血清學(xué)檢測和基因分型在ABO疑難血型鑒定中的性能評價

關(guān)茵,張國平,劉文超,裴垚昶,郭超群

(1.焦作市中心血站 a.血型室;b.業(yè)務(wù)科,河南 焦作 454000;2.焦作市第二人民醫(yī)院 輸血科,河南 焦作 454000;3.焦作市人民醫(yī)院 輸血科,河南 焦作 454000)

ABO血型系統(tǒng)是一種廣泛存在于人類中的遺傳現(xiàn)象,常常被用于獻(xiàn)血、輸血、器官移植等臨床操作中[1]。ABO血型系統(tǒng)是判斷獻(xiàn)血和輸血相容性最基本的指標(biāo)之一[2]。根據(jù)ABO血型系統(tǒng)的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應(yīng)該采取不同的獻(xiàn)血和輸血策略,以避免引起輸血反應(yīng)等不良后果[3]。在基因測序技術(shù)出現(xiàn)后,它成為了ABO血型系統(tǒng)分型鑒定的 “金標(biāo)準(zhǔn)”,因為基因測序能夠非常準(zhǔn)確地揭示ABO基因的遺傳信息。同時,利用基因測序技術(shù)可以檢測到常規(guī)檢測方法無法檢測到的罕見ABO亞型,從而提高檢測的準(zhǔn)確性[4]。然而,基因測序技術(shù)的成本較高,操作難度大,需要專業(yè)人員進行操作和解讀結(jié)果,因此在臨床實踐中并不是所有情況下都會使用基因測序技術(shù)進行ABO血型鑒定[5]。基因分型檢測和血清學(xué)檢測都是常用的血型鑒定方法,不過兩種方法的機理不同,因此在某些方面會存在一些差異[6]。為了比較兩種檢測方法在ABO疑難血型鑒定的差異,本研究通過對106例ABO疑難血型分別進行血清學(xué)檢測、基因分型檢測和基因測序,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年10月至2022年10月焦作市中心血站進行血型鑒定的106例疑難血型標(biāo)本(血清格局反應(yīng)定型表現(xiàn)為弱抗體標(biāo)本)。血清學(xué)格局見表1。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡在18周歲以上;②進行血型評估;③入組前6個月內(nèi)無輸血、獻(xiàn)血史;④了解研究相關(guān)內(nèi)容及利弊,簽署知情同意書。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①入組前6個月有相關(guān)抗血小板等藥物使用史;②存在自身凝血功能障礙;③不愿參與研究;④妊娠期婦女。其中,男52例、女54例;年齡23～75歲;平均(48.64±10.85)歲。

表1 血型血清學(xué)格局

1.2 檢測方法

1.2.1基因測序鑒定ABO疑難血型

采集患者口腔黏膜拭子,從樣本中提取出DNA,并進行純化處理,以消除影響測序結(jié)果的雜質(zhì)和污染物。通過PCR技術(shù)特異性擴增ABO基因序列,以獲取DNA片段。對PCR擴增所得DNA片段進行高通量測序,可以使用二代測序儀、三代測序儀等設(shè)備進行測序。將測序得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對,對比對結(jié)果進行分析,判斷樣本中的ABO基因型。抗-H、抗-AB、人ABO反定型用紅細(xì)胞購自上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司;抗-A抗-B試劑購自長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。儀器及試劑盒包括全自動血型分析儀(奧森多公司,型號為AutoVueInnova)、血液基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)、TaKaRa La Tap酶(日本TaKaRa公司)、DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒(北京TianGen公司)、pMD18-T載體(日本TaKaRa公司))、PCR儀(美國ABI公司)、DNA測序儀(美國ABI公司,型號為PRISM377)、離心機(日本久保田公司,型號為KA-2200)。

1.2.2吸收放散試驗

利用抗-A抗-B抗AB血型定型試劑(人血清)進行吸收放散試驗,采集被檢測者的全血樣本,并將其離心分離出紅細(xì)胞。準(zhǔn)備吸收劑:將抗A、抗B、抗AB吸附在已知ABO血型的紅細(xì)胞上,將其離心沉淀,去除懸浮液。用紅細(xì)胞洗滌緩沖液對被檢測者分離出的紅細(xì)胞進行洗滌處理。在洗滌后的紅細(xì)胞中加入吸附劑,反應(yīng)一定時間后,離心分離,去除上清液。然后,分別用抗A、抗B、抗AB 3種試劑進行血型的鑒定,根據(jù)細(xì)胞凝集情況判斷血型。對于吸收實驗結(jié)果為疑難血型的樣本,可以進行放散實驗來進一步確定血型。在吸收放散試驗中,通過加入適量的滲透劑,使細(xì)胞凝集消失或放散,觀察細(xì)胞凝集情況,判斷血型。

1.2.3實時熒光定量PCR試驗

利用人類紅細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒檢測A、A205、B、O261del、01、01、02等位基因,采集被檢測者的全血樣本,并將其離心分離出紅細(xì)胞。將紅細(xì)胞中的DNA提取出來。PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備:準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系,包括PCR引物、熒光標(biāo)記探針、Taq聚合酶、dNTPs等。將提取出的DNA加入PCR反應(yīng)體系中進行反應(yīng)。PCR條件根據(jù)具體實驗室的設(shè)備和引物可適當(dāng)調(diào)整,常見的反應(yīng)條件為預(yù)變性5 min,95 ℃ 10 min,40個循環(huán)(94 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s),終止延伸72 ℃ 10 min。利用熒光定量PCR設(shè)備,檢測反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號。檢測結(jié)果會顯示出被檢測樣本的基因型信息。根據(jù)熒光信號檢測結(jié)果,將被檢測者的基因型信息轉(zhuǎn)化為表型信息,比對參考文獻(xiàn),判斷被檢測者的ABO血型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計數(shù)資料用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)(%)表示,進行χ2檢驗;檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的差異比較采用配對χ2檢驗。檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果的一致性采用Kappa配對檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測方式檢測結(jié)果分析

106例疑難血型標(biāo)本基因測序結(jié)果顯示,陽性有46例,陰性有60例。吸收放散試驗檢測結(jié)果中,陽性有48例,陰性有58例;實時熒光定量PCR檢測結(jié)果中,陽性有47例,陰性有59例。吸收放散試驗檢測結(jié)果、實施熒光定量PCR結(jié)果與基因測序檢測結(jié)果對應(yīng),吸收放散試驗結(jié)果與基因測序結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.845>0.05),實時熒光定量PCR結(jié)果與基因測序結(jié)果比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.999)。見表2。

表2 兩種檢測方式與基因測序的比較

2.2 兩種檢測方式與金標(biāo)準(zhǔn)檢測結(jié)果一致性分析

根據(jù)兩種檢測方式與基因測序(金標(biāo)準(zhǔn))檢測結(jié)果的對應(yīng)情況,進行一致性分析。吸收放散試驗結(jié)果與基因測序結(jié)果呈中度一致性(Kappa=0.503,P<0.001),實時熒光定量PCR結(jié)果與基因測序結(jié)果的一致性很好(Kappa=0.904,P<0.001)。Kappa值與符合度的關(guān)系見表3。

表3 Kappa值的范圍與符合度的關(guān)系

2.3 兩種檢測方式診斷效能比較

實時熒光定量PCR方式的診斷準(zhǔn)確率、靈敏度、特異度均高于吸收放散試驗,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩種檢測方式的診斷效能比較(%)

3 討論

ABO血型系統(tǒng)是判斷獻(xiàn)血和輸血相容性最基本的指標(biāo)之一[7]。根據(jù)ABO血型系統(tǒng)的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應(yīng)該采取不同的獻(xiàn)血和輸血策略,以避免引起輸血反應(yīng)等不良后果。然而,ABO血型系統(tǒng)的分型鑒定檢查率低可能會導(dǎo)致誤診和漏診等問題[8-9]。例如,在輸血操作中,如果沒有正確地區(qū)分供者和接受者的ABO血型,就有可能引起輸血反應(yīng),嚴(yán)重時可能會導(dǎo)致死亡[10]。因此,在臨床操作中,對于ABO血型的檢查和判定應(yīng)該嚴(yán)格把關(guān),以確保操作的準(zhǔn)確性和安全性。而ABO血型的檢查方式便成了其關(guān)鍵。

本研究中,通過對106例ABO疑難血型實施血清學(xué)檢測(吸收放散實驗)等,同時對其實施基因分型檢測(熒光定量PCR試驗),以基因測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清學(xué)檢測所得結(jié)果與基因測序結(jié)果一致性為重度,基因分型檢測所得結(jié)果與基因測序結(jié)果一致性較好。這說明二者都能夠提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果,這與陳萍等[11]的研究結(jié)果相符。這是由于基因分型檢測是通過對樣本DNA進行PCR擴增,然后使用特異性探針或特異性引物擴增位點來確定基因的亞型[12]。在ABO血型系統(tǒng)中,人體有A、B、O 3種亞型,其中A和 B亞型均由一種轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)控制,而O亞型則沒有轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)。因此,基因分型檢測可以通過擴增ABO基因的關(guān)鍵位點來判斷患者所屬的血型[13]。血清學(xué)檢測則是通過將患者的血清和已知血型的紅細(xì)胞混合反應(yīng),觀察是否出現(xiàn)凝集或溶解等現(xiàn)象來確定其所屬的血型。這種方法利用患者體內(nèi)產(chǎn)生的抗體與被試血液中表面抗原的結(jié)合反應(yīng)來完成[14]。在ABO血型系統(tǒng)中,如果患者血清中存在對應(yīng)于紅細(xì)胞表面A抗原或B抗原的抗體,則當(dāng)這些抗體分別與被試血液中的A抗原或B抗原相遇時會出現(xiàn)凝集現(xiàn)象,從而確定其血型。因此,二者均可以提供準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

通過比較血清學(xué)檢測和基因分型靈敏度、特異度可知,兩種檢查方式所得特異度、靈敏度存在較大差異,基因分型靈敏度、特異度更高。這是由于基因分型檢測技術(shù)對于一些罕見的ABO亞型和變異型的檢測能力更強。這些亞型和變異型一般無法通過血清學(xué)方法檢測出來,但是熒光定量PCR試驗可以檢測出其特定基因序列,從而進行精確定位和鑒定。

基因分型檢測和血清學(xué)檢測是兩種常用的血型鑒定方法,各自具有一些優(yōu)點和缺點。首先,基因分型檢測技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。基因分型檢測是直接檢測基因序列來確定血型的,結(jié)果不受樣本中抗體的影響,并且能夠準(zhǔn)確地檢測出一些罕見的ABO亞型和變異型[15-16]。此外,基因分型檢測技術(shù)還具有較高的標(biāo)準(zhǔn)化和自動化程度,能夠大大降低人為因素和實驗誤差的干擾。其次,基因分型檢測技術(shù)更加快速、高效和節(jié)約成本。相對于血清學(xué)檢測需要多次反應(yīng)和操作,基因分型檢測只需要進行1次PCR反應(yīng)即可獲得鑒定結(jié)果[17]。并且,基因分型檢測的樣本準(zhǔn)備簡單,不需要進行特別處理,相對更加快捷和節(jié)省成本。與此相比,血清學(xué)檢測也有一些優(yōu)點。例如,在某些情況下,血清學(xué)檢測能夠提供更詳細(xì)的信息,例如同時檢測多種抗體、檢測Rh因子等[18-19]。此外,部分醫(yī)院和實驗室可能沒有配備基因分型檢測設(shè)備,而血清學(xué)檢測設(shè)備則普及度更高,更加便于使用。但對于一些疑難血型,由于基因變異、突變等原因,可能導(dǎo)致血清學(xué)檢測無法準(zhǔn)確鑒定血型,此時需要進行基因分型檢測。相比于血清學(xué)檢測,基因分型檢測有更高的準(zhǔn)確性和可靠性,可以檢測出較為罕見的ABO亞型和變異型,并且能夠避免人為誤差的干擾。

4 結(jié)論

雖然基因分型檢測和血清學(xué)檢測有各自的優(yōu)缺點,但總體上來說,基因分型檢測具有更高的準(zhǔn)確性和可靠性,更快速、高效且更加節(jié)約成本,因此在臨床診斷和疾病預(yù)防控制中具有廣泛的應(yīng)用前景。