低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)BTBR T+ Itpr3tf/J小鼠孤獨(dú)癥樣行為的影響☆

王心怡 蔡玉龍 李燕娜 袁琳瑛 花艷凡 李蕓子 藍(lán)文雅 劉新峰

孤獨(dú)癥譜系障礙（autism spectrum disorder，ASD）的核心癥狀是社交缺陷及刻板行為[1]，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，通常認(rèn)為與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)[2]，且臨床尚無(wú)針對(duì)核心癥狀的治療方法[3]。近年來(lái)，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）成為神經(jīng)精神疾病的研究熱點(diǎn)[4-6]，rTMS 對(duì)抑郁癥和強(qiáng)迫癥有很好的療效，但在ASD 中的應(yīng)用尚未取得確切證據(jù)。由于ASD 的發(fā)病機(jī)制不明、癥狀的異質(zhì)性較大[7]及磁刺激方案復(fù)雜多樣，目前開(kāi)展的rTMS 治療ASD 臨床研究雖觀察到一些行為和電生理結(jié)果的改善[8]，但尚未得出安全性及有效性的一致結(jié)論[9-10]，而相關(guān)基礎(chǔ)研究較少且尚未闡明磁刺激對(duì)ASD 療效的具體機(jī)制[11-12]。因此本研究結(jié)合臨床研究選取的刺激方案，著眼于ASD 的核心癥狀，用低頻rTMS 治療BTBRT+Itpr3tf/J（BTBR）ASD 模型鼠，試圖探究其治療效果及作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有實(shí)驗(yàn)經(jīng)金陵醫(yī)院動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)批準(zhǔn)。本研究選用的雄性BTBR小鼠和雄性B6小鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。BTBR小鼠隨機(jī)分配至孤獨(dú)癥模型+1 Hz rTMS治療組（BTBR+1 Hz組）和BTBR 組，B6 小鼠隨機(jī)分配至B6+1 Hz 組和對(duì)照組（B6 組），每組7 只。動(dòng)物在受控環(huán)境條件下飼養(yǎng)，12 h光/暗的循環(huán)，提供足量的食物和水。

1.2 低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激 使用丹麥MagVenture公司的MagPro X100 刺激器及配套120 mm圓形線圈。靜息運(yùn)動(dòng)閾值（resting motor threshold, RMT）為在10個(gè)刺激中至少5個(gè)刺激可以誘發(fā)目標(biāo)肌肉超過(guò)50 μV運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位的最小刺激強(qiáng)度。BTBR+1 Hz 組和B6+1 Hz組刺激強(qiáng)度采用90% RMT，頻率為1 Hz。每天15個(gè)序列，每個(gè)序列包含30個(gè)刺激，序列間隔20 s，共450個(gè)刺激。BTBR組和B6組進(jìn)行假刺激。磁刺激治療在小鼠6 周大時(shí)開(kāi)始，每天1 次，連續(xù)5 d，休息2 d，再治療5 d，總計(jì)在12 d內(nèi)刺激10 d。用50 mL離心管制作約束裝置固定小鼠[13]。治療前1天將小鼠放入約束裝置3次，每次5 min。假刺激組的治療與刺激組同時(shí)進(jìn)行，使用同樣大小但未插電的線圈，以保證和刺激組相比接受了除磁刺激以外相同的刺激。

1.3 行為學(xué)測(cè)試 治療結(jié)束后次日開(kāi)始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，各項(xiàng)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)間隔3 d，以防止前一個(gè)實(shí)驗(yàn)的影響。測(cè)試當(dāng)天至少提前1 h讓小鼠適應(yīng)環(huán)境。每只小鼠測(cè)試結(jié)束，用75%乙醇清洗裝置并等待至少5 min使氣味消散。

1.3.1 三箱社交實(shí)驗(yàn) 采用三箱社交實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠社交能力[14]。實(shí)驗(yàn)箱采用具有3個(gè)等大腔室的裝置（60 cm × 40 cm × 22 cm），相鄰腔室間有允許小鼠通過(guò)的小門(mén)。實(shí)驗(yàn)包括3個(gè)階段，每階段10 min：習(xí)慣化階段，將小鼠放入中間腔室，允許其自由探索3個(gè)腔室；社交偏好測(cè)試，將1 只陌生小鼠（同品系，同性別，同年齡）放在側(cè)室中，另一側(cè)室內(nèi)放置新物體，允許其再次探索；社交新奇偏好測(cè)試，將新物體替換成另1 只陌生小鼠，讓其再次探索。使用ANYmaze 7.08計(jì)算小鼠在每個(gè)側(cè)室中花費(fèi)的時(shí)間。小鼠處在陌生小鼠側(cè)室的時(shí)間比新物體或熟悉小鼠的側(cè)室時(shí)間長(zhǎng)，表明小鼠具有正常的社交偏好。

1.3.2 理毛實(shí)驗(yàn)、埋珠實(shí)驗(yàn) 采用理毛及埋珠實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠刻板行為[14]。理毛實(shí)驗(yàn)是將受試小鼠放入干凈無(wú)墊料的透明籠子中，攝像機(jī)放置在離籠子至少15 cm 處錄像20 min，統(tǒng)計(jì)后10 min 的理毛時(shí)間。理毛時(shí)間的長(zhǎng)短反映刻板行為的多少。埋珠實(shí)驗(yàn)是在籠子中放置5 cm 厚的碎玉米芯墊料，將20 個(gè)大理石珠按照5×4 的排列方式均勻放置在墊料上。將受試小鼠輕放籠中。30 min 后，計(jì)算覆蓋超過(guò)50%的大理石珠的數(shù)量。埋珠數(shù)量越多，表明小鼠刻板行為越多。

1.3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠運(yùn)動(dòng)能力及焦慮水平[14]。將小鼠置于灰色亞克力裝置（50 cm×50 cm×40 cm）中心，允許小鼠自由活動(dòng)5 min。使用ANYmaze 7.08評(píng)估運(yùn)動(dòng)總距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和在中央?yún)^(qū)花費(fèi)的時(shí)間。運(yùn)動(dòng)總距離的多少反映小鼠運(yùn)動(dòng)能力的好壞。小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)和在中央?yún)^(qū)花費(fèi)的時(shí)間減少提示存在焦慮。

1.3.4 懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 采用懸尾及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)評(píng)估小鼠抑郁水平。懸尾實(shí)驗(yàn)固定小鼠尾部后三分之一處使小鼠懸掛，鼻尖距桌面約15 cm，如果攀爬尾巴，則該小鼠剔除。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)將小鼠放在裝有20 cm深溫水的圓桶（高25 cm，直徑10 cm）中。記錄小鼠6 min的活動(dòng)，統(tǒng)計(jì)后4 min內(nèi)的不動(dòng)時(shí)間。小鼠的不動(dòng)時(shí)間較長(zhǎng)提示存在抑郁。

1.4 炎癥因子檢測(cè) 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）檢測(cè)皮質(zhì)及海馬中白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、白介素-18（interleukin-18，IL-18）、白介素-23（interleukin-23，IL-23）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）水平。麻醉小鼠后灌注0.9%生理鹽水，取腦分離皮質(zhì)及海馬。組織勻漿取上清液，使用武漢華美生物工程有限公司（IL-1β：CSB-E08054m，IL-18：CSB-E04609m，IL-23：CSB-E08463m，TNF-α：CSB-E04741m，IFN-γ：CSB-E04578m）和abcam（IL-6：ab100713）試劑盒，加入生物素標(biāo)記的抗體工作液，37 ℃溫育1 h，洗板，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記親和素工作液，37 ℃溫育1 h，洗板，加底物37 ℃避光顯色，加終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處OD值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad Prism 9.3.1 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以±s描述。三箱社交實(shí)驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)[15]對(duì)兩側(cè)室時(shí)間進(jìn)行組內(nèi)比較。其余實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用雙因素（模型因素和rTMS 治療因素）方差分析法進(jìn)行組間比較[16]，并使用Tukey 法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 三箱社交實(shí)驗(yàn) 習(xí)慣化階段，各組小鼠在兩個(gè)側(cè)室的時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。社交偏好測(cè)試中，BTBR+1 Hz組（t=3.167，P=0.019）、B6+1 Hz組（t=3.247，P=0.018）和B6 組（t=2.800，P=0.031）處在陌生小鼠側(cè)室時(shí)間較新物體側(cè)室時(shí)間更長(zhǎng)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BTBR 組處在兩側(cè)室時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.645，P=0.543）。社交新奇偏好測(cè)試中，BTBR+1 Hz 組（t=3.521，P=0.013）、B6+1 Hz 組（t=2.550，P=0.044）和B6組（t=3.230，P=0.018）偏好陌生小鼠側(cè)室，BTBR 組（t=0.678，P=0.523）對(duì)陌生小鼠側(cè)室無(wú)偏好。見(jiàn)圖1、表1。

Tab.1 Time in each chamber during the three-chambered social approach task表1 三箱社交實(shí)驗(yàn)小鼠處在各腔室時(shí)間

Fig.1 Representative heat map of the three-chambered social approach task圖1 三箱社交實(shí)驗(yàn)代表性熱圖 A.社交偏好測(cè)試；B.社交新奇偏好測(cè)試。顏色越紅表明停留時(shí)間越長(zhǎng)。

2.2 理毛、埋珠、曠場(chǎng)、懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 理毛實(shí)驗(yàn)中，模型因素（F=9.865，P=0.004）、治療因素（F=8.623，P=0.007）和交互作用（F=10.040，P=0.004）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BTBR 組小鼠較B6組小鼠理毛時(shí)間延長(zhǎng)（P＜0.001），BTBR+1 Hz 組小鼠理毛時(shí)間較BTBR組小鼠減少（P=0.001）。見(jiàn)表2。

Tab.2 Results of self-grooming, marble burying, open field, tail suspension, and forced swimming tests表2 理毛、埋珠、曠場(chǎng)、懸尾、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果

埋珠實(shí)驗(yàn)中，埋珠個(gè)數(shù)模型因素（F=86.230，P＜0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而治療因素（F=0.383，P=0.542）和交互作用（F=0.862，P=0.362）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)動(dòng)總距離的模型因素（F=0.113，P=0.739）、治療因素（F=0.098，P=0.757）和交互作用（F＜0.001，P=0.995）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)的模型因素（F=5.019，P=0.035）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=0.645，P=0.430）和交互作用（F=0.002，P=0.967）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中央?yún)^(qū)總時(shí)間的模型因素（F=12.850，P=0.002）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=0.079，P=0.781）和交互作用（F=0.366，P=0.551）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

懸尾實(shí)驗(yàn)中，不動(dòng)時(shí)間的模型因素（F=0.401，P=0.533）、治療因素（F=0.625，P=0.437）和交互作用（F=0.425，P=0.521）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中，不動(dòng)時(shí)間的模型因素（F=0.182，P=0.674）、治療因素（F=0.950，P=0.340）和交互作用（F=0.042，P=0.840）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.3 皮質(zhì)及海馬的炎癥因子 小鼠皮質(zhì)中，IL-1β的模型因素（F=10.400，P=0.004）、治療因素（F=34.380，P＜0.001）和交互作用（F=8.459，P=0.008）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6 的模型因素（F=1.680，P=0.207）、治療因素（F=1.263，P=0.272）和交互作用（F=1.072，P=0.311）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-18 的模型因素（F=11.900，P=0.002）、治療因素（F=40.470，P＜0.001）和交互作用（F=6.518，P=0.018）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-23 的模型因素（F=1.810，P=0.191）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=13.730，P=0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，交互作用（F=0.501，P=0.486）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α 的模型因素（F=2.746，P=0.111）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=4.967，P=0.036）和交互作用（F=7.243，P=0.013）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ 的模型因素（F=1.839，P=0.188）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=8.748，P=0.007）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，交互作用（F=2.622，P=0.119）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。事后分析顯示，BTBR 組小鼠IL-1β（P=0.001）、IL-18（P=0.002）、TNF-α（P=0.025）較B6 組小鼠升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rTMS 治療后，BTBR+1 Hz 組小鼠皮質(zhì)IL-1β（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）和TNF-α（P=0.010）較BTBR組小鼠降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

Tab.3 ELISA results for cortical and hippocampal cytokines表3 皮質(zhì)、海馬炎癥因子ELISA結(jié)果

小鼠海馬中，IL-1β 的模型因素（F=4.404，P=0.047）、治療因素（F=33.660，P＜0.001）和交互作用（F=15.600，P＜0.001）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-6 的模型因素（F=8.325，P=0.008）、治療因素（F=23.530，P＜0.001）和交互作用（F=7.213，P=0.013）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-18 的模型因素（F=0.820，P=0.374）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=40.780，P＜0.001）和交互作用（F=16.600，P＜0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-23 的模型因素（F=1.011，P=0.325）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療因素（F=20.400，P＜0.001）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，交互作用（F=3.837，P=0.062）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TNF-α 的模型因素（F=11.020，P=0.003）、治療因素（F=8.846，P=0.007）和交互作用（F=10.530，P=0.003）均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IFN-γ 的模型因素（F=13.770，P=0.001）、治療因素（F=5.753，P=0.025）和交互作用（F=13.190，P=0.001）均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。事后分析顯示BTBR 組小鼠IL-1β（P=0.001）、IL-6（P=0.003）、IL-18（P=0.009）、TNF-α（P＜0.001）和IFN-γ（P＜0.001）水平較B6組小鼠升高；rTMS治療后，BTBR+1 Hz組小鼠IL-1β（P＜0.001）、IL-6（P＜0.001）、IL-18（P＜0.001）、TNF-α（P=0.001）和IFN-γ（P=0.001）較BTBR組小鼠降低。見(jiàn)表3。

3 討論

ASD 影響著全球約1%的兒童，但FDA 尚未批準(zhǔn)任何針對(duì)其核心癥狀的干預(yù)措施。基于既往研究，本研究使用低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激治療BTBR ASD 模型鼠，探究其療效及可能機(jī)制。使用三箱社交實(shí)驗(yàn)評(píng)估社交能力，結(jié)果表明具有正常行為學(xué)表型的B6組小鼠表現(xiàn)出社交偏好，而B(niǎo)TBR組小鼠表現(xiàn)出社交缺陷，rTMS 治療后，BTBR+1 Hz 組小鼠的社交缺陷改善。使用理毛和埋珠實(shí)驗(yàn)評(píng)估刻板行為：理毛實(shí)驗(yàn)顯示BTBR組小鼠刻板行為較B6組小鼠增加，rTMS治療顯著改善了BTBR 組小鼠的理毛時(shí)間；埋珠實(shí)驗(yàn)顯示BTBR小鼠埋珠數(shù)量較B6小鼠多，而1 Hz rTMS 不影響小鼠埋珠數(shù)量。該結(jié)果表明1 Hz rTMS 可以調(diào)控BTBR 小鼠特定類型的刻板行為[17-18]。

為避免運(yùn)動(dòng)能力、焦慮水平對(duì)孤獨(dú)癥核心癥狀的行為學(xué)影響，使用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步評(píng)估各組小鼠狀態(tài)。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組小鼠運(yùn)動(dòng)能力相仿，而B(niǎo)TBR 小鼠較B6 小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)多且處在中央?yún)^(qū)的時(shí)間長(zhǎng)，表明BTBR 小鼠具有更低的焦慮水平，這與既往的研究結(jié)果相吻合[19]。1 Hz rTMS不影響小鼠的運(yùn)動(dòng)能力及焦慮水平。為了檢測(cè)抑郁樣行為，本研究采用懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示1 Hz rTMS 對(duì)各組小鼠抑郁樣行為沒(méi)有顯著影響。

既往研究認(rèn)為皮質(zhì)[20-21]和海馬[22-23]的炎癥參與ASD 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[24-26]，ASD 的發(fā)病也與妊娠期母體的急慢性炎癥相關(guān)[27]。已有研究發(fā)現(xiàn)，ASD 患者腦脊液中IL-6 和TNF-α 等炎癥因子增加[24]，而高濃度的炎癥因子可通過(guò)降低長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用損害突觸可塑性[28]，同時(shí)小膠質(zhì)細(xì)胞活化會(huì)釋放更多的IL-6、TNF-α 等炎癥因子[29]。而rTMS 可以直接影響皮質(zhì)及海馬的炎癥反應(yīng)[4,30-31]，這可能是通過(guò)TNF-α 減少實(shí)現(xiàn)的[28,32]，同時(shí)rTMS 可以通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞功能進(jìn)而影響突觸可塑性及炎癥因子水平的變化[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)BTBR 組小鼠皮質(zhì)中IL-1β、IL-18、TNF-α和海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和IFN-γ 表達(dá)較B6 組小鼠明顯升高，而B(niǎo)TBR+1 Hz 組小鼠皮質(zhì)IL-1β、IL-18 和TNF-α 及海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α 和IFN-γ的水平較BTBR組顯著降低。此外，1 Hz rTMS顯著降低小鼠皮質(zhì)IL-23、IFN-γ及海馬IL-23水平。這些結(jié)果提示，1 Hz rTMS 可能是通過(guò)抑制腦內(nèi)炎癥水平，進(jìn)而發(fā)揮治療BTBR ASD模型鼠的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)1 Hz rTMS 能顯著降低BTBR 小鼠皮質(zhì)IL-1β、IL-18、IL-23、TNF-α 和IFN-γ 及海馬中IL-1β、IL-6、IL-18、IL-23、TNF-α和IFN-γ 的炎癥因子水平，進(jìn)而改善BTBR ASD 模型鼠的社交缺陷及刻板行為，且對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和焦慮抑郁水平?jīng)]有影響。這提示rTMS 可能通過(guò)抑制炎癥水平，發(fā)揮治療ASD的作用，為rTMS治療ASD的應(yīng)用提供了一定理論基礎(chǔ)，但是其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。