miR-185過表達對MPP+誘導帕金森病模型細胞損傷的影響及其機制

劉嘯，張磊，陶偉

1 聊城市第二人民醫院神經內科，山東聊城 252600；2 聊城市第二人民醫院腫瘤內科

帕金森病（PD）是一種發病率僅次于阿爾茨海默病的神經退行性疾病，多發生于中老年人群［1］。PD 最主要的神經病理改變是中腦黑質致密部的多巴胺能神經元變性丟失和路易斯小體形成［2］。迄今為止，PD 的發病機制仍未完全闡明，臨床尚不能完全治愈。有研究認為，多巴胺能神經元過度凋亡和氧化應激是PD 進展的重要原因［3］。因此，抑制多巴胺能神經元凋亡和氧化應激損傷有可能成為阻止PD 進展的有效措施。微小RNA（miRNA）是真核生物中廣泛存在的一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，可參與轉錄后基因表達的調控，在維持神經元存活及其正常功能中具有重要作用。有研究報道，多種miRNA 在PD 中異常表達［4-6］。miR-185 是miRNA家族成員之一。有研究報道，在PD 患者血清中miR-185 表達下調［7］，在PD 大鼠中腦黑質和紋狀體中也發現miR-185 表達降低［8］。但miR-185 在PD 發病中的分子機制尚不清楚。1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）能夠引起神經細胞氧化應激損傷甚至凋亡，是目前最常用的PD 細胞模型誘導劑［9］。2022 年6月—12 月，本研究利用MPP+誘導PC12 細胞建立了PD細胞模型，并進一步探討了miR-185過表達對PD細胞增殖、凋亡和氧化應激損傷的影響。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠PC12 細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MPP+，純度≥98%，購自美國Sigma 公司。miR-185 模擬物（miR-185 mimics）、陰性對照模擬物（NC mimics）以及所有引物序列，購自生工生物工程（上海）股份有限公司。實時熒光定量PCR儀，購自美國ABI公司；多功能酶標儀，購自瑞士TECAN 公司；流式細胞儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，購自寶生物工程（大連）有限公司；CCK-8、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）ELISA 試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司。Bcl-2、Bax、GAPDH 一抗及HRP 標記的IgG二抗，購自美國Santa Cruz公司。

1.2 細胞傳代培養 將PC12細胞從液氮罐中取出，在37 ℃水浴中快速復蘇，然后接種于含10% FBS、1%青鏈霉素雙抗的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2條件下培養。每隔2天更換一次培養基。待細胞生長融合至80%左右時，0.25%胰蛋白酶消化、計數，按1∶3傳代。取傳3代、對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 PD 細胞模型構建與分組轉染 取傳3 代、對數生長期PC12 細胞，按1×105個/孔接種于96 孔板，隨機分為對照組、模型組、NC mimics 組、miR-185 mimics 組。然后將96 孔板于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h，模型組、NC mimics 組、miR-185 mimics 組予1 mmol/L MPP+誘導PD細胞模型［10-12］，對照組不予MPP+誘導。成模24 h，NC mimics組、miR-185 mimics組按LipofectamineTM2000 說明分別轉染NC mimics、miR-185 mimics。對照組和模型組不予轉染。轉染6 h更換新鮮培養基，繼續培養24 h。收集各組細胞，采用TRIzol 法提取細胞總RNA，經紫外可見分光光度計鑒定，OD260/OD280為1.8～2.0。按PrimeScriptTMRT Master Mix 說明，將總RNA 逆轉錄合成為cDNA。以cDNA 為模板，按SYBR Premix Ex TaqTMⅡ說明進行PCR擴增。引物序列：miR-185上游引物5'-CAATGGAGAGAAAGGCAGTTCC-3'、下游引物5'-AATCCATGAGAGATCCCTACCG-3'，U6 上游引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'、下游引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3'。PCR反應體系共20 μL：cDNA模板1 μL，上下游引物各0.8 μL，2 × SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，ddH2O 7.4 μL；反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s、58 ℃ 60 s 共40 個循環。以U6 為內參，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量。

1.4 細胞增殖活性檢測 采用CCK-8 法。取上述各組細胞，用含10% FBS 的DMEM 培養液重懸，制成密度為5×104/mL單細胞懸液。取細胞懸液200 μL，接種于96孔板，然后將96孔板于37 ℃、5% CO2條件下培養。分別于培養24、48、72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h。酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔的OD 值。以OD450值作為細胞增殖活性。

1.5 細胞凋亡檢測 采用流式細胞術。取上述各組細胞，用不含EDTA 的胰蛋白酶消化，加入1 ×Bingding Buffer 重懸。取細胞懸液5 mL 至流式管中，然后依次加入Annexin V-FITC 5 μL 和PI 5 μL，充分混勻，室溫避光孵育15 min，上流式細胞儀檢測。

1.6 GSH、SOD、MDA檢測 取上述各組細胞，超聲波破碎，10 000 r/min 離心10 min、離心半徑10 cm，收集上清液。采用ELISA法檢測GSH、SOD、MDA。

1.7 Bcl-2、Bax蛋白表達檢測 采用Western blotting法。取上述各組細胞，加入細胞裂解液冰上充分裂解，提取細胞總蛋白，經BCA 法蛋白定量合格。然后加入5 × 蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴，使蛋白充分變性。取變性蛋白30 μg，SDS-PAGE 分離。電泳結束，采用濕轉法將蛋白電泳產物轉印至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入Bcl-2（稀釋比1∶1 000）、Bax（稀釋比1∶1 000）、GAPDH（稀釋比1∶2 000）一抗，4 ℃孵育過夜。次日，加入HRP 標記的IgG 二抗，室溫孵育1 h。ECL 發光，暗室內曝光、顯影、定影。采用Quantity One 軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值。以目的蛋白電泳條帶灰度值/內參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法 采用SPSS20.0 統計軟件。正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組miR-185 表達比較 對照組、模型組、NC mimics組、miR-185 mimics組miR-185相對表達量分別為1.01 ± 0.03、0.61 ± 0.10、0.57 ± 0.12、1.97 ±0.22。與對照組比較，模型組和NC mimics組miR-185相對表達量均顯著降低（t分別為9.38、8.71，P均＜0.05），而miR-185 mimics 組miR-185 相對表達量顯著升高（t=10.59，P＜0.05）；與模型組比較，NC mimics組miR-185 相對表達量變化不明顯（t=0.63，P＞0.05），miR-185 mimics組miR-185相對表達量顯著升高（t=13.79，P＜0.05）；與NC mimics組比較，miR-185 mimics 組miR-185 相對表達量顯著升高（t=13.68，P＜0.05）。

2.2 各組細胞增殖活性和細胞凋亡率比較 見表1。

表1 各組細胞增殖活性和細胞凋亡率比較（± s）

表1 各組細胞增殖活性和細胞凋亡率比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與NC mimics組比較，△P＜0.05。

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2.3 各組GSH、SOD、MDA含量比較 見表2。

表2 各組GSH、SOD、MDA含量比較（± s）

表2 各組GSH、SOD、MDA含量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與NC mimics組比較，△P＜0.05。

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2.4 各組Bcl-2、Bax蛋白表達比較 見表3。

表3 各組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較（± s）

表3 各組Bcl-2、Bax蛋白相對表達量比較（± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與NC mimics組比較，△P＜0.05。

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3 討論

PD 是一種中老年人常見的神經退行性疾病。近年來，隨著人口老齡化加劇，PD 的患病率逐年上升。PD 的發病機制非常復雜，可能是遺傳因素、環境因素、神經系統老化等共同作用所致，但其具體發病機制仍未完全闡明。中腦黑質致密部的多巴胺能神經元丟失是PD最主要的神經病理學特征，而氧化應激可能是導致多巴胺能神經元丟失的關鍵驅動因素，也被認為是PD重要的發病機制之一。外源性神經毒素誘導的動物或細胞模型是研究PD 的重要工具。MPP+是神經毒素MPTP 的一種毒性代謝物，能夠選擇性破壞黑質多巴胺能神經元，被廣泛用于PD相關動物和細胞模型構建以及PD 的藥物研發［10-12］。本研究采用1 mmol/L MPP+誘導PC12細胞成功構建了PD 細胞模型，這也是目前國內外應用較多的PD細胞建模方法。

miRNA 是一類內源性非編碼單鏈小RNA 分子，可參與轉錄后基因表達的調控，在維持神經元存活及其正常功能中具有重要作用。有研究報道，在PD患者血漿和腦組織中存在多種miRNA 異常表達［13］，其在神經退行性疾病的病理生理過程中發揮重要作用。CHEN等［14］研究報道，PD患者血漿中miR-133b、miR-221-3p 表達升高，二者均可作為PD 早期診斷的非侵入性生物標志物。GONG 等［15］研究發現，miR-132-3p在PD患者血清和細胞模型中高表達，其高表達可誘導小膠質細胞活化，從而參與PD的病理生理過程。DONG 等［16］研究發現，在PD 細胞模型中miR-421 表達升高、MEF2D 表達降低，miR-421 高表達可通過負調控MEF2D表達而促進多巴胺能神經元死亡。miR-185是miRNA 家族成員之一。有研究報道，在PD 患者血清中miR-185 表達下調［7］，在PD 模型大鼠中腦黑質和紋狀體中也發現miR-185 表達降低［8］，提示miR-185可能在PD發病中起著重要作用。

本研究結果發現，與對照組比較，模型組培養24、48、72 h 細胞增殖活性均顯著降低，細胞凋亡率顯著升高；抗氧化物GSH、SOD 含量均顯著降低，過氧化產物MDA 含量顯著升高；凋亡抑制因子Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，促凋亡因子Bax 蛋白相對表達量顯著升高。結果表明，PD 細胞模型構建成功。本研究通過RT-qPCR 檢測發現，模型組miR-185 表達明顯低于對照組。為了進一步探討miR-185 對PD 細胞增殖、凋亡和氧化應激損傷的影響，本研究將miR-185 mimics、NC mimics 轉染PD 模型細胞，結果發現，miR-185 mimics 組miR-185 相對表達量明顯高于NC mimics 組，表明miR-185 mimics的轉染效率較高。本研究結果還發現，與NC mimics組比較，miR-185 mimics 組培養24、48、72 h 細胞增殖活性均顯著升高，細胞凋亡率顯著降低；抗氧化物GSH、SOD 含量均顯著升高，過氧化產物MDA 含量顯著降低；凋亡抑制因子Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高，促凋亡因子Bax 蛋白相對表達量顯著降低。結果提示，miR-185 過表達能夠提高PD 細胞增殖活性并抑制其凋亡，具有明顯的保護作用。

綜上所述，miR-185 過表達能夠促進PD 細胞增殖并抑制其凋亡，具有明顯的保護作用；減輕氧化應激損傷以及抑制Bax 蛋白表達和促進Bcl-2 蛋白表達可能是其作用機制之一。