不同大豆品種萌發期抗旱性鑒定方法研究

李玥 王興榮 張彥軍 王紅梅 祁旭升

收稿日期：2024 - 01 - 18

基金項目：蘭州市人才創新創業項目（2022-RC-64）；甘肅省農業科學院科研條件建設及成果轉化項目（重點研發計劃）（2021GAAS04）；2022年省級重點人才項目（農作物種質資源保護利用與人才培養）（2022RCXM083）；甘肅省農業科學院青年基金項目（2023GAAS34）。

作者簡介：李? ?玥（1987 — ），女，山東濟南人，助理研究員，碩士，主要從事大豆種質資源與遺傳育種研究工作。Email： lyue31@126.com。

通信作者：祁旭升（1966 — ），男，甘肅會寧人，研究員，主要從事大豆種質資源與遺傳育種研究工作。Email： qixusheng6608@sina.com。

摘要：為篩選出大豆萌發期抗旱性鑒定的適宜試驗條件，以大豆品種隴中黃601、懇鑒豆15、九農29、長農16為供試材料，采用蛭石法和濾紙法進行發芽試驗，運用內源轉錄間隔區（Internally Transcribed Spacer，ITS）序列分析法進行發芽床篩選，測定各供試大豆品種的發芽率、硬實豆數、發霉豆數，并進行了蛭石濕度和PEG-6000濃度篩選。結果表明，蛭石法發芽試驗能明顯減少大豆發芽試驗中產生霉菌的種類與數量，適宜在大豆萌發期抗旱性鑒定中應用。且在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%的條件下，不同大豆品種間的發芽率差異比較明顯，硬實豆數和發霉豆數少，試驗數據可靠，可作為大豆萌發期抗旱性鑒定試驗的適宜條件。且在此條件下，4個供試大豆品種的抗旱性表現由強到弱依次為隴中黃601、九農29、長農16、懇鑒豆15。

關鍵詞：大豆；萌發期；抗旱性鑒定；蛭石法；發芽床；蛭石濕度；PEG-6000濃度

中圖分類號：S565.1? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2024）04-0337-05

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.04.007

Study on the Methods for Drought Resistance Identification of Different Soybean Varieties at Germination Stage

LI Yue， WANG Xingrong， ZHANG Yanjun， WANG Hongmei， QI Xusheng

［1. Crop Research Institute， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China; 2. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Innovation in the Cold and Arid Northwest Region， Ministry of Agriculture and Rural Affairs

（Jointly Established by the Ministry and Province）， Lanzhou Gansu 730070， China］

Abstract： To select appropriate experimental conditions for the identification of drought resistance during the germination period of soybeans， varieties Longzhonghuang 601， Kenjiandou 15， Jiunong 29， and Changnong 16 were used as test materials. Germination tests were conducted using vermiculite and filter paper methods， with screening of germination beds through Internally Transcribed Spacer （ITS） sequence analysis. The germination rate， number of hard beans， and number of moldy beans were measured， along with selection for vermiculite moisture and PEG-6000 concentration. Results showed that the vermiculite method significantly reduced the types and quantities of molds in soybean germination tests， making it suitable for drought resistance identification during the germination period. At a vermiculite moisture of 170% and PEG-6000 concentration of 22%， significant differences in germination rates among the soybean varieties were observed， with fewer hard and moldy beans， providing reliable test data. These conditions are suitable for drought resistance identification tests during the soybean germination period. Under these conditions， the drought resistance of the 4 soybean varieties ranked from strongest to weakest as followed Longzhonghuang 601， Jiunong 29， Changnong 16 and Kenjiandou 15.

Key words： Soybean; Germination stage; Drought resistance identification; Vermiculite method; Germination bed; Vermiculite moisture; PEG-6000 concentration

大豆為豆科大豆屬一年生雙子葉草本植物，是世界上最重要的豆類作物，具有食用、飼用和釀造等多種應用價值。大豆生長期需水較多，水分對大豆的產量形成具有重要的作用［1 - 2 ］。隨著全球氣候的變化，干旱已成為全球最大的自然災害之一，干旱脅迫下作物各時期的生長發育都會受到影響，成為影響作物產量的重要障礙因子［3 ］。萌發期是大豆整個生活史的關鍵階段，如果萌發期水分不足，容易出現缺苗斷壟現象，最終導致產量及品質降低［4 - 6 ］。萌發期抗旱性鑒定也是大豆抗旱性鑒定研究的關鍵，鑒定大豆萌發期抗旱性、篩選抗旱種質資源，對大豆抗旱品種選育、抗旱機理及干旱調控緩解機制研究具有重要意義。

國內外研究表明，作物品種間萌發期的抗旱性存在很大差異。陳學珍等［7 ］在干旱脅迫下對20個大豆品種進行芽期抗旱性鑒定，獲得丹豆6、海94和蒙城小黑豆等3份抗旱性種質；肖佳雷等［8 ］對78份大豆種質資源進行了發芽期抗旱鑒定，獲得耐旱品種5個、較耐旱品種18個；Nayer等［9 ］對玉米品種704和301進行聚乙二醇（PEG-6000）誘導的水分脅迫研究表明，品種704的萌發率下降幅度高于品種301；Kumar等［10 ］和Delachiave等［11 ］一致認為，在干旱脅迫下，作物不同品種間差異顯著；Willanborb等［12 ］ 的研究顯示，包衣種子的萌發特性受到滲透脅迫的影響。研究者對不同大豆品種的抗旱性進行評價研究的結果顯示，不同品種抗旱性可歸為抗旱型品種、干旱敏感型品種和較抗旱型品種［13 - 16 ］。

利用聚乙二醇（PEG-6000）高滲溶液模擬干旱脅迫來研究種子萌發期的抗旱性是目前實驗室最常用的手段［4， 8， 17 - 20 ］。梁崢等［17 ］在30%的PEG- 6000濃度下研究了大豆子葉中幾種酶活性和可溶性蛋白含量的變化。張榮平等［18 ］采用15%、30%、45%等3種PEG-6000濃度處理大豆種子，研究了各處理對大豆種子下胚軸脂敘合酶活性及脯氨酸含量的影響。顧龔平等［19 ］采用20%的PEG-6000濃度處理研究了其對大豆幼苗活力和活性氧代謝的影響。舒英杰等［20 ］認為，室內采用 PEG-6000 浸種法模擬干旱脅迫鑒定大豆發芽期耐旱性的適宜濃度為20%～25%。綜上研究結果認為，PEG-6000模擬干旱脅迫的濃度因作物和品種而異，利用濾紙作為基質進行的發芽試驗，盡管采取了無菌處理和每天更換溶液，但在PEG-6000脅迫處理下與空白對照均會出現硬實豆和豆粒發霉的現象，這極大地影響了試驗數據的準確性，進而影響了對種質資源的篩選評價。

本研究利用不同發芽床、不同濃度的 PEG- 6000 模擬干旱脅迫篩選處理濃度和不同蛭石濕度等試驗條件，分析適于進行大豆種子萌發期抗旱性鑒定的條件，以期為利用滲透脅迫鑒定大豆種子萌發期的抗旱性提供依據。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試材料

供試大豆材料為隴中黃601、懇鑒豆15、九農29、長農16，均由國家作物種質資源庫（甘肅分庫）提供，其中隴中黃601田間表現抗旱性較高，懇鑒豆15抗旱性較弱。供試蛭石（1～3 mm）和PEG-6000（Molecular Biology Grade）均采購于蘭州博域生物科技有限責任公司。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 濾紙法發芽試驗? ? 選擇大小、色澤一致，飽滿、種皮完好的大豆種子，用10% NaClO溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗4～5次。按照30粒/皿的標準置于直徑為15 cm、鋪有2層濾紙的培養皿內，分別加入30 mL體積濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液，置于光照培養箱中在（25±1）℃、光照16 h的條件下催芽培養，利用稱重法每天向培養皿中補充加水。3次重復。

1.2.2? ? 蛭石法發芽試驗? ? 按照設定的蛭石濕度（110%、130%、150%、170%、190%）將蛭石分別與溶劑（無菌水/濃度為20%、21%、22%、23%、24%的PEG-6000溶液）混合均勻后，各取35 g平鋪在直徑為15 cm培養皿中，按照30粒/皿的標準均勻放置用濕巾揉搓干凈的大豆種子，再覆蓋一層混合均勻的蛭石至培養皿上邊緣，用保鮮膜包好，在保鮮膜上扎10個小孔，放入人工培養箱中，在溫度為23 ℃、相對濕度為85%、光照16 h的條件下催芽培養。3次重復。

1.3? ?蛭石濕度確定

蛭石濕度=（溶液體積×100）/蛭石干重

發芽培養按照1.2.2 蛭石法發芽試驗設計進行。共設5個蛭石濕度，分別為110%、130%、150%、170%、190%，3次重復。于培養第7天統計大豆發芽數、硬實豆數、發霉豆數，并計算各大豆品種的發芽率。

1.4? ?PEG-6000適宜濃度確定

共設5個PEG-6000濃度處理，分別為20%、21%、22%、23%、24%。3次重復。以1.3確定的蛭石濕度準備培養基質，于培養第7天統計大豆發芽數、硬實豆數、發霉豆數，并計算各大豆品種的發芽率。

1.5? ?ITS序列分析

將2種方法中出現的不同顏色、不同形態的霉菌采用 Qiagen DNeasy PowerSoil Pro Kit（Cat No. 47014 /47016） 進行核酸提取，檢測核酸完整度和濃度后送蘇州佳世生物技術有限公司進行ITS序列分析。使用高保真酶對DNA樣本進行擴增，并使用Invitrogen Qubit 4.0 熒光定量儀進行濃度定量。使用KAPA Hyper Prep Kit 進行文庫構建，使用 Illumina NovaSeq 進行測序。

1.6? ?數據統計與分析

用 Microsoft Excel 2013 整理試驗數據，用IBM SPSS 19 進行統計分析。

2? ?結果與分析

2.1? ?萌發試驗發芽床確定

濾紙法發芽試驗和蛭石法發芽試驗均于試驗第7天分別出現5種和2種不同顏色、不同形態的霉菌（封三圖1），對其進行基因組DNA提取，并將提取的DNA樣品送蘇州佳世生物技術有限公司進行ITS序列分析，首先對原始數據（Raw reads）進行過濾處理，對處理后的數據進行去接頭、拼接、過濾、去嵌合體，得到有效數據（Effective Tags）。將有效數據與真菌UNITE數據庫（https： //unite.ut.ee）按照97%的相似度進行比對，進行物種分類，獲得物種匹配數。ITS序列分析結果（封三圖2）顯示，濾紙法發芽試驗共出現9個屬（嗜熱真菌屬、德克酵母屬、念珠菌、根酶菌屬、布氏白粉菌屬、馬拉色菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬、維多利亞維希尼克氏酵母）的真菌，蛭石法發芽試驗共出現3個屬（根酶菌屬、曲霉菌屬、青霉菌屬）的真菌，而且蛭石法發芽試驗中匹配上的霉菌數明顯比濾紙法的少。由此可見，蛭石法發芽試驗能明顯減少霉菌種類與數量，可保證發芽試驗結果的準確性。同時，蛭石法發芽試驗取消了清洗種子和每天加水的步驟，明顯降低了試驗工作量和試驗投入成本。綜上認為，蛭石發芽床更適宜進行大豆萌發期抗旱性研究，蛭石法可替代溶液濾紙法應用于大豆萌發期的抗旱性研究。

2.2? ?蛭石濕度的確定

由圖3可知，隨著蛭石濕度的增加，各供試大豆品種的發芽率均呈先增加再降低的趨勢。其中在170%的蛭石濕度條件下，各供試大豆品種發芽率均達到90%以上（圖3-A）。在該條件下，懇鑒豆15的硬實豆數為3.0粒，隴中黃601、長農16、九農29的硬實豆數均為0（圖3-B）；懇鑒豆15、長農16的發霉豆數均為2.0粒；隴中黃601、九農29的發霉豆數均為0（圖3-C）。根據以上結果，最終確定發芽試驗最佳蛭石濕度為170%。

2.3? ?PEG-6000濃度篩選

從表1可以看出，4個大豆品種在不同PEG-6000濃度處理下發芽率均受到不同程度的抑制。當PEG-6000濃度達到23%以上時，4個供試大豆品種的平均發芽率均低于45%，出苗率過低，幼苗生活力極差，已失去生產意義，不適合用于模擬干旱脅迫。PEG-6000濃度為22%時，4個供試大豆品種的發芽率均在50%以上，且出現發霉豆數和硬實豆數的比例均低于PEG-6000濃度為20%、21%的處理，而硬實豆數和發霉豆數情況的存在，會嚴重影響試驗的準確性，因此在發芽試驗中應盡可能降低硬實豆數和發霉豆數所占的比例。當PEG-6000濃度為22%時，不同大豆品種的發芽率有明顯差異，其中隴中黃601與其余品種差異均達顯著水平；九農29與懇鑒豆15差異不顯著，但與長農16差異達顯著水平；懇鑒豆15與長農16差異不顯著。由此可見，22%的PEG-6000濃度適合作為模擬干旱脅迫的PEG濃度。且在此濃度脅迫下，4個供試大豆品種的抗旱性表現由強到弱依次為隴中黃601、九農29、長農16、懇鑒豆15，與田間表現一致。

3? ?討論與結論

種子萌發是植物生長發育的前提，是對環境因素最為敏感的階段。隨著環境干旱的不斷加重，對種子萌發的影響也越來越大。目前，多數學者們采用PEG-6000模擬干旱脅迫用于篩選和鑒定作物的抗旱性，并在小麥、棉花、玉米、苜蓿、紫蘇等作物上篩選到了抗旱性較好的品種［21 - 25 ］。李鳳珍等［26 ］采用濾紙法發芽床，經20% PEG-6000滲透脅迫處理，篩選出強抗旱性品種小紅麥；魯守平等［27 ］在 PEG-6000 模擬干旱脅迫條件下篩選出抗旱性較強的烏拉爾甘草1號和烏拉爾甘草2號。本研究采用PEG-6000模擬干旱法研究了大豆種質資源抗旱性鑒定方法，將發芽床由普遍使用的濾紙替換為蛭石，大大降低了大豆較難解決的萌發發霉豆數和硬實豆數問題，提高了試驗結果的可靠性。最終確定大豆萌發期PEG-6000最適脅迫濃度為22%、蛭石最適濕度為170%。在該試驗條件下，降低了大豆萌發期研究中出現的較難解決的發霉豆數和硬實豆數問題，提高了試驗結果的可靠性，并可減少試驗工作量和投入成本。由此可見，蛭石法可替代溶液濾紙法用于大豆萌發期的抗旱性研究。

ITS序列分析結果表明，蛭石法發芽試驗能明顯減少大豆發芽試驗中霉菌的種類與數量，更適宜進行大豆萌發期抗旱性研究。在蛭石濕度為170%、PEG-6000濃度為22%條件下，不同大豆品種間發芽率差異比較明顯，硬實豆數和發霉豆數少，試驗數據可靠，適合作為進行大豆萌發期抗旱性鑒定的適宜試驗條件。試驗結果還顯示，4個供試大豆品種的抗旱性表現由強到弱依次為隴中黃601、九農29、長農16、懇鑒豆15，這與田間表現一致。

參考文獻：

［1］ 苗以農，石連旋．? 大豆生理學［M］．? 長春：吉林科學技術出版社，2008．

［2］ 梁成第．? 大豆抗旱性的鑒定方法［J］．? 中國油料作物學報，1990（1）：34-37．

［3］ 徐立明，張振葆，梁曉玲，等.? 植物抗旱基因工程研究進展［J］．? 草業學報，2014，23（6）：293-303．

［4］ 王利彬，劉麗君，裴宇峰，等．? 大豆種質資源芽期抗旱性鑒定［J］．? 東北農業大學學報，2012，43（1）：36-42．

［5］ 劉? ?博，衛? ?玲，肖俊紅，等.? PEG模擬干旱條件下大豆萌發特性研究［J］．? 種子，2018，37（12）：56-60．

［6］ 趙振寧，趙寶勰.? 不同大豆品種在萌發期對干旱脅迫的生理響應及抗旱性評價［J］．? 干旱地區農業研究，2018，

36（2）：131-136．

［7］ 陳學珍，謝? ?皓，郝丹丹，等．? 干旱脅迫下20個大豆品種芽期抗旱性鑒定初報［J］．? 北京農學院學報，2005，

20（3）：54-56．

［8］ 肖佳雷，李? ?煒，來永才，等．? 黑龍江省春大豆種質資源芽期抗旱鑒定與篩選［J］．? 作物雜志，2012（1）：142-145．

［9］NAYER MOHAMMADKHANI， REZA HEIDARI.? Water stress induced bypolyethylene glycol 6000 and sodium chloride in twomaize cultivars［J］.? Pakistan Journal of Biological Sciences， 2008， 11（1）： 92-97．

［10］KUMAR R R， KARJOL K， NAIK G R． Variation of sensitivityto drought stress in pigeonpea（Cajanus cajan L. Millsp） cultivars during seed germination and early seedling growth［J］.? World Journal of Science and Technology， 2011， 1（1）：11-18．

［11］ DELACHIAVE M E A， DE PINHO S Z． Germination of Sennaoccidentalis link： seed at different osmotic potential levels［J］.? Brazilian Archives of Biology and Technology， 2003， 46： 163-166．

［12］ WILLANBORB C J， GULDEN R H， JOHNSON E N， et al． Germination characteristics of polymer-coated canola （Brassica napus L.） seeds subjected to moisture stress at different temperatures［J］.? Agronomy Journal， 2004，

96： 786-791．

［13］ 李文濱，宋春曉，萇興超，等.? 干旱脅迫下20個大豆品種抗旱性評價［J］.? 東北農業大學學報，2019，

50（4）：1-10.

［14］ 吳? ?偉，陳學珍，謝? ?皓，等.? 干旱脅迫下大豆抗旱性鑒定［J］．? 分子植物育種，2005（2）：188-194．

［15］ 陳亞光，昝? ?凱，楊雨陽，等.? 不同大豆品種（系）萌發期抗旱性綜合評價［J］.? 天津農業科學，2023，

29（10）：13-17；24.

［16］ 王? ?敏，楊萬明，侯燕平，等.? 不同類型大豆花莢期抗旱性形態指標及其綜合評價［J］．? 核農學報，2010，

24（1）：154-159．

［17］ 梁? ?崢，趙? ?原，鄭光華，等.? 聚乙二醇處理大豆種子子葉中幾種酶活性和可溶性蛋白含量的變化［J］．? 植物生理學報，1991（1）：20-24．

［18］ 張榮平，王振鎰，高俊鳳，等.? PEG處理大豆種子對下胚軸脂氧合酶活性及脯氨酸含量的影響［J］．? 西北植物學報，1993（2）：103-108．

［19］ 顧龔平，吳國榮，陸長梅，等.? PEG處理對大豆幼苗活力及活性氧代謝的影響［J］．? 中國油料作物學報，2000（2）：29-33．

［20］ 舒英杰，周玉麗，時俠清，等.? 大豆種子發芽期耐旱性鑒定的適宜PEG-6000濃度篩選［J］．? 大豆科學，2015（1）：56-59．

［21］ 惠紅霞，李樹華，許? ?興．? 高滲溶液鑒定小麥抗旱性的方法研究［J］．? 寧夏農學院學報，2000，21（3）：28-32．

［22］ 張雪妍，劉傳亮，王俊娟，等．? PEG脅迫方法評價棉花幼苗耐旱性研究［J］．? 棉花學報，2007，19（3）：205-209．

［23］ 李向東，范翠麗，曹熙敏．? PEG 模擬干旱條件下4個玉米品種的苗期抗旱性研究［J］．? 現代農業科技，2011（1）：71-72．

［24］ 伏兵哲，蘭? ?劍，李小偉，等.? PEG-6000 干旱脅迫對16個苜蓿品種種子萌發的影響［J］．? 種子，2012，

31（4）：10-14．

［25］ 李? ?丹，石瀏芃.? PEG-6000 模擬干旱脅迫對紫蘇種子萌發的影響［J］．? 寒旱農業科學，2022，1（12）：167-170．

［26］ 李鳳珍，馬曉崗．? PEG 處理下青海栽培小麥萌發期及幼苗期抗旱性研究［J］．? 中國農學通報，2011，27（21）：44-48．

［27］ 魯守平，孫? ?群，洪? ?露，等．? 不同種源地烏拉爾甘草發芽期抗旱性鑒定［J］．? 植物遺傳資源學報，2007，8（2）：189-194．