋亡[17]。柔嫩艾美耳球蟲和犬新孢子蟲均能夠通過含EGF樣結(jié)構(gòu)域的微線蛋白(Microneme protein containing EGF domain,EGF-MIC)與宿主表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor,EGFR)相互作用,激活宿主EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB) 等信號(hào)通路,進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和自噬等生理過程[18-19]。胞內(nèi)寄生蟲HSP90能夠與凋亡活化因子-1(Apoptosis active factor-1,Apaf-1)結(jié)合,在Cyt-C釋放、凋亡體復(fù)合物形成和Caspase啟動(dòng)等多個(gè)方面發(fā)揮抗凋亡作用[20]。李文桂等[21]研究表明,多房棘球絳蟲重組BCG-Em14-3-3疫苗能夠抑制感染小鼠脾細(xì)胞的凋亡。綜上所述,本試驗(yàn)堆型艾美耳球蟲裂殖子對(duì)MDBK細(xì)胞凋亡的抑制與鑒定的外分泌蛋白密切相關(guān),后續(xù)將對(duì)篩選的蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)相關(guān)通路中發(fā)揮的作用和機(jī)制進(jìn)行探究。