CRISPR/Cas12a技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測方面的應(yīng)用

孔玉方 , 王慧煜 , 袁向芬 , 許曉琳 , 吳紹強(qiáng)

(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院 動(dòng)物檢驗(yàn)與檢疫研究所 , 北京 大興 100176)

為加強(qiáng)我國國門生物安全,快速檢測技術(shù)成為當(dāng)下遏制外來動(dòng)物疫病傳入我國的有效方法之一。傳統(tǒng)的病毒檢測需要進(jìn)行病毒的分離培養(yǎng),細(xì)菌檢測需要經(jīng)過增菌擴(kuò)大培養(yǎng)后鑒定,比較耗時(shí)費(fèi)力,無法滿足動(dòng)物疫病的現(xiàn)場快速篩檢。近期,隨著核酸擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列及其相關(guān)蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and associated protein,CRISPR/Cas)系統(tǒng)檢測敏感度和特異性的提升以及檢測時(shí)間的縮短,該方法逐漸被應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測領(lǐng)域。

CRISPR-Cas系統(tǒng)為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列,是存在于古生菌和細(xì)菌中的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[1],能夠抵抗外來病菌的入侵,還具有“記憶性”,可以抵抗相同病菌的RNA或DNA的再次入侵,切斷病菌入侵路徑,使其無法進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。近年來,研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR及其相關(guān)的Cas12、Cas13和Cas14蛋白在小向?qū)NA(Small guide RNA,sgRNA)的引導(dǎo)下,不僅可以裂解特異的靶標(biāo)序列,還可非特異性切割單鏈DNA(Single-stranded DNA,ssDNA)或單鏈RNA(Single-stranded RNA,ssRNA),可基于上述原理設(shè)計(jì)特異性報(bào)告探針用于核酸的檢測。因樣本中靶病毒或細(xì)菌含量較少,研究者們通常將CRISPR/Cas系統(tǒng)與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)、重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase polymerase amplification,RPA)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)相關(guān)技術(shù)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)核酸含量增加的目的,使檢測信號擴(kuò)大,從而提高CRISPR/Cas系統(tǒng)檢測的敏感性和特異性[2]。本文主要針對CRISPR/Cas12a結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,闡明該系統(tǒng)目前在檢測中存在的問題,并對未來應(yīng)用場景進(jìn)行展望,以期為我國動(dòng)物疫病的防治提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐,為我國進(jìn)境動(dòng)物把好國門生物安全關(guān)卡,防止外來動(dòng)物疫病的入侵。

1 CRISPR/Cas12a檢測原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)大致分為2個(gè)大類和5個(gè)亞型,作為第2類V型CRISPR/Cas系統(tǒng)的Cas12a含有催化結(jié)構(gòu)域RuvC,Cas12a蛋白可以利用RuvC結(jié)構(gòu)域識別靶標(biāo)核酸中的前間隔序列鄰近基序(Protospacer adjacent motif,PAM),在sgRNA介導(dǎo)下與RPA產(chǎn)生的靶標(biāo)DNA形成三元復(fù)合體,sgRNA-Cas12a三元復(fù)合物通過識別富含T的PAM序列特異性切割雙鏈DNA(Double-stranded DNA,dsDNA)或ssDNA,激活并開始非特異性切割ssDNA兩端修飾的羧基熒光素-馬來酰亞胺,6-異構(gòu)體(FAM maleimide,6-isomer,FAM)熒光顯色基團(tuán)和黑洞猝滅劑-1(Black hole quencher 1,BHQ1)猝滅基團(tuán)[3-5],切斷后的熒光報(bào)告分子中的熒光顯色基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分離,在特定波長的光源照射下可產(chǎn)生熒光信號。當(dāng)含有靶標(biāo)基因時(shí),生物素作為報(bào)告分子,非特異性切割ssDNA兩端修飾的FAM熒光顯色基團(tuán)和Biotin生物素基團(tuán),膠體金標(biāo)記抗FAM抗體可以與FAM熒光顯色基團(tuán)結(jié)合,質(zhì)控線(C線)中的鏈霉親和素與生物素基團(tuán)結(jié)合顯色,抗FAM的二抗與膠體金-FAM熒光顯色基團(tuán)復(fù)合物結(jié)合,檢測線(T線)顯色,最終通過免疫層析試紙條實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化(圖1)[6-7]。該方法相較于傳統(tǒng)的核酸檢測方法具有無需特殊的儀器設(shè)備、操作簡單、檢測速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)(表1)[8]。目前,該技術(shù)已應(yīng)用于新冠病毒[9]、食品生物安全[10]、動(dòng)植物病毒[11-12]以及轉(zhuǎn)基因[13]等多個(gè)檢測領(lǐng)域。

表1 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的核酸檢測技術(shù)與傳統(tǒng)核酸檢測技術(shù)的比較

圖1 恒溫?cái)U(kuò)增和CRISPR/Cas12a可視化過程示意圖[7]

2 CRISPR/Cas12a在動(dòng)物疫病檢測方面的應(yīng)用

2.1 病毒疾病 非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、烈性和高度接觸性病毒性傳染病,可感染不同日齡和不同品種的家豬和野豬,病死率高達(dá)100%,給養(yǎng)豬業(yè)造成數(shù)以百億的經(jīng)濟(jì)損失。目前,ASF尚無有效的商品化疫苗和治療方法,只能通過快速精準(zhǔn)的診斷和撲殺等手段來控制該病的傳播。因此,開發(fā)高效快速的檢測技術(shù)對ASF的預(yù)防和控制意義重大。目前,市售的非洲豬瘟檢測試劑盒需要依賴大型儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員,不能滿足現(xiàn)場大批量樣品的快速篩查。池進(jìn)進(jìn)[14]利用重組酶、DNA聚合酶和RPA,在37 ℃恒

溫條件下即可擴(kuò)增DNA,與CRISPR/Cas12a的切割反應(yīng)相結(jié)合,建立了不依賴專業(yè)操作人員和大型昂貴儀器設(shè)備的ASFV檢測方法,實(shí)現(xiàn)了熒光檢測僅需30 min、可視化試紙條檢測僅需20 min,2種方法的檢測限均可達(dá)到10 copies/μL。Lu等[15]利用CRISPR/Cas12a技術(shù),在ASFV保守區(qū)域設(shè)計(jì)了較為合適的sgRNA,將RPA技術(shù)與免疫層析試紙條技術(shù)相結(jié)合,該方法不依賴傳統(tǒng)的PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增就能夠快速檢測到ASFV,可準(zhǔn)確檢測出豬臨床樣品中的ASFV,靈敏度也較常規(guī)qPCR高。Wang等[16]采用ASFV保守基因p72設(shè)計(jì)了多條sgRNA,并篩選出幾個(gè)高效的sgRNA用于ASFV的檢測,結(jié)果顯示,該檢測技術(shù)的敏感性較商業(yè)化試劑盒提高了約10倍,且與其他病毒無交叉反應(yīng)。He等[17]開發(fā)了一種高通量、全溶液相和等溫CRISPR/Cas12a的ASFV檢測系統(tǒng),能夠有效區(qū)分具有緊密匹配序列的核酸靶點(diǎn),該系統(tǒng)僅靠1個(gè)墨盒和熒光計(jì),在沒有核酸擴(kuò)增的情況下,2 h內(nèi)ASFV的檢測極限(Limit of detection,LoD)為1 pM,Cas12a/crRNA/ASFV DNA復(fù)合物在37 ℃這種生理溫度下高度穩(wěn)定,可以繼續(xù)切割ssDNA,將LoD提高100 fM,適用于無設(shè)備儀器工作環(huán)境的基層工作人員對ASFV的篩查工作。

非洲馬瘟(African horse sickness,AHS)是由非洲馬瘟病毒(African horse sickness virus,AHSV)引起的馬屬動(dòng)物疫病,對馬的致死率達(dá)90%以上,是所有馬類疾病中最嚴(yán)重致命的一種[18]。雖然我國迄今為止還沒有AHS疫情的發(fā)生,但隨著我國賽馬相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,馬屬動(dòng)物貿(mào)易往來日趨頻繁,增加了AHS的傳入風(fēng)險(xiǎn)。因此,為防止AHS的傳入,建立快速檢測AHS的方法尤為重要。黃超華等[19]基于實(shí)時(shí)重組酶介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增(Real-time recombinase-aid amplification,RT-RAA)和CRISPR/Cas12a特異性sgRNA,結(jié)合側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l建立了一種AHSV RT-RAA-CRISPR/Cas12a可視化快速檢測方法,該方法的最低檢測限為2.16×101copies/μL,與世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organisation for Animal Health,WOAH)推薦的RT-qPCR檢測結(jié)果高度一致,比較適用于口岸或野外現(xiàn)場AHSV的快速篩查。

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病,幼齡豬易感,死亡率高達(dá)100%。高效快速的現(xiàn)場大規(guī)模篩查是預(yù)防該病的重要舉措。目前,國內(nèi)外該病最常用的核酸檢測方法是逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈工反應(yīng)(Reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測技術(shù),該方法需要專業(yè)人員操作,無法滿足現(xiàn)場檢測的要求。胡輕輕[20]利用CRISPR/Cas12a能夠特異性切割目的基因和非特異性切割熒光報(bào)告分子的特點(diǎn),建立了現(xiàn)場檢測PRV的Cas12a核酸體系和CRISPR/Cas12a與側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l相結(jié)合的核酸檢測體系。Cas12a熒光檢測體系與PCR擴(kuò)增結(jié)合,雖延長了檢測時(shí)間,但靈敏度和特異性都有了很大提高;Cas12a熒光檢測體系與試紙條結(jié)合后,結(jié)果肉眼可觀,無需檢測儀器,易于野外和現(xiàn)場檢測。與實(shí)驗(yàn)室常用的RT-PCR相比,Cas12a熒光檢測體系耗時(shí)短、成本低,為豬偽狂犬病的早期預(yù)防和診斷提供了技術(shù)支持。

豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus diseases,PCVD)是由豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCVs)引起的一系列豬傳染性疾病的統(tǒng)稱,包括豬呼吸道疾病綜合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystcmic wasting syndrome,PMWS)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)、仔豬先天性震顫(Congenital tremors,CT)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和腸炎。豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是豬圓環(huán)病毒病的主要病原,該病毒的傳播給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,快速檢測對PCV2的凈化具有重要意義。范樂佳[21]利用CRISPR/Cas12a自身特性與RAA結(jié)合,通過RAA技術(shù)擴(kuò)增PCV2核酸再進(jìn)行CRISPR/Cas12a檢測,因檢測體系中加入ssDNA報(bào)告分子,其檢測結(jié)果可通過藍(lán)光照射或試紙條判讀,且均可在30 min內(nèi)獲取準(zhǔn)確結(jié)果。該檢測體系為PCV2的凈化提供了一種可行的技術(shù)手段。

2.2 細(xì)菌疾病 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是一種通過氣溶膠傳播的可引起人獸共患病的細(xì)菌。2018年,全球約有160萬人死于該細(xì)菌感染,而且該菌特別容易產(chǎn)生耐藥。對于結(jié)核分枝桿菌的早期快速檢測也是預(yù)防和治療該菌感染的關(guān)鍵。2018年,Ai等[22]在Chen等[23]建立的一種DNA核酸內(nèi)切酶靶向CRISPR反式報(bào)告(DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter,DETECTR)方法的基礎(chǔ)上,將該方法與Cas12a和RPA技術(shù)結(jié)合,用于結(jié)核病的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),基于CRISPR的活動(dòng)性結(jié)核病的診斷方法,具有接近單拷貝的靈敏度,并且還具有同時(shí)檢測與藥物反應(yīng)相關(guān)的多個(gè)位點(diǎn)的潛力,這對結(jié)核病的防治意義重大。Jia等[24]開發(fā)了一種新型的結(jié)核病診斷檢測平臺,稱為基于CRISPR-Cas12a生物傳感器系統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌多重交叉置換擴(kuò)增技術(shù)(Mycobacteriumtuberculosismultiple cross displacement amplification technique with CRISPR-Cas12a-based biosensing system,MTB-MCDA-CRISPR),通過CRISPR/Cas12a的檢測對MCDA結(jié)果進(jìn)行解碼,從而產(chǎn)生簡單的視覺熒光信號讀數(shù),LoD為40 fg/反應(yīng),并且不與非結(jié)核分支桿菌菌株和其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)。總之,MTB-MCDA-CRISPR檢測是一種很有前景且有效的結(jié)核病感染診斷、監(jiān)測和預(yù)防工具。

布魯氏菌病和類鼻疽伯克霍爾德菌病是2種人獸共患傳染病,均具有傳播性強(qiáng)和致病率高的特點(diǎn),嚴(yán)重威脅人類的生命安全。快速精準(zhǔn)地檢測病原體,是防止疫情擴(kuò)散、降低人民感染風(fēng)險(xiǎn)和減少我國養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的有效手段。徐健皓[25]建立了檢測布魯氏菌和類鼻疽伯克霍爾德菌的RPA檢測技術(shù),最低可檢測出50fg/反應(yīng)的羊布魯氏菌基因組DNA和100 fg/反應(yīng)的類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA,且所有檢測均可在10 min內(nèi)完成,將RPA與CRISPR/Cas12a結(jié)合檢測羊布魯氏菌基因組DNA和類鼻疽伯克霍爾德菌基因組DNA時(shí),最低檢測限分別為5 fg/反應(yīng)和20 fg/反應(yīng),所需檢測時(shí)間為40 min;雖然檢測時(shí)間延長了,但檢測細(xì)菌的靈敏度提高了很多。該檢測技術(shù)僅需金屬浴或者小巧輕便的加熱器就可以在野外或者現(xiàn)場實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的快速檢測,為布魯氏菌病和類鼻疽伯克霍爾德菌病的防治提供了新方法和新思路。

2.3 寄生蟲疾病 隱孢子蟲(Cryptosporidium)是一類寄生于人和多種動(dòng)物胃腸道的病原。微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum,C.parvum)是最常見的蟲種,其中II d亞型是最常見的亞型。最常被報(bào)道的微孢子蟲種是畢氏腸微孢子蟲(Enterocytozoonbieneusi,E.bieneusi)。隱孢子蟲除感染人外,還會感染家養(yǎng)畜禽、野生動(dòng)物和伴侶動(dòng)物等。感染這些腸道原蟲后,免疫功能較強(qiáng)的個(gè)體一般為無癥狀感染者;而免疫功能不健全的個(gè)體嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。這些病原對畜牧業(yè)的健康發(fā)展和人類的生命安全造成了極大的威脅。余復(fù)昌[26]建立的RPA-CRISPR/Cas12a可以快速檢測樣品中的C.parvumIId和E.bieneusi特異性核酸片段,最低可以分別檢測到1.9×10-18M的重組質(zhì)粒或每克糞便10個(gè)卵囊和3.7 copies/μL的E.bieneusiDNA,并且不與常見的腸道原蟲發(fā)生交叉反應(yīng),表明該檢測方法比較適用于臨床大批量樣品的檢測,對寄生蟲病的防控也具有一定的指導(dǎo)意義。Yu等[27]通過整合重組聚合酶擴(kuò)增和Cas12a/crRNA反式切割系統(tǒng),在藍(lán)光下通過肉眼即可觀察熒光試紙條檢測結(jié)果,LoD達(dá)到單個(gè)拷貝數(shù)的C.parvum60kDa糖蛋白,并且與細(xì)小梭菌或其他常見腸道寄生原生動(dòng)物無交叉反應(yīng)。

瘧疾是由瘧原蟲感染引起的一種最為嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病,2021年,全球有2.47億例瘧疾病例,61.9萬人死于瘧疾。雖然2021年6月世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)宣布我國通過了消除瘧疾的認(rèn)證,但是境外輸入瘧疾的風(fēng)險(xiǎn)依然存在[28-30]。對人體危害最大的是惡性瘧原蟲,常用的檢測方法有外周血涂片染色鏡檢法、酶聯(lián)免疫吸附法、PCR和RT-PCR等,這些方法存在耗時(shí)和操作繁瑣等缺陷。黃維益等[31]開發(fā)了一種簡單快速檢測惡性瘧原蟲的方法,以惡性瘧原蟲18S rRNA基因作為靶標(biāo)序列,建立了RAA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的恒溫?zé)晒饪焖贆z測惡性瘧原蟲的方法,可以檢測出1 copies/μL的含惡性瘧原蟲3D7株18S rRNA基因的質(zhì)粒;用該方法檢測50份臨床樣本的結(jié)果與巢式PCR一致性達(dá)100%,檢測稀釋后的臨床樣本,最低檢測限為50個(gè)瘧原蟲/μL。Wei等[32]開發(fā)并優(yōu)化了一種基于RPA和CRISPR/Cas12a對瘧原蟲分離株進(jìn)行檢測的平臺,結(jié)果顯示,瘧原蟲基因組質(zhì)粒的LoD為1 copies/μL,干血點(diǎn)的LoD為3.11～7.27個(gè)瘧原蟲/μL,且與血源性病原體無交叉反應(yīng)。RPA-CRISPR/Cas12a平臺檢測瘧原蟲和惡性瘧原蟲的準(zhǔn)確率分別為98.68%和94.74%,與巢式PCR的結(jié)果一致,優(yōu)于qPCR的結(jié)果,該平臺不需要核酸擴(kuò)增反應(yīng)的儀器或只需要最少的儀器,結(jié)果可以肉眼讀取。與類似的診斷方法相比,該平臺在降低檢測要求的同時(shí)提高了反應(yīng)速度。綜上結(jié)果表明,該方法有望用于惡性瘧原蟲的快速檢測和風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測[32]。CRISPR/Cas12a技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測中的應(yīng)用如表2所示。

表2 CRISPR/Cas12a結(jié)合RPA擴(kuò)增技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測中的應(yīng)用

3 小結(jié)與展望

CRISPR/Cas12a技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景。該技術(shù)與各種核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合,提高了檢測方法的靈敏度和特異性,且無需昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員就可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場的快速檢測。但CRISPR/Cas12a技術(shù)也存在一定的缺陷,單獨(dú)使用Cas12a進(jìn)行檢測的靈敏度較低,識別病原的難度較大,需要聯(lián)合等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)來提高模板量。但等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的缺陷也隨之呈現(xiàn),如酶的工作效率、引物的用量和反應(yīng)體系是否達(dá)到最佳配比等;CRISPR/Cas12a的sgRNA序列需設(shè)計(jì)在特定的PAM后,有時(shí)能夠滿足此設(shè)計(jì)條件的情況有限;RAA結(jié)合CRISPR/Cas12a系統(tǒng)提高了檢測的靈敏度,但當(dāng)將核酸擴(kuò)增產(chǎn)物加入Cas12a的切割體系中時(shí),開蓋容易造成氣溶膠的污染,導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。相信未來通過不斷的充分利用Cas12a的反式切割活性,簡化核酸擴(kuò)增的步驟,可以使CRISPR/Cas12a技術(shù)成為最為普遍的核酸檢測技術(shù)。總之,CRISPR/Cas12a技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測方面的優(yōu)勢值得進(jìn)一步挖掘和探索,相信在不久的將來也可以實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的現(xiàn)場快速定量檢測,為我國的國門生物安全保障提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。