王不留行黃酮苷通過抑制鐵死亡減輕阿米卡星導致的腎小管上皮細胞損傷

鄭 松,儲超群,岳 琳,黃申卓凡,溫家根

阿米卡星(amikacin,AKN)是第三代氨基糖苷類抗生素,可用于敏感細菌感染的治療,其對革蘭陰性菌效果較好。此外,AKN對耐藥結核桿菌具有較好的殺傷作用,但是其在臨床應用時會導致明顯的腎毒性和耳毒性。有研究[1]顯示AKN可以通過氧化應激和炎癥反應引起腎臟損傷。AKN在腎組織中積累顯著,并可以與線粒體發生作用,促使線粒體發生功能障礙,同時增加腎臟組織中氧自由基的產生,使得細胞內出現氧化性損傷[1],并最終導致細胞凋亡及炎癥性死亡[2]。因此,抗氧化藥物的應用可以減輕AKN等氨基糖苷類藥物的腎毒性,如鞣花酸、西洛他唑、β-石竹烯[2-3]等。本課題組前期研究[4-5]建立了慶大霉素的腎小管上皮細胞損傷模型,研究了綠茶多酚對慶大霉素腎毒性的保護作用,發現綠茶多酚可以通過激動Keap1-Nrf2信號發揮抗氧化作用,減輕慶大霉素腎毒性導致的腎小管上皮細胞的凋亡和鐵死亡。然而,關于AKN的體外腎損傷模型研究較少,故本研究建立了AKN體外腎小管細胞損傷模型,探討黃酮苷類化合物王不留行黃酮苷(vaccarin,VA)對腎小管細胞損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器HK-2細胞購自中國科學院細胞庫。VA購自美國MedChemExpress有限公司;AKN購自河南輔仁懷慶堂制藥有限公司;慶大霉素購自瑞陽制藥有限公司;抗溶質載體蛋白家族47成員11(solute carrier family 7 member 11, SLC7A11)抗體、抗谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)抗體和抗β-actin抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司;DMEM/F-12細胞培養基購自美國GE醫療科技有限公司Hyclone實驗室;TRIzol和2×SYBR Green Pro Taq HS Premix試劑購自湖南艾科瑞生物科技有限公司;HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;二氫乙錠(dihydroethidium, DHE)探針購自上海碧云天生物技術有限公司。SpectraMaxi 3x多功能酶標儀購自美國美谷分子儀器公司;CFX Connect實時熒光定量PCR儀和ChemiDoc MP化學發光成像儀購自美國伯樂公司;DMi8倒置熒光顯微鏡購自德國徠卡公司。Nanodrop 2000超微量分光光度計購自美國賽默飛世爾科技公司

1.2 細胞培養HK-2細胞用含有10%胎牛血清的DMEM/F-12 培養,在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養。待細胞長滿,胰酶消化制成細胞懸液,接種于96孔板或6孔板,過夜培養,當細胞匯合率達到80%,加入含藥物的培養基進行孵育。MTT實驗使用96孔板進行,在藥物孵育達到預定時間進行,每孔中加入MMT試劑(與培養基的比例1 ∶10),繼續在培養箱中孵育4 h,最后棄去培養基,每孔加入100 μmol/L DMSO,37 ℃搖床中孵育30 min,酶標儀檢測490 nm吸光度值。

1.3 細胞內MDA和GSH水平檢測HK-2細胞接種于6孔板,加藥刺激結束后,PBS洗滌2次,使用細胞刮刀刮取各組細胞,超聲破碎儀制備細胞裂解液。按試劑盒說明分別檢測細胞內GSH和MDA含量。

1.4 RT-qPCR檢測KIM-1和NGAL的mRNA水平采用TRIzol提取HK2細胞的總RNA,測定RNA濃度,使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將1 μg的總RNA逆轉錄成cDNA。在反應體系中分別加入:1 μl上、下游引物(表1),5 μl 2×SYBR Green Pro Taq HS Premix和3 μl cDNA模板。采用實時熒光定量PCR儀對KIM-1、NGAL和β-actin的mRNA水平進行定量。熱循環(40個循環)條件為:95 °C變性20 s, 58 ℃退火20 s, 72 ℃延伸20 s。β-actin用于KIM-1、NGAL的mRNA相對比值的歸一化。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測HK-2細胞蛋白的表達水平使用含有PMSF(1 ∶100)的RIPA緩沖液從細胞中提取蛋白質樣品,用10%或12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,然后轉印到PVDF膜上。隨后,將轉印后的膜與5%的脫脂牛奶(TBS配制)孵育1 h,孵育結束后分別與抗SLC7A11抗體(1 ∶1 000)、抗GPX4抗體(1 ∶1 000)、抗β-actin抗體(1 ∶5 000)4 ℃過夜孵育。次日棄去一抗,使用TBST洗滌,再加入HRP標記的山羊抗兔或抗小鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。最后,在膜上滴加ECL化學發光試劑使用化學發光成像儀進行顯影,Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.6 DHE熒光探針分析HK-2細胞接種于6孔板,加藥處理后,PBS洗滌2次,使用含有2 μmol/L的DHE探針的培養基和細胞37 ℃孵育30 min進行熒光探針裝載,隨后PBS洗滌2次后加入不含藥物的培養基,熒光倒置顯微鏡檢測各視野中細胞紅色熒光的強度,Image J軟件分析熒光強度。

1.7 統計學處理采用GraphPad Prism 5軟件(GraphPad, La Jolla, CA, USA)進行繪圖。所有計量資料以平均值±SEM表示。多組數據的比較采用單因素方差分析(ANOVA)及兩兩比較的Tukey檢驗,P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 建立HK-2細胞體外損傷模型采用不同濃度的AKN(1、2、4、8、16、32 mmol/L)體外刺激HK-2細胞24 h,MTT檢測結果見圖1A,各組間差異有統計學意義(F=127.5),AKN對HK-2細胞的半數抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)為(5.74 ± 0.47) mmol/L,低于1 mmol/L的濃度對細胞活力影響較小(圖1A),后續選擇4 mmol/L AKN進行藥物刺激。此外,與對照組相比,100 μmol/L及以下濃度的VA使得HK-2的細胞活力顯著降低(P<0.001,F=38.75),見圖1B。當VA與AKN(4 mmol/L)同時處理時,25～100 μmol/L的VA和AKN共處理組細胞活力顯著高于AKN組(P<0.05,F=22.07),見圖1C;且25～100 μmol/L的VA與AKN(3 mmol/L)同時處理后,HK-2的細胞活力也顯著高于AKN(3 mmol/L)單獨處理組(P<0.01,F=31.94),見圖1D。AKN(4 mmol/L)處理后KIM-1的mRNA表達水平顯著高于NC組,差異有統計學意義(P<0.001,F=30.95),VA(50 μmol/L)與AKN共處理組(VA+AKN)的KIM-1顯著低于AKN組(P<0.01,F=30.95),見圖1E。AKN(4 mmol/L)處理后NGAL的mRNA表達水平顯著高于NC組,差異有統計學意義(P<0.001,F=21.43),VA+AKN組的NGAL顯著低于AKN組(P<0.05,F=21.43),見圖1F。

圖1 VA減輕氨基糖苷類抗生素導致的腎小管上皮細胞的損傷

此外,以4 mmol/L的AKN分別處理0、3、6、12、24 h,檢查細胞氧化應激水平,3 h DHE染色強度開始升高但差異無統計學意義,6 h DHE染色強度顯著大于0 h組(P<0.01,F=25.83),12 h染色強度達到最大(P<0.001,F=25.83),見圖2A。此外,與0 h組相比,3、6、12、24 h組MDA水平顯著上升(P<0.05,F=61.14),見圖2B;與0 h組相比,3、6、12、24 h組GSH水平顯著下降(P<0.001,F=72.49),見圖2C。

圖2 AKN導致細胞氧化應激水平的變化

2.2 AKN導致HK-2細胞發生鐵死亡采用4 mmol/L AKN刺激HK-2細胞,與0 h組相比,6、12、24 h組鐵死亡相關蛋白SLC7A11(F=125.35)和GPX4(F=92.71)均明顯下降(P<0.001),3 h組與0 h組差異無統計學意義,12 h組與24 h組差異也無統計學意義。見圖3。

圖3 AKN導致SLC7A11和GPX4蛋白水平的變化

2.3 VA改善HK-2細胞的死亡及氧化應激根據細胞活力檢測結果,選擇50 μmol/L濃度VA進行后續實驗。通過顯微鏡觀察,VA處理可以提高視野中細胞的數量及細胞的完整性,見圖4A。AKN處理可以使得細胞DHE染色熒光升高,見圖4B;MDA水平從(3.57±0.36) nmol/mg protein(NC組)升高至(13.37±0.63) nmol/mg protein(AKN組),見圖4C;GSH水平從(42.27±1.76) nmol/mg protein(NC組)下降至(15.30±1.31) nmol/mg protein(AKN組),見圖4D。VA+AKN組DHE熒光強度顯著低于AKN組(P<0.001,F=150.0);VA+AKN組MDA[(6.40±0.67) nmol/mg protein]顯著低于AKN組(P<0.001,F=72.343);VA+AKN組GSH[(33.76±2.53) nmol/mg protein]顯著高于AKN組(P<0.01,F=32.925)。

圖4 VA對HK-2的保護作用

2.4 VA可以改善AKN導致的鐵死亡VA作用24 h后,通過檢測SLC7A11和GPX4的蛋白水平,發現其可以恢復AKN導致的SLC7A11和GPX4降低,SLC7A11(F=63.41)和GPX4(F=65.73)蛋白水平在AKN與VA+AKN組之間的差異均有統計學意義(P<0.001),見圖5。

圖5 Western blot檢測VA對HK-2的SLC7A11和GPX4的蛋白表達水平的影響

3 討論

氨基糖苷類抗生素是一類臨床常用的抗菌藥物。近年來,由于結核桿菌耐藥性的發展,AKN也已用于結核復治及耐藥結核的治療。與鏈霉素相比,AKN毒性較低,然而其腎毒性仍然明顯。據統計,在兒童人群中,有20%～33%接受氨基糖苷類藥物治療的患者會發生腎損傷[6]。

AKN等氨基糖苷類抗生素引起的腎損傷以近端腎小管為主。在AKN腎損傷大鼠模型中,Rajab et al[2]采用AKN 500 mg/(kg·d)的劑量給雄性的Wistar大鼠連續腹腔注射14 d,可以導致明顯的腎小管的損傷及血清肌酐的升高,Dogan et al[7]采用AKN 1.2 mg/kg單次腹腔注射Wistar大鼠,同樣14 d后觀察到腎小管區域出現明顯損傷。本課題組前期研究[5]已發現慶大霉素對HK-2和NRK-52E兩種細胞的IC50達到3 mmol/L左右,在本研究中,AKN對HK-2細胞的IC50為5.74 mmol/L。由于藥物極性較大,AKN等氨基糖苷類抗生素體外造模所需濃度較大。在體內,氨基糖苷類藥物在腎小管管腔側megalin等蛋白的作用下,重吸收進入腎小管細胞內[8-10]。所以,AKN等氨基糖苷類藥物在體內外模型中存在較大的動力學特征差異。早期研究[11]發現凋亡是該類藥物導致腎小管細胞損傷或死亡的主要形式,本課題組在慶大霉素腎損傷過程發現細胞出現了程序性壞死及鐵死亡[4-5],最近Ding et al[12]也證實炎癥性死亡(焦亡)是慶大霉素腎損傷的病理機制。此外,腎臟細胞的損傷還會引起炎癥效應,導致血管內皮功能障礙及炎癥細胞的浸潤和激活,進一步加劇腎小管細胞的損傷[13]。然而,關于AKN腎損傷的病理機制仍不明確,本研究在建立的體外細胞模型上首次證實了鐵死亡相關標志蛋白的變化。

近年來,相關研究[14]還發現氨基糖苷類抗生素影響線粒體氧化呼吸鏈,導致多種活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生,并消耗影響抗氧化系統,導致腎臟細胞產生明顯的氧化應激。腎小管細胞線粒體非常豐富,更容易引起氧化應激。本課題組前期研究[4]發現,慶大霉素處理1.5 h后即可以明顯導致氧化應激的出現。本研究同樣發現,AKN處理早期便使得細胞出現氧化應激。過載ROS可以進一步攻擊膜磷脂,導致脂質過氧化,引發鐵死亡。脂質過氧化物的大量積累是鐵死亡的關鍵特征,GPX4具有強抗氧化作用,其以GSH為輔因子可催化去除過氧化脂質。而SLC7A11是胱氨酸/谷氨酸反向轉運蛋白系統的重要組成部分,負責谷胱甘肽合成前體胱氨酸的胞內轉運。在本研究中,相關蛋白指標GPX4和SLC7A11在AKN刺激6 h即顯著降低,而脂質過氧化產物MDA在AKN刺激3 h升高,GSH在3 h便開始下降,提示鐵死亡在AKN刺激的早期即開始出現。GPX4在發揮抗脂質氧化的同時本身會被消耗,故在刺激之后蛋白水平會顯著下降。另外,ROS可導致DNA損傷從而激活P53,通過轉錄信號調節抑制SLC7A11的表達[15-16],細胞內GSH合成的水平會因此而降低,再加上胞內GSH的大量消耗,GPX4的蛋白水平降低更加明顯。

VA是中藥王不留行的有效物質,屬于類黃酮苷類化合物。近年來,研究顯示VA可以通過促進血管生成來加速傷口愈合[17],VA還可通過激活細胞外調節蛋白激酶和肌球蛋白輕鏈激酶促進了2型糖尿病小鼠腸道屏障的完整性[18]。此外,VA通過減少ROS保護內皮細胞免受氧化低密度脂蛋白誘導的內皮-間質轉化、炎癥和凋亡。其他類黃酮苷類物質如橙皮苷、柚皮苷、黃芩苷等化合物均具有較好的抗氧化作用。本研究結果也顯示VA具有較好的抗氧化作用,可以對抗AKN引起的腎小管細胞的氧化應激。因VA化學結構上具有多個羥基、酚羥基及酮基,所以該化合物具有還原性,可以發揮抗氧化作用。此外,本課題組還發現VA可能靶向還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4),從而降低氧自由基的形成[19]。所以,在VA作用下,損傷細胞氧化應激指標均顯著降低。VA對細胞鐵死亡的抵抗效果可能依賴于其抗氧化的作用。此外,在正常培養的細胞中,治療濃度下的VA并不能顯著影響細胞MDA、GSH和ROS的水平,也不改變SLC7A11和GPX4的蛋白水平,故對細胞正常的氧化還原穩態不會產生影響。VA的抗氧化作用機制未進行深入探索,其抑制AKN導致的腎小管細胞的鐵死亡是否完全依賴于抗氧化的作用仍需要明確。

本研究成功建立了AKN腎小管上皮細胞體外損傷模型,并發現氧化應激和鐵死亡均是導致細胞損傷的重要原因。VA可能通過抑制過氧化應激相關的鐵死亡途徑減輕AKN腎小管上皮細胞的損傷。