MEN1在消化系統腫瘤中的研究進展

凡浩然綜述 王 震審校

MEN1 基因為多發性內分泌腺腫瘤1型(multiple endocrine neoplasia type 1, MEN1)的易感基因,其在調節基因轉錄、維持基因穩定性、調控細胞分裂和增殖等方面起重要作用。人類MEN1基因定位于11q13染色體區域,跨越約9 kb,編碼轉錄大小約為2.8 kb的mRNA,隨后翻譯為 Menin,其分子量為 67 ku。在細胞核中,Menin可以與染色質重塑因子(如組蛋白甲基轉移酶、MLL1和MLL2或組蛋白去乙酰化酶結合來調節靶基因[1-2],也可與多種細胞因子(β-catenin、AP-1、JunD、NF-κB等)相互作用[3-6]。在以往的神經內分泌腫瘤研究中發現,Menin的表達水平降低可能導致基因表達過程異常或細胞增殖異常,從而誘使腫瘤的發生與發展。然而近來在非神經內分泌腫瘤中的研究發現,在不同的腫瘤類型中,MEN1發揮的作用不同,如在胰腺癌中MEN1基因為抑癌基因,而在肝癌中則為癌基因。現就近年來MEN1在消化系統腫瘤中的研究進展做一綜述。

1 肝癌

1.1 MEN1在肝癌中的相關研究肝癌是指發生于肝臟或從肝臟開始的惡性腫瘤,原發性肝癌是全球癌癥相關死亡的主要原因之一。關于MEN1基因在肝癌中的作用,諸多學者進行了探索。Xu et al[7]通過體內及體外實驗發現,相較于癌旁組織,Menin在肝癌細胞中表達升高。在體外實驗中,使用MEN1 shRNA轉染肝癌細胞株,發現細胞的增殖和集落的形成均被抑制;在體內實驗中,通過二乙基亞硝胺誘導小鼠肝癌發生,其中敲除了MEN1基因(MEN1+/-)的小鼠Menin表達減少,其腫瘤體積和質量顯著下降,且腫瘤發生率較野生型低。同時發現Menin-MLL HMTase復合物在人類肝癌標本中被大量激活,并通過依賴H3K4me3的方式促進肝癌的發展。另有研究[8]顯示,在肝癌細胞株中,Menin和增強子的齊式同源2(enhancer of zeste homolog 2, EZH2)共同占據潛在的腫瘤抑制子的啟動子,兩個轉錄活性有關的組蛋白修飾蛋白(H3K4me3和H3K79me3)在肝癌中同時被激活,Menin/MLL復合物催化了異常的H3K4me3甲基化,而H2K4的甲基化與腫瘤細胞的增殖有關。統計分析結果表明,EZH2和Menin過表達與肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者的不良預后密切相關。

對于MEN1基因與肝癌的關系,有研究[7, 9-11]顯示Menin與Yes關聯蛋白1(Yes-associated protein 1,Yap1)基因的啟動子位點上H3修飾的轉錄激活一致,即Menin與Yap1啟動子結合從而上調Yap1的轉錄,而過度激活的Yap1可以與轉錄因子TEA域家族成員(TEAD)結合,啟動下游基因的轉錄,使腫瘤細胞維持一種高度增殖的狀態,從而促進腫瘤的發展。同樣的,相關研究[7, 12]顯示Menin在肝癌細胞中顯著過表達,通過MI-503(一種Menin-MLL抑制劑)下調了父源性表達的10號基因(paternally expressed 10,PEG10)的表達,并取代PEG10基因啟動子上的Menin-MLL復合物,導致H3K4甲基化減少和轉錄抑制,而這可能會通過Hippo信號通路抑制肝癌細胞的增殖、遷移和集落形成。

1.2 MEN1在肝癌中的生物信息學分析為了進一步探討MEN1與肝癌的關系,筆者下載了癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫(https://www.cancer.gov/ccg/)的肝癌數據,通過R語言整理數據。使用R包(limma、ggplot2、ggpubr)進行分析,分析顯示MEN1基因在肝癌組織中的表達量高于正常組織,且在同一樣本中,癌組織的MEN1表達高于癌旁組織(P<0.05)(圖1)。使用R包(limma、survival、survminer)進行生存分析,在肝癌人群中,MEN1高表達人群的總生存期和無進展生存期均低于低表達人群(P<0.05)(圖2)。通過R包(survival、survminer、timeROC)繪制ROC曲線,得出通過MEN1基因的表達量預測患者1年、3年生存時間的AUC分別為0.698、0.625(圖3),為中區分度。整理肝癌人群的MEN1表達水平、年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、T分期、N分期、M分期數據,使用R包(survival、regplot、rms)繪制列線圖(圖4),可以通過列線圖預測患者的生存時間。列線圖的校準曲線顯示(圖5),通過此列線圖預測患者的1年生存期較為準確。使用R包(survival)進行獨立預后分析,MEN1基因的表達量與患者的預后相關(P<0.05),且是高危險因素(HR>1)(圖6)。

圖1 MEN1基因表達差異分析

圖2 總生存期及無進展生存期分析

圖3 ROC曲線

圖4 列線圖

圖5 列線圖校準曲線

圖6 獨立預后分析

在肝癌的研究中,諸多研究結果顯示MEN1起到促癌的作用,筆者通過生物信息學的方法,分析數據結果顯示,MEN1在肝癌組織中高表達,且表達水平與肝癌患者的不良預后呈正相關。這進一步說明MEN1在肝癌中的癌基因屬性。為更深入理解MEN1在肝癌中的具體作用,下一步應重點研究MEN1與其他肝癌相關的基因和蛋白質之間的相互作用,包括探究MEN1對細胞周期的影響、凋亡的調控作用以及血管新生等腫瘤生長的關鍵過程的影響。通過深入了解這些分子機制,有望揭示MEN1在肝癌發生和發展中的詳細作用。并且MEN1基因的高表達可能成為肝癌患者不良預后的預測因子,為制定更精準的治療策略提供重要線索。

2 胰腺癌

2.1 MEN1在胰腺癌中的相關研究胰腺癌是指胰腺細胞發生癌變而產生的腫瘤,胰腺的癌癥可分為許多類型,最常見的是胰腺腺癌,占了85%,另外1%～2%的病例為來自神經內分泌細胞的神經內分泌腫瘤。MEN1基因在胰腺神經內分泌腫瘤中發揮重要作用,近來諸多學者又進一步探討了MEN1在胰腺癌中的作用。DNA甲基轉移酶1(Dnmt1)作為參與DNA甲基化表達的一種關鍵酶,參與了從癌前階段到導管癌惡性進展的多階段胰腺癌的發生[13],是胰腺癌中同Menin相互作用的一個重要蛋白,也是Hedgehog信號通路的下游分子,而Hedgehog信號通路激活可以促進胰腺癌細胞的增殖[14-15]。研究[16-18]表明,在細胞的體外及體內實驗中,Menin過表達會顯著抑制胰腺細胞的生長,而Menin低水平時會促進胰腺細胞的增殖。具體機制為過表達Menin會與Dnmt1相互競爭,降低Dnmt1對p18和p27啟動子的富集量,降低p18和p27的DNA甲基化水平,從而上調了p18和p27的表達,而p18可以抑制CDK4和CDK6,p27可以抑制CDK2和CDK4,即Menin可以通過抑制細胞周期蛋白激酶(CDKs),從而抑制胰腺癌細胞的生長。在蛋白水平方面,Cheng et al[16]的研究結果顯示Menin 在胰腺癌的癌組織中表達水平遠低于癌旁組織。表明MEN1在胰腺癌中具有抑癌基因的潛在屬性。

Wasylishen et al[19]的胰腺外分泌穩態實驗結果顯示,在構建胰腺炎模型后,MEN1缺失會導致胰腺組織的損傷增加和再生能力受損,并導致細胞角蛋白19(cytokeratin 19, CK19)陽性表達及增加免疫細胞的浸潤。同時與突變型Kras基因協作[19],而突變型Kras蛋白可能會導致異常的細胞信號傳導,促使細胞無節制地生長和分裂,從而促進胰腺腫瘤的發展[20-21]。

相關研究[22-24]結果顯示Menin過表達通過組蛋白去乙酰化抑制CCAAT/增強子結合蛋白質β(CEBPB)和上皮特異性基因的表達,從而增強轉化生長因子-β(TGF-β)誘導的上皮細胞-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程,最終促進胰腺癌的增殖與轉移。然而,如果過表達CCAAT/增強子結合蛋白β(C/EBPβ,由CEBPB基因編碼)則會使TGF-β誘導的EMT過程下調,同時增強Menin對癌細胞的生長抑制作用,即抑制癌細胞的生長。同時,將Menin及C/EBPβ共過表達則會對腫瘤細胞產生更強的抑制作用。即Menin在不同的環境下對癌細胞表現出不同的作用,其中的關鍵可能在于C/EBPβ在細胞中的含量[24],而驗證這一現象則需要進一步研究探討。

2.2 MEN1在胰腺癌中的生物信息學分析同樣,筆者也下載了TCGA數據庫(https://www.cancer.gov/ccg/)的胰腺癌數據,通過R語言整理數據。使用R包(limma、ggplot2、ggpubr)進行分析,分析顯示MEN1基因在胰腺癌組織與正常組織中的表達量差異無統計學意義(P>0.05), 且在同一樣本中癌組織與癌旁組織的MEN1表達量差異無統計學意義(P>0.05)(圖7)。使用R包(limma、survival、survminer)進行生存分析,在胰腺癌人群中,MEN1高表達人群和低表達人群的總生存期和無進展生存期差異無統計學意義(P>0.05)(圖8)。通過R包(survival、survminer、timeROC)繪制ROC曲線,得出通過MEN1基因的表達量預測患者1年、3年、5年生存時間的AUC分別為0.508、0.424、0.160(圖9),均為低區分度,準確性低。整理胃癌人群的MEN1表達水平、年齡、性別、腫瘤分級、腫瘤分期、T分期、N分期數據,使用R包(survival、regplot、rms)繪制列線圖(圖10),可以通過列線圖預測患者的生存時間。列線圖的校準曲線顯示(圖11),通過此列線圖預測患者的1年生存期較為準確。使用R包(survival)進行獨立預后分析,MEN1基因的表達量與患者的預后并不相關(P>0.05)(圖12)。

圖7 MEN1基因表達差異分析

圖8 總生存期及無進展生存期分析

圖9 ROC曲線

圖10 列線圖

圖11 列線圖校準曲線

圖12 獨立預后分析

通過相關實驗及數據分析提示,MEN1在胰腺癌組織與癌旁正常組織中的表達無明顯差異,Cheng et al[24]的研究展示了MEN1基因在非神經內分泌腫瘤中作用機制的復雜性和不統一性,提示在進行相關研究時可以進行分階段研究,在腫瘤的不同發展時期,MEN1基因的作用可能不同,因為其作用可能受到多種因素的影響。研究者應該探索MEN1基因在胰腺癌中的調控網絡,包括可能的上下游調控因子和與其互作的蛋白質。這種分階段的研究設計有助于更精細地理解MEN1基因的生物學功能,并為腫瘤發展的動態變化提供更準確的解釋。

3 結直腸癌

3.1 MEN1在結直腸癌中的相關研究結直腸癌(colorectal cancer,CRC)為源自結腸或直腸(為大腸的一部分)的癌癥,關于結直腸癌發病機制的研究已有了較大的進展,然而MEN1基因在結直腸癌中的作用仍是未知的。Zeng et al[25]偶然發現MEN1基因在結直腸癌中起抑制作用,實驗顯示在結直腸癌細胞處于低氧環境時,低氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF1α)被激活,HIF1α與CUL1的啟動子結合,從而促進CUL1在結直腸癌細胞中的表達。過表達的CUL1可以在結直腸癌細胞中與環盒蛋白1(RING-box protein 1, RBX1)、S期激酶相關蛋白1(S-phase kinase associated protein 1, Skp1)及F-box/LRR重復蛋白1(F-box/LRR-repeat protein 1, FBXL1)偶聯形成SCFFBXL1E3連接酶,有44個候選蛋白可以通過FBXL1被共沉淀下來,而Menin就在其中,同時通過免疫印跡實驗驗證了Menin確實會被FBXL1下調。 在 Zeng et al[25]的實驗標本中,三對原發結直腸癌細胞的MEN1蛋白顯著下降,并且 Zeng et al[25]在HT29細胞(結直腸癌細胞的一種細胞株)中過表達MEN1蛋白會抑制腫瘤細胞的增殖。雖然MEN1在結直腸癌中的作用是偶然發現的,但這也提示MEN1或許可以成為結直腸癌治療的潛在靶點。

不同于Zeng et al[25]的研究發現,有研究者對結直腸癌組織及正常組織進行免疫組化檢測顯示:相較于正常的結直腸上皮細胞,70%癌標本組織中的Menin表達升高,并且Menin可以結合Skp2的啟動子并促進Skp2的表達,敲除MEN1則會導致Skp2的水平下降,而Skp2已被證明是結直腸癌的癌基因[26-27],即過表達的Menin可以促進結直腸癌細胞的增殖[28]。而后進一步對其機制進行研究發現,Menin可以通過一種與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)無關的機制來抑制CRC細胞的糖酵解,即抑制Menin可以促進CRC細胞的糖酵解,并增強CRC細胞對表皮生長因子受體抑制劑(epidermal growth factor receptor inhibitor, iEGFR)的敏感性,進而增強iEGFR誘導的CRC自噬。即Menin抑制劑(MI)和iEGFR聯合應用會導致CRC細胞的自噬誘導增加[29]。

3.2 MEN1在結直腸癌中的生物信息學分析筆者也下載了TCGA數據庫(https://www.cancer.gov/ccg/)的結直腸癌數據,通過R語言整理數據。使用R包(limma、ggplot2、ggpubr)進行分析,分析顯示MEN1基因在結直腸癌組織中的表達量高于正常組織中的表達量,且在同一樣本的癌組織中MEN1表達高于癌旁組織(P<0.05)(圖13)。使用R包(limma、survival、survminer)進行生存分析,在結直腸癌人群中MEN1高表達人群和低表達人群的總生存期和無進展生存期無明顯差異(P>0.05)(圖14)。通過R包(survival、survminer、timeROC)繪制ROC曲線,得出通過MEN1基因的表達量預測患者1年、3年、5年生存時間的AUC分別為0.565、0.553、0.521(圖15),均為低區分度,準確性低。整理結直腸癌人群的MEN1表達水平、年齡、性別、腫瘤分級、T分期、N分期數據,使用R包(survival、regplot、rms)繪制列線圖(圖16),可以通過列線圖去預測患者的生存時間。列線圖的校準曲線顯示(圖17)可以通過此列線圖去預測患者的1年、3年、5年的生存期。使用R包(survival)進行獨立預后分析,MEN1基因的表達量與患者的預后相關(P<0.05),且是高危險因素(HR>1)(圖18B)。

圖13 MEN1基因表達差異分析

圖14 總生存期及無進展生存期分析

圖15 ROC曲線

圖16 列線圖

圖17 列線圖校準曲線

圖18 獨立預后分析

目前對于MEN1基因在結直腸癌中的作用仍存在一定的不明確性,但初步的研究結果說明MEN1與結直腸癌存在關聯。相關研究表明Menin在癌組織中表達升高[28],而筆者通過數據分析也顯示MEN1基因在結直腸癌組織中高表達,且與患者的預后相關,這與研究的初步結果相一致。這提示MEN1基因可能成為結直腸癌研究中的一個重要靶點,一些傳統的腫瘤治療藥物(如吉非替尼)或許可以通過靶向MEN1在結直腸癌中發揮抗癌作用[25, 28-29],這為開發新的治療策略提供了一個有前景的方向。進一步的研究可以探索MEN1在結直腸癌中的確切作用機制,包括其對細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學過程的影響。此外,通過深入了解MEN1在結直腸癌中的分子調控網絡,可以尋找潛在的靶向治療手段,以更精準地干預癌細胞的異常生長。

4 食管癌及胃癌

4.1 MEN1在食管癌中的相關研究食管癌是發生在食管上皮組織的惡性腫瘤,食管癌包括多種病理類型,其中鱗狀細胞癌最為常見。Sun et al[30]基于癌癥驅動基因的定制蛋白質芯片和ELISA實驗,確定了10種與食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)診斷有關的自身抗體,其中就包含MEN1,MEN1在ESCC組的自身抗體表達水平高于對照組(正常人群),即在ESCC中MEN1水平上調,側面反映MEN1基因在ESCC中表現為促癌基因。當MEN1作為單一自身抗體對ESCC檢測的診斷時,其特異性達到了85.4%,但靈敏度僅有33.8%,遺憾的是,該研究并未用直接的方法檢測MEN1在食管癌中的表達水平。

4.2 MEN1在胃癌中的相關研究胃癌(gastric cancer, GC)是發生在胃部黏膜的癌癥,在世界范圍內,胃癌是癌癥致病原因第五名,并且在癌癥致死率

排名中為第三名。目前對于MEN1基因在胃癌中的作用僅有初步研究。Machlowska et al[31]對收集的胃癌標本進行高通量測序,結果顯示在35例早發型胃癌標本(指發病年齡≤45歲的個體)中,MEN1基因均有錯義突變;在18例常規胃癌標本(指發病年齡>45歲的個體)中,有82.4%的標本中MEN1基因有錯義突變。這些數據說明MEN1突變可能在胃癌中發揮重要作用,但仍需進一步的研究驗證,并探討其深入的機制。筆者的團隊前期研究發現胃癌組織中MEN1突變率達3.1%,部分胃癌組織中Menin表達異常。不同突變型MEN1過表達質粒對胃癌細胞生物學行為及Menin表達水平的影響不一,碳芐-L亮氨酰-L亮氨酰-L亮氨酸(carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal, MG132)能逆轉這一現象。據此推測MEN1突變通過促進Menin降解參與胃癌的發生發展進程。筆者的團隊通過蛋白印跡實驗對胃癌組織及癌旁組織比較發現,在大多數病例中,MEN1在癌旁組織中高表達。而后筆者的團隊分別對胃癌細胞株進行沉默和過表達MEN1,結果發現沉默株的癌細胞遷移侵襲能力均有增強,過表達株的胃癌細胞遷移侵襲能力減弱,這說明MEN1在胃癌中可能為抑癌基因[32]。Ren et al[33]也得到了相似的實驗結果,即胃癌組織中的Menin表達明顯低于癌旁組織。此研究的另一研究對象,含IQ基元GTP酶激活蛋白1(IQ motif containing GTPase activating protein1,IQGAP1)則在胃癌組織中高表達。已有多項研究表明,IQGAP1通過多種轉導通路在胰腺癌[34]、胃癌[35]、結腸癌[36]等多種腫瘤的發生及進展中發揮作用。而后Ren et al[33]對胃癌細胞株分別過表達及沉默Menin及IQGAP1,結果顯示IQGAP1過表達會促進胃癌細胞的增殖,而IQGAP1表達沉默則會抑制胃癌細胞的增殖;而Menin過表達會抑制胃癌細胞增殖,且這種抑制是通過抑制IQGAP1的表達來實現的。然而筆者的團隊進一步研究發現,Menin可以通過HSPA6/JNK通路促進胃癌轉移;Menin抑制劑MI-503在轉錄后水平下調Menin的表達,并抑制胃癌進展。上述的實驗結果并不統一,對于MEN1基因影響胃癌進展的具體機制仍需進一步探索。

通過生物信息數據分析,筆者觀察到在食管癌和胃癌組織中MEN1基因均高表達。目前,對于MEN1在胃泌素瘤中的研究表明其具有抑癌作用,相關機制研究也相對成熟[37-40],這為探究MEN1在胃癌中的作用機制提供了有益的參考。從相關文獻[31]的胃癌標本分析顯示,大多數標本中的MEN1基因存在錯義突變,后續研究可以通過分析MEN1基因位點的突變類型和突變量來深入了解MEN1在食管癌和胃癌中的作用。此外,利用小鼠等動物模型進行實驗,模擬MEN1基因缺陷的情況,將有助于進一步驗證MEN1基因與食管癌和胃癌的關系,并深入研究MEN1基因對這兩種癌癥的調節機制。這樣的綜合研究策略將為揭示MEN1在食管癌和胃癌中的作用提供更深入的了解。

5 展望

MEN1基因在調控細胞生長、分化以及維持基因穩定性等方面發揮著重要作用。早期的研究主要關注其在神經內分泌腫瘤中的功能,但近年的研究表明,MEN1基因在消化系統腫瘤中同樣具有重要作用。盡管目前對于MEN1基因在這些腫瘤中的作用機制還存在許多未知,但越來越多的研究表明,MEN1基因在消化系統腫瘤的發生和發展中起到不可忽視的作用。例如,MEN1基因的突變可能導致腫瘤的發生和發展,而MEN1基因的調控與多種信號通路有關。因此,深入研究MEN1基因在消化系統腫瘤中的作用機制對于腫瘤的診斷和治療具有重要意義。

此外,MEN1基因在消化系統腫瘤中的深入研究還可能揭示不同亞型或分子亞群之間的差異,有助于制定個體化治療策略。對MEN1基因的具體調控機制的理解將為開發針對其作用點的靶向治療提供理論基礎,為患者提供更為精準和有效的治療選擇。研究MEN1基因在消化系統腫瘤中的重要性也為未來臨床實踐提供了新的方向。通過檢測患者是否存在MEN1基因的突變或異常表達,可以更好地評估患者患病的風險,并為個性化的治療方案提供依據。這樣的方法有望提高治療的針對性和患者的整體預后。

總體而言,深入研究MEN1基因在消化系統腫瘤中的作用機制具有重要的科學和臨床意義。這一研究方向不僅豐富了對腫瘤生物學的認識,也為未來的腫瘤治療和預防策略提供了有益的啟示。通過整合基礎科學研究和臨床實踐,有望取得更多關于MEN1基因在消化系統腫瘤中的精細化調控機制和治療應用的重要突破。