螺旋藻多酚復(fù)合納米微膠囊的制備與穩(wěn)定性分析

鐘秋帆，李 崴，孫瑋鴻，李方巍,*，曾名湧,*

（1.中國海洋大學(xué)三亞海洋研究院，海南三亞 527000；2.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

螺旋藻是目前科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)的理想的人類食品，被一些學(xué)者譽(yù)為“營養(yǎng)冠軍”[1]、未來食物[2]，其提取物已經(jīng)在抗癌藥物研發(fā)領(lǐng)域得到認(rèn)可[3]。此外，螺旋藻還具有協(xié)助治療疾病的功效，備受科研人員的推崇，是目前發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)最均衡全面的純天然食品[4]。螺旋藻不僅可以應(yīng)用于功能飲料中，還被用于乳制品、意大利面、油衍生物和營養(yǎng)補(bǔ)充劑的生產(chǎn)[5]。螺旋藻中含有多種生物活性物質(zhì)，如藻藍(lán)蛋白、酚類、多糖、多不飽和脂肪酸（PUFA）、類胡蘿卜素、維生素和甾醇。這些化合物大多數(shù)對(duì)于治療心血管疾病（CVD）、高膽固醇、高血糖、肥胖、高血壓、腫瘤和炎癥性疾病中起著重要作用，被認(rèn)為是一種天然藥物[6]。

多酚類物質(zhì)分子中具有多個(gè)酚羥基，屬植物的次生代謝產(chǎn)物，主要包括黃酮類、單寧類、酚酸以及花色苷等。許多研究表明，多酚類物質(zhì)具有良好的抗氧化活性，對(duì)輔助治療疾病有一定的幫助。多酚是天然抗氧化劑，可作為屏障，防止活性氧（ROS）引起的氧化應(yīng)激。盡管多酚具有多種有益人體的好處，然而，由于多酚對(duì)熱敏感且容易氧化[7]，它們的使用在很大程度上受到限制。多酚在食物制備、循環(huán)、胃腸道中的不穩(wěn)定性或弱穩(wěn)定性限制了它的作用和潛在的治療優(yōu)勢(shì)[8]。因此，為了最大限度地發(fā)揮人類從加工食品中攝入多酚的有益效果，必須深入系統(tǒng)研究多酚在食品加工中的穩(wěn)定性，以評(píng)估其真正的生物活性。目前大多數(shù)關(guān)于多酚穩(wěn)定性的研究都集中在微膠囊上。

微膠囊技術(shù)是一種新型儲(chǔ)存包裝技術(shù)，將一些性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)通過殼類材料進(jìn)行包裹，通過隔離達(dá)到保護(hù)作用。這些性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)可以是固體、液體，也可以是氣體。殼類材料主要是安全性能較高的天然或者合成大分子聚合物，如植物膠類、碳水化合物類、纖維素類、蛋白質(zhì)類以及脂類等，對(duì)內(nèi)容物具有很強(qiáng)的保護(hù)作用[9]。其保護(hù)作用主要體現(xiàn)在以下三方面：防止強(qiáng)光、高溫及強(qiáng)酸強(qiáng)堿對(duì)內(nèi)部物質(zhì)的輻射與腐蝕，提高其儲(chǔ)存時(shí)間；類似于藥物膠囊，能夠使內(nèi)部活性成分持續(xù)、緩慢、長久地釋放生物活性，延長其發(fā)揮作用的時(shí)間；遮蓋不良風(fēng)味或令人不愉悅的感官特性。例如黃酮類化合物味苦，將其包被在膠囊中，可以有效改善其口感[10]。目前為了獲得理想的包埋效果，一般采用多種材料組合為殼，以期做到相互補(bǔ)充。

針對(duì)這一問題，本文提出將多酚類化合物與多孔淀粉和玉米醇溶蛋白進(jìn)行復(fù)合包埋，以提高其穩(wěn)定性。制備負(fù)載螺旋藻多酚的螺旋藻多酚-多孔淀粉微膠囊（Phe-PS）和螺旋藻多酚-多孔淀粉-玉米醇溶蛋白微膠囊（Phe-PS-Zein），進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征和穩(wěn)定性分析，以保證螺旋藻多酚在食品生產(chǎn)過程中的有效應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

螺旋藻干粉 海南新大澤生物技術(shù)有限公司；胃蛋白酶（1:3000）、豬胰蛋白酶（1:250）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）北京索萊寶科技有限公司；玉米醇溶蛋白（Zein）、乙醇、大孔樹脂XDA-7、福林酚、蠟質(zhì)玉米淀粉、乙酸鈉、糖化酶（10 萬U/g）上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純 上海麥克林生化科技股份有限公司。

AB135-S 型精密電子天平 瑞士梅特勒公司；DF-101S 型磁力攪拌器 上海力辰儀器科技有限公司；N-1210BV-W 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；Neofuge 1600R 型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 上海Heal Force；Power Wave XS2 型多功能酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek 公司；TS-211GZ 型恒溫?fù)u床 上海儀純實(shí)業(yè)有限公司；DW-86L590D 型超低溫冰箱 上海科菱威生物科技有限公司；FJ-200-SH 型高速均質(zhì)機(jī) 上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；BILON-2000FD 型真空冷凍干燥機(jī) 上海新諾儀器集團(tuán)有限公司；UV-6100 型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；D8 ADVANCE 型X 射線衍射儀 德國布魯克公司；Gemini300 型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡 德國蔡司集團(tuán)；STA 449 F3/F5 型差示掃描量熱儀 德國耐馳公司；Nicolet IS10 型紅外光譜儀 美國尼高力儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 螺旋藻多酚的提取純化 向5 g 螺旋藻粉中添加100 mL 溶劑（乙醇:水=3:1，V/V），并在避光條件下以1000 r/min 的轉(zhuǎn)速磁力攪拌90 min，提取液在5000×g 下室溫離心5 min，然后通過0.45 μm 濾膜過濾，收集上清液，獲得的提取液兩過XDA-7 大孔樹脂吸附柱，除去色素及雜質(zhì)，然后在40～50 ℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行旋蒸濃縮，濃縮液凍干即為螺旋藻多酚（polyphenol，Phe），備用[11]。

1.2.2 負(fù)載螺旋藻多酚的螺旋藻多酚-多孔淀粉（Phe-PS）微膠囊的制備

1.2.2.1 多孔淀粉的制備 多孔淀粉（porous starch，PS）的制備參考張超[12]的方法，并略有修改。稱取15 g 蠟質(zhì)玉米淀粉，添加乙酸鈉緩沖液（50 mmol/L，pH4.5）300 mL 配制成5%淀粉懸浮液。然后將懸浮液置于40 ℃水浴鍋中預(yù)熱，待溫度恒定后，加入糖化酶（40 U/mL）3 mL，在250 r/min 條件下攪拌反應(yīng)2.5 h。然后添加1 mol/L NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至9.0終止反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)室溫離心（10000 r/min，20 min）后保留沉淀，并用去離子水對(duì)沉淀進(jìn)行3 次洗滌，最后進(jìn)行凍干，得到PS。

稱取1 g PS，將其溶于100 mL 80 ℃蒸餾水中，并將容器置于60 ℃水浴中磁力攪拌至完全溶解；稱取100 mg Phe，將其溶于10 mL 無水乙醇，緩慢滴入熱淀粉漿中，用磁力攪拌器繼續(xù)攪拌至芯材完全溶解，同時(shí)加熱除去乙醇，8000 r/min 的轉(zhuǎn)速下室溫均質(zhì)1 min，倒入平板中，液面不超過5 mm，放入-80 ℃冰箱預(yù)凍24 h，真空冷凍干燥至恒重，研磨，得到負(fù)載Phe 的Phe-PS 微膠囊粉末，存放在4 ℃下進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2.2.2 包埋率的測(cè)定 復(fù)合微膠囊顆粒包埋率檢測(cè)參考Ahmad 等[13]的方法，并略有修改。取3 mL新鮮制備的樣品在4 ℃下10000×g 離心30 min，獲得上清液，在765 nm 處測(cè)定上述溶液的吸光度。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=0.014+1.095x）計(jì)算Phe 的含量，微膠囊的包埋率（EE）計(jì)算公式如下：

1.2.3 螺旋藻多酚-多孔淀粉-玉米醇溶蛋白（Phe-PSZein）復(fù)合微膠囊顆粒制備 PS 儲(chǔ)備液的制備：稱取1.0 g 多孔淀粉溶于100 mL 超純水中，在磁力攪拌（1000 r/min）下過夜，使PS 充分水合，4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

Phe-Zein 溶液的制備：準(zhǔn)確稱取1.0 g Zein 溶于50 mL 80%（v/v）的乙醇溶液中，振蕩2 h，配制成濃度為20 mg/mL 的Zein 儲(chǔ)備液。在Zein 儲(chǔ)備液中加入適當(dāng)體積的多酚溶液（Zein:Phe=20:1，v/v），避光攪拌（800 r/min）1 h，離心（5000×g，10 min）除去不溶性雜質(zhì)，現(xiàn)用現(xiàn)配[14]。

多酚微膠囊顆粒制備參考Meng 等[14]的方法，并略有修改。用無菌注射器將Phe-Zein 溶液緩慢滴加至含有PS 的水溶液中（PS:Zein:Phe=1:1:20，v/v/v），在避光條件下800 r/min 攪拌2 h，旋蒸除去多余的乙醇，添加適量的超純水補(bǔ)償乙醇的損失，得到Phe-PS-Zein 微膠囊顆粒。

1.2.4 螺旋藻多酚微膠囊的結(jié)構(gòu)表征

1.2.4.1 粒徑和多分散性指數(shù)的表征 將樣品（0.01%，w/v）懸浮在超純水中，在超聲波浴中以40 kHz 的頻率超聲30 min，使聚合物完全分散。基于動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)[15]，利用激光粒度儀測(cè)定復(fù)合納米顆粒的粒徑和多分散性分布指數(shù)（PDI）。

1.2.4.2 紅外光譜分析（FTIR）利用FTIR 表征微膠囊顆粒內(nèi)的分子間相互作用[16]。采用溴化鉀壓片法制備樣品，樣品與溴化鉀的質(zhì)量比約為1:100。首先在瑪瑙中將樣品和溴化鉀研成細(xì)粉，再用油壓機(jī)壓成片。為避免溴化鉀吸潮，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程在紅外燈下操作。紅外參數(shù)如下：光譜波長范圍為400～4000 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描64 次。

1.2.4.3 X 射線衍射（X-ray diffractometry，XRD）和X 射線光子能譜分析（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）表征 通過XRD 測(cè)定樣品的晶體結(jié)構(gòu)，根據(jù)劉夫國[16]的方法并稍作修改，將粉末樣品在含有飽和NaCl 溶液的干燥器中平衡一周。掃描速度為2°/min 時(shí)角為5°～35°。將凍干后的樣品采用X射線光電子能譜儀分析粒子的表面元素。測(cè)試條件：管電流40 mA，管電壓40 kV，Cu 靶（1.5406 eV），Co靶（1.79026 eV），在0～1000 eV 內(nèi)進(jìn)行全掃描。

1.2.4.4 熱重分析（DSC）根據(jù)Rawel 等[17]的方法并稍作修改，用于分析微膠囊顆粒的熱穩(wěn)定性。準(zhǔn)確稱量15.0 mg 的樣品放入標(biāo)準(zhǔn)鋁盤中，保證良好的傳熱接觸。采用銦來校正儀器，并用空鋁盤做基線校準(zhǔn)。使用氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣，溫度掃描范圍為25～600 ℃，加熱速率為10 ℃/min，測(cè)試完成后采用液氮進(jìn)行物理降溫。

1.2.5 螺旋藻多酚微膠囊的穩(wěn)定性分析

1.2.5.1 螺旋藻多酚微膠囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 將新制備的螺旋藻多酚微膠囊顆粒和游離的螺旋藻多酚，在4 ℃條件下保存21 d，每隔3 d 測(cè)定一次Phe 含量，按下述公式計(jì)算儲(chǔ)存過程中螺旋藻多酚的保留率。

式中：Mt表示t min 后微膠囊或提取物中多酚含量，mg；M0表示0 min 微膠囊或提取物中多酚含量，mg。

1.2.5.2 O2對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響 為探究O2對(duì)螺旋藻多酚微膠囊的影響，本實(shí)驗(yàn)參照安小琦[18]的方法略有改動(dòng)。取5 份0.1 g 螺旋藻多酚提取物和5 份0.2 g 螺旋藻多酚微膠囊，放置于暗室中，每隔5 d 測(cè)量其多酚含量，計(jì)算其多酚保留率，每個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，考察O2對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響。

1.2.5.3 還原劑（NaHSO3）對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響 參照侯順超[19]的方法測(cè)定還原劑（NaHSO3）對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響，配制濃度分別為0.25、0.5、0.75、1、1.25 和1.5 mg/mL的NaHSO3溶液，加入一定量的螺旋藻多酚和螺旋藻多酚微膠囊制品，充分溶解后，將其置于室溫條件下避光保存1 h，測(cè)量其多酚含量，并以1.2.5.1 所述公式計(jì)算多酚保留率，每個(gè)樣品進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，考察還原劑對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響。

1.2.6 螺旋藻多酚微膠囊的抗氧化性分析

1.2.6.1 DPPH 自由基清除能力分析 參照Ahmad等[20]的方法并略作修改，將4 mL 樣品加入4 mL DPPH 乙醇溶液中并充分混合，將混合物溶液置于黑暗中30 min。在517 nm 處測(cè)量上述溶液的吸光度（At），并使用以下公式計(jì)算樣品的自由基清除活性（%）：

式中：Ab表示4 mL 樣品溶液與4 mL 無水乙醇的吸光度；Ac表示4 mL去離子水和4 mL DPPH 乙醇混合溶液的吸光度；At表示4 mL 樣品溶液與4 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度。

1.2.6.2 鐵離子還原法分析抗氧化能力 參考楊少輝等[21]的研究方法，并略有修改。將0.3 mol/L pH3.6的乙酸緩沖溶液，與20 mmol/L FeCl3（H2O）6，10 mmol/L TPTZ 按照10:1:1（v/v/v）制備成FRAP儲(chǔ)備液。將其混勻后于37 ℃條件下孵育60 min，現(xiàn)用現(xiàn)配。取1 mL 的待測(cè)樣品與15 mL FRAP 儲(chǔ)備液混合，反應(yīng)4 min 后，在593 nm 處測(cè)其吸光值。

1.2.7 體外模擬消化特性測(cè)定 體外模擬消化參考Minekus 等[22]的方法，并略有修改。本研究制備的螺旋藻多酚微膠囊在口腔中停留的時(shí)間短暫，因此本研究中不考慮口腔消化情況。將3 g 微膠囊顆粒加入15 mL 無胃蛋白酶模擬胃液（SGF）中，并置于37 ℃水浴中。將2000 U/mL 胃蛋白酶加入15 mL SGF溶液中，并用5 mol/L HCl 將pH 調(diào)節(jié)至2.0。隨后取15 mL 的胃糜與等體積的人工腸液（SIF）混合，立即用1 mol/L 氫氧化鈉溶液將pH 調(diào)節(jié)至7.0，加入終濃度為100 U/mL 豬胰蛋白酶，6.25 mg/mL 膽汁提取物。混合溶液在37 ℃，150 r/min 的水浴條件下反應(yīng)2 h。各相反應(yīng)結(jié)束后，取10 mL 樣品在4 ℃，10000×g 離心30 min，收集上清中的Phe，上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后，參考Karakashov 等[23]的方法測(cè)定多酚含量。多酚的生物利用度按照公式計(jì)算：

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Origin 8.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖，用SPSS 22.0 進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)和形貌表征

2.1.1 粒徑和多分散性指數(shù) 如圖1 所示，相較于Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 的粒徑明顯減小，這是因?yàn)镻he 在溶液中是以聚集狀態(tài)存在的，這種聚集導(dǎo)致Phe 的粒徑較大，而PS 和（或）Zein 的加入打破了這種聚集狀態(tài)，對(duì)Phe 進(jìn)行了包埋；另一方面，相較于Phe-PS，Phe-PS-Zein 的PDI 降低，表明Phe-PSZein 的分子量分布更均勻[24]。

圖1 Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 的粒徑分布與多分散性指數(shù)Fig.1 Particle size distribution and polydispersity index of Phe,Phe-PS and Phe-PS-Zein

2.1.2 FTIR 表征 Phe，PS 和Phe-PS 的FTIR 光譜如圖2 所示。在多孔淀粉中，波長3428 cm-1左右的寬峰代表OH 的拉伸振動(dòng)，927 和1159 cm-1之間的區(qū)域通常與C=C，C=O 和C=H 的拉伸或彎曲振動(dòng)有關(guān)[25]。光譜在3428 cm-1（苯酚OH 基團(tuán)的拉伸振動(dòng)）、2928 cm-1（脂肪族C-H 基團(tuán)的拉伸振動(dòng)）、1631 cm-1（芳香族C=C 基團(tuán)的拉伸振動(dòng)）、1327、1167、1040 cm-1（C=O 基團(tuán)的對(duì)稱拉伸振動(dòng)）處顯示寬吸收峰[26]；829 和738 cm-1處的吸收峰歸因于芳香環(huán)上C-H 基團(tuán)的彎曲振動(dòng)[27]。

圖2 Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 的FTIR 表征Fig.2 FTIR spectra of Phe,Phe-PS and Phe-PS-Zein

Phe-PS 微膠囊顆粒中也有類似的峰，且峰的范圍很廣，說明螺旋藻多酚被包裹在多孔顆粒中，沒有明顯的相互作用。此前有研究報(bào)道指出，氫鍵是酚類化合物與淀粉基壁材之間的主要相互作用[28]。在本研究中，多酚和淀粉分子中的-OH 基團(tuán)可能在氫鍵的形成中發(fā)揮了重要作用，氫鍵的形成導(dǎo)致了多酚包封后淀粉光譜的變化。此外，在螺旋藻多酚顆粒中還觀察到苯環(huán)的存在，其波數(shù)為848 cm-1。此外，高峰期為1692 cm-1對(duì)應(yīng)于多酚芳香環(huán)的C=C 拉伸，在1631 cm-1處的峰顯示在Phe-PS 復(fù)合物圖譜中。該結(jié)果表明，由于多酚的一個(gè)或兩個(gè)芳香環(huán)進(jìn)入多孔淀粉的螺旋腔，是因?yàn)橄嗷プ饔枚l(fā)生的變化。在姜黃素-β-環(huán)糊精包涵體復(fù)合物中也報(bào)告了類似的現(xiàn)象[29]。在Phe-PS 顆粒中發(fā)現(xiàn)了更寬且不那么尖銳的條帶，再次證實(shí)了螺旋藻多酚被包裹在淀粉納米顆粒中。至于三種物質(zhì)的FTIR 光譜差異，可以歸因于多酚和多孔淀粉的聚合程度。

2.1.3 XPS 表征結(jié)果 為了進(jìn)一步研究各制備樣品的化學(xué)狀態(tài)以及鍵能情況[13]，對(duì)不同負(fù)載量樣品進(jìn)行了高分辨率XPS 光譜分析。圖3 為O 軌道高分辨譜圖，可以看到對(duì)于不同單質(zhì)及復(fù)合物樣品，結(jié)合能位于532.20 eV 的特征峰歸因于樣品中的C-O，位于533.28 eV 峰值主要是材料中羥基（-OH）所引起的衍射峰[30]。而在534.01 eV 的特征峰主要是由于樣品O-C=O 鍵或者表面吸附水所致。Phe，PS 和Zein 中Zein 的C-O 鍵結(jié)合能最低，含量也最高，這與FTIR 結(jié)果一致。Phe 負(fù)載了PS 后結(jié)合能以及含量變化較小，而復(fù)合Zein 后C-O 含量明顯增加，結(jié)合能也降低，表明Zein 與Phe-PS 成功復(fù)合。該結(jié)果與梁宏閃[31]的研究結(jié)論一致。

圖3 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS 和Zein 的XPS 譜圖（O 軌道高分辨譜圖）Fig.3 XPS survey spectra of Phe,Phe-PS and Phe-PS-Zein(O Orbital high-resolution spectra)

2.1.4 XRD 表征結(jié)果 圖4 為Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS 和Zein 納米顆粒的XRD 譜圖。通過Jade 軟件對(duì)測(cè)得的XRD 數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，經(jīng)過尋峰對(duì)準(zhǔn)處理可以發(fā)現(xiàn)，上述五種物質(zhì)在15°～30°之間存在明顯的衍射峰。對(duì)于Phe 而言，在22.9°存在明顯的晶體衍射峰，但與PS 復(fù)合后，衍射峰明顯左移，在20.4°觀察到寬化的衍射峰。根據(jù)Debye-Scherrer公式[32]，衍射峰寬化表明顆粒尺寸有所降低。添加Zein 后，晶體衍射峰強(qiáng)度有所降低，主要與Zein 的無定型結(jié)構(gòu)有關(guān)。此外，從衍射峰尖銳程度來看，添加PS 和Zein 后，復(fù)合物的結(jié)晶度有所降低。通常而言，內(nèi)部結(jié)晶區(qū)晶粒尺寸可通過X-射線衍射峰強(qiáng)度良好展現(xiàn)，若存在越小的晶粒尺寸，則會(huì)形成越低的衍射峰強(qiáng)度[33]。此現(xiàn)象實(shí)質(zhì)上是多糖與蛋白質(zhì)發(fā)生作用而再次排列組合，更大顆粒由此形成。

圖4 Phe，Phe-PS，Phe-PS-Zein，PS 和Zein 的XRD 譜圖Fig.4 XRD patterns of Phe,Phe-PS,Phe-PS-Zein and Zein

2.2 穩(wěn)定性表征

2.2.1 DSC 表征 利用DSC 曲線研究了Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 的熱穩(wěn)定性，從圖5 中可以看出，Phe 的吸熱峰在Phe-PS 和Phe-PS-Zein 中未出現(xiàn)，表明Phe 被很好地包裹在復(fù)合微膠囊顆粒中[34]。此外，雙層壁材包埋微膠囊顆粒的變性溫度升高，這是由于Zein 和（或）PS 與Phe 之間相互作用，使得復(fù)合微膠囊顆粒的熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。之前的研究表明，加入蛋白質(zhì)做壁材后的微膠囊的熱穩(wěn)定性明顯提高，這是由于蛋白質(zhì)增加了生物聚合物顆粒之間的空間位阻[35]。

圖5 Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 的DSC 曲線Fig.5 Differential scanning calorimetry of Phe,Phe-PS and Phe-PS-Zein

2.2.2 螺旋藻多酚微膠囊的儲(chǔ)存穩(wěn)定性 如圖6 所示，4 ℃下儲(chǔ)存21 d 后，Phe-PS-Zein 和Phe-PS 中螺旋藻多酚的保留率分別為80.97%和67.64%，比對(duì)照組的Phe 保留率（47.03%）分別高了33.94%和20.61%。這是因?yàn)镻S 對(duì)Phe 的包埋起到了保護(hù)Phe的作用，而Phe-PS-Zein 內(nèi)部的分子間相互作用更強(qiáng)，形成的結(jié)構(gòu)更緊密，此外，玉米醇溶蛋白由于其分子內(nèi)疏水作用而更易于聚集，多孔淀粉與其相互作用能夠減弱玉米醇溶蛋白的疏水性，并增強(qiáng)微膠囊顆粒之間的靜電和空間排斥，且加入玉米醇溶蛋白增加了分散體系的粘度，使其具有更好的物理穩(wěn)定性，對(duì)Phe 的保護(hù)效果也更好。

圖6 復(fù)合微膠囊在4 ℃條件下儲(chǔ)存21 d 后螺旋藻多酚的保留率Fig.6 Effects of the retention rate of polyphenols from Spirulina stored at 4 °C for 21 days

2.2.3 O2對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響 將Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 一同放在接觸空氣的暗室中，每隔5 d 測(cè)定其Phe 含量并計(jì)算其保留率，結(jié)果如圖7 所示。對(duì)照組的Phe 保留率在避光且與空氣接觸30 d 后下降到47.03%，同等條件下，Phe-PS和Phe-PS-Zein 保留率分別下降到77.64%和80.97%，證明將Phe 微膠囊化，可以有效減少O2對(duì)其降解的影響，且Phe-PS-Zein 提高Phe 穩(wěn)定性的效果更好。另一方面，隨著時(shí)間的延長，對(duì)照組Phe 在空氣中的保留率下降趨勢(shì)越來越大，而復(fù)合壁材包埋的Phe保留率一直平穩(wěn)下降，說明微膠囊化說明復(fù)合微膠囊化對(duì)Phe 有著較好的保護(hù)作用。

圖7 O2 對(duì)復(fù)合微膠囊中螺旋藻多酚保留率的影響Fig.7 Effects of O2 on the retention rate of polyphenols from Spirulina

2.2.4 還原劑（NaHSO3）對(duì)螺旋藻多酚微膠囊穩(wěn)定性的影響 將Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 溶解于不同濃度的NaHSO3溶液中，如圖8 所示，還原劑對(duì)Phe-PS-Zein 的影響最小，隨著NaHSO3濃度的增加，微膠囊多酚保留率下降趨勢(shì)不明顯，維持在90%以上。而Phe-PS 中螺旋藻多酚保留率隨著NaHSO3濃度的增加下降至80%以下，當(dāng)NaHSO3濃度為150 mg/mL時(shí)Phe 的保留率為73.45%，因此，復(fù)合壁材膠囊化后的螺旋藻多酚更加穩(wěn)定，且Phe-PS-Zein 比Phe-PS 對(duì)Phe 的保護(hù)效果更好。

圖8 NaHSO3 對(duì)復(fù)合微膠囊中螺旋藻多酚保留率的影響Fig.8 Effects of NaHSO3 on the retention rate of polyphenols from Spirulina

2.3 抗氧化性測(cè)定

天然多酚具有一定的抗氧化能力[36]，可抑制單線態(tài)氧與自由基的活性，從而保護(hù)人體細(xì)胞和組織免受氧化損傷[37]。如圖9 所示，對(duì)DPPH 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明三者對(duì)自由基的清除率具有顯著性差異（P＜0.05），Phe-PS 和Phe-PS-Zein 清除自由基的活性高于Phe，且Phe-PS-Zein 對(duì)DPPH 自由基的清除能力高于Phe-PS。FRAP實(shí)驗(yàn)也表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)且差異顯著（P＜0.05），這是因?yàn)閆ein 中富含芳香族氨基酸如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸，它們能夠螯合過渡金屬Fe3+，從而起到有效的抗氧化作用，使得Phe-PS-Zein 對(duì)Fe3+表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化保護(hù)能力[38]。

圖9 Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 對(duì)DPPH 自由基清除力和對(duì)Fe3+的還原力Fig.9 DPPH scavenging activity and Ferric-reducing ability of Phe,Phe-PS 和Phe-PS-Zein

2.4 體外模擬消化測(cè)定

Phe 的體外生物利用率取決于溶解在胃腸道中的Phe 濃度[39]。如圖10 所示，消化系統(tǒng)的水基環(huán)境限制了多酚的吸收與利用，SGF 期后，對(duì)照組的Phe釋放量為28.97%±1.89%，而Phe-PS 和Phe-PSZein復(fù)合微膠囊顆粒中多酚的生物利用率分別為20.64%±1.09%和19.43%±0.77%，均低于游離多酚在SGF 期的生物利用率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合微膠囊顆粒能夠控制SGF 階段多酚的釋放，尤其是Phe-PS-Zein，可能是Phe-PS-Zein 微膠囊顆粒表面Zein 和PS 的相互作用能夠有效阻止微膠囊在胃環(huán)境中的降解，進(jìn)而提高Phe 在SIF 期的生物利用率[40]。SIF 期后，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 復(fù)合微膠囊顆粒中Phe 的生物利用率明顯提高，分別為67.89%±1.89%和73.19%±2.04%，這是由于復(fù)合微膠囊顆粒在腸液中的解離和水解作用，促進(jìn)了Phe 的釋放。該結(jié)果也與之前關(guān)于體外消化過程中多酚生物可及性的研究一致[41]。綜上所述，Phe-PS-Zein 在SGF 期降解程度較低，在SIF 期的生物利用度較高。

圖10 Phe，Phe-PS 和Phe-PS-Zein 微膠囊顆粒的體外釋放效果Fig.10 In vitro release profile of Phe,Phe-PS and Phe-PS-Zein

3 結(jié)論

本文制備了基于淀粉相的負(fù)載螺旋藻多酚的Phe-PS 微膠囊顆粒，并對(duì)其進(jìn)行表征和穩(wěn)定性分析。為了探究更穩(wěn)定的螺旋藻多酚遞送體系，利用反溶劑沉淀法制備了負(fù)載多酚的Phe-PS-Zein 微膠囊，通過DLS、FTIR、XRD、XPS、DSC 等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并進(jìn)行了穩(wěn)定性和體外緩釋作用的探究，比較了Phe-PS-Zein 與Phe-PS 兩種復(fù)合微膠囊顆粒的穩(wěn)定性、生物利用率等性能。主要結(jié)論如下：設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)負(fù)載螺旋藻多酚的Phe-PSZein 微膠囊進(jìn)行工藝優(yōu)化，在芯壁比1:10，壁材比1:1，攪拌時(shí)間90 min，溫度60 ℃和pH7 時(shí)有最高包埋率，達(dá)86.93%。比多孔淀粉單層壁材負(fù)載螺旋藻多酚得到的Phe-PS 微膠囊（芯材比1:10，溫度80 ℃，磁力攪拌時(shí)間120 min，達(dá)到最佳包埋率60.29%）包埋效果更好。通過DLS、FTIR、XRD 和XPS 等技術(shù)對(duì)微膠囊結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并與游離的螺旋藻多酚進(jìn)行比較。通過熒光光譜的分析，結(jié)果表明玉米醇溶蛋白-多酚復(fù)合體是在非共價(jià)作用力作用下形成的。XRD 和XPS 的圖譜表明，添加Zein后晶體衍射峰強(qiáng)度有所降低，主要與Zein 的無定型結(jié)構(gòu)有關(guān)。通過對(duì)DSC 分析和對(duì)抗氧化性、穩(wěn)定性以及體外緩釋效果的研究，比較了Phe-PS-Zein 與Phe-PS 兩種微膠囊顆粒對(duì)螺旋藻多酚的保護(hù)效果，結(jié)果表明，Phe-PS-Zein 顆粒可以作為螺旋藻多酚的有效遞送載體。

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